醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)緒論

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)

SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China21分子生物學(xué)的基本概念2分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史3分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系4分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容緒論主要內(nèi)容SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China3分子生物學(xué)（molecularbiology）是以生物分子為靶標(biāo)，在細(xì)胞內(nèi)從分子水平研究生命現(xiàn)象本質(zhì)和生命過(guò)程規(guī)律的一門(mén)交叉學(xué)科。所謂生物分子（biomolecule）是具有生物活性的化學(xué)分子，包括生物大分子和生物小分子。1.分子生物學(xué)的基本概念

生物大分子（Biomacromolecule）主要包括核酸、蛋白質(zhì)、多糖等。生物小分子（Biomicromolecule）分子量小于500Da，包括游離核苷酸、輔基輔酶、寡糖、寡肽、寡核苷酸、類脂、信號(hào)分子以及許多生物大分子的代謝產(chǎn)物等。2.分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史分子生物學(xué)的發(fā)展大致可分為三個(gè)階段：準(zhǔn)備和醞釀階段現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立生命本質(zhì)探索階段2.1準(zhǔn)備和醞釀階段確定了蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA（A.D.Hershey和M.Chase）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識(shí)遺傳信息傳遞中心法則的建立1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型2.2現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展（Kohler和Milstein）

基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究成為新的前沿領(lǐng)域基因組研究的進(jìn)展

重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展（PaulBerg）2.3生命本質(zhì)探索階段新技術(shù)平臺(tái)驅(qū)動(dòng)分子生物學(xué)的發(fā)展SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China9分子生物學(xué)的發(fā)展依賴于技術(shù)與儀器革。

1.20世紀(jì)80年代中期發(fā)明的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)（PCR）第一代PCR定性檢測(cè)技術(shù)第二代PCR-DNA終點(diǎn)定量技術(shù)第三代PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)2.基因組研究快速推進(jìn)主要得益于DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展Sanger法，“人類基因組”計(jì)劃，用了13年時(shí)間才完成草圖繪制，而且成本超過(guò)數(shù)十億美元。

以高通量、高速和低成本為標(biāo)志的第二代測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)單分子測(cè)序技術(shù)即將登場(chǎng)。目標(biāo)是人類基因組測(cè)序費(fèi)用降到1千美元。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China113分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系分子生物學(xué)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)。分子生物學(xué)使醫(yī)學(xué)進(jìn)入分子水平，是未來(lái)的醫(yī)學(xué)的核心內(nèi)容。分子生物學(xué)與精確醫(yī)學(xué)（PrecisionMedicinePM）U.S.PresidentBarackObamaunveileddetailsaboutaboldnewmedicalresearcheffortcalledPrecisionMedicineInitiative（PMI）atbeginingofthisyear,andaskCongressfora215million-U.S.dollarinvestmentinhis2016budgetblueprint.PrecisionMedicineInitiative（PMI）

90年代初，美國(guó)主導(dǎo)的國(guó)際人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject）2003年4月15日，人類基因組序列圖繪制成功。人們對(duì)基因組測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用寄予厚望。研究者也逐漸認(rèn)識(shí)到基因組知識(shí)的局限性；中心法則”直接涉及到的DNA、RNA和蛋白質(zhì)分子水平來(lái)看，基因組核酸序列不過(guò)是生命復(fù)雜性的“冰山一角”

2011年前后，面對(duì)當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟需解決的生理和病理的復(fù)雜性問(wèn)題，“精確醫(yī)學(xué)”正是在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)實(shí)踐所處的這樣一個(gè)重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)上應(yīng)運(yùn)而生。精確醫(yī)學(xué)”，其前提是構(gòu)建基于生物學(xué)大數(shù)據(jù)的生物醫(yī)學(xué)研究知識(shí)網(wǎng)絡(luò)，以及基于分子生物學(xué)的全新疾病分類方法。知識(shí)網(wǎng)絡(luò)：臨床診斷和病理分析等表型信息，還具有各種生物分子信息，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組、脂質(zhì)組和表觀遺傳組等。精確醫(yī)學(xué)概念的形成與實(shí)施

（PrecisionMedicinePM）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China144.分子物生學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容核酸的分子生物學(xué)蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China154.1核酸的分子生物學(xué)核酸的分子生物學(xué)研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能。研究?jī)?nèi)容包括核酸/基因組的結(jié)構(gòu)﹑遺傳信息的復(fù)制﹑轉(zhuǎn)錄與翻譯﹑核酸存儲(chǔ)的信息修復(fù)與突變﹑基因表達(dá)調(diào)控和基因工程技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用等。遺傳信息傳遞的中心法則是其理論體系的核心。

SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China164.2蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。蛋白質(zhì)翻譯及調(diào)控，胞內(nèi)定位分布機(jī)理。蛋白質(zhì)是了解基因功能最重要的途徑。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China174.3細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)主要研究細(xì)胞內(nèi)﹑細(xì)胞間信息傳遞的分子基礎(chǔ)。研究的目標(biāo)是闡明細(xì)胞活動(dòng)的分子機(jī)理，明確每一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與傳遞的途徑及參與該途徑的所有分子的作用和調(diào)節(jié)方式。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理的研究是當(dāng)前分子生物學(xué)發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域之一。課程教學(xué)參考用書(shū)與網(wǎng)上資源網(wǎng)站（頁(yè)）66/ec-webshow/page/courseVideo.do（生物谷生命科學(xué)論壇）分子生物學(xué)專業(yè)信息網(wǎng)書(shū)籍Molecularbiology（GeorgeP，科學(xué)出版社）分子生物學(xué)（第四版）（朱玉賢,高等教育出版社出版）雜志-MolecularandCellularBiology-MolecularCell -CurrentGenetics-Oncogene-Genes&Development -PNAS -RNA-Embo18ActiveLearningCredoWhenIhear,

Iforget.WhenIhearandsee,Irememberalittle.WhenIhear,see,andaskquestions

ordiscusswithsomeoneelse,Ibegintounderstand.WhenIhear,see,discuss,anddo,Iacquireknowledgeandskill.WhenIteachanother,Imaster.BernardWSilverman

第一章基因、基因組和基因組學(xué)

Gene,Genome&Genomics1基因的結(jié)構(gòu)與功能基因(gene)：攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，也稱為遺傳因子?；蚴呛铣捎泄δ艿牡鞍踪|(zhì)或RNA所必需的全部DNA，包括編碼蛋白質(zhì)或RNA的核酸序列，也包括為保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列。1.1基因的分類結(jié)構(gòu)基因（structuralgenes）調(diào)節(jié)基因(regulatorygenes)核糖體RNA基因(ribosomalRNAgenes)與轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因(transferRNAgenes)1.結(jié)構(gòu)基因(structuralgenes)可被轉(zhuǎn)錄形成mRNA，并轉(zhuǎn)譯成多肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，催化各種生化反應(yīng)的酶和激素等。DNA轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA蛋白質(zhì)2.調(diào)節(jié)基因(regulatorygenes)某些可調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因。其突變可影響一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的功能，或?qū)е乱粋€(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)（或酶）量的改變。microRNAs,siRNAs,piRNAs…rRNA基因與tRNA基因(ribosomalRNAgenes&transferRNAgenes)只轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的RNA而不翻譯成多肽鏈種類IIIIII分布核仁核基質(zhì)核基質(zhì)產(chǎn)物rRNAmRNA,microRNA5SrRNA,tRNA,siRNA真核生物的RNA聚合酶(

3種)：RNA聚合酶I,II,III.開(kāi)放閱讀框架(openreadingframe，ORF)：在DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開(kāi)始，到終止密碼為止的一個(gè)連續(xù)編碼序列。1.2基因的結(jié)構(gòu)斷裂基因（splitgene）PromoterExonintronFlanking234561234123561hnRNA的選擇性剪接5

3

3

5

模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向5

3

NC1.3基因的功能傳遞遺傳信息，控制個(gè)體性狀表現(xiàn)?；蚪M(genome)：一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的全部遺傳信息，包括染色體基因組和染色體外基因組。基因組中的DNA包括編碼序列和非編碼序列。部分病毒基因組--RNA。2基因組的結(jié)構(gòu)與功能C值(C-value)：一種生物體單倍體基因組DNA的總量，用以衡量基因組的大小。通常，進(jìn)化程度越高的生物其基因組越大，但從總體上說(shuō)，生物基因組的大小同生物在進(jìn)化上所處地位的高低無(wú)關(guān)。存在C-valueparadox（C值悖理）。生物復(fù)雜性越高，其基因的密度越低。C-valueparadoxequalgenomesizetoadXenopusandhumanbeinghavegenomesofessentiallythesamesize.Butweassumethathumanismorecomplexintermsofgeneticdevelopment!表2-1不同生物體基因組中基因的比較物種基因組大小/Mb大致的基因數(shù)目基因密度/（個(gè)/Mb）原核生物肺炎鏈球菌2.223001060

大腸桿菌4.64400950

根瘤農(nóng)桿菌5.75400960真核生物

真菌

釀酒酵母125800480

粟酒裂殖酵母124900410

原生生物

四膜蟲(chóng)220>20000>90

無(wú)脊椎動(dòng)物

美麗線蟲(chóng)9719000200

果蠅1801370080

東亞飛蝗5000不確定不確定

脊椎動(dòng)物

人類2900270009.3

小鼠25002900012

植物

擬南芥12525500200

水稻430>45000>100

玉米2200>45000>20

郁金香120000不確定不確定2.1病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能PropertyParametersNucleicacid

DNA

RNA

BothDNAandRNA(atdifferentstagesinthelifecycle)Shape

Linear

Circular

SegmentedStrandedness

Single-stranded

Double-stranded

Double-strandedwithregionsofsingle-strandedness病毒基因組的多樣性病毒基因組的大小與細(xì)菌或真核細(xì)胞相比，病毒的基因組很小。不同的病毒之間基因組大小相差很大。乙肝病毒DNA：3kb，編碼4種蛋白質(zhì)；痘病毒的基因組：300kb，編碼幾百種蛋白質(zhì)。病毒基因組的大小通常與其對(duì)宿主的依賴程度有關(guān)，基因組越大，依賴性越小。RNA

病毒基因組編碼序列具有節(jié)段性有些病毒的基因組RNA由不連續(xù)的幾條核酸鏈組成（如流感病毒，輪狀病毒等）。分段基因組的病毒一般感染效率較低；分段基因組容易發(fā)生重組，故病毒容易變異。目前未發(fā)現(xiàn)DNA病毒有此狀況。病毒基因存在基因重疊基因重疊：同一段DNA片段能夠參與編碼兩種甚至兩種以上的蛋白質(zhì)分子。這種現(xiàn)象在其它的生物細(xì)胞中僅見(jiàn)于線粒體和質(zhì)粒DNA。此結(jié)構(gòu)意義在于使較小的基因組能夠攜帶較多的遺傳信息。重疊基因是1977年Sanger在研究ΦX174時(shí)發(fā)現(xiàn)的ΦX174是一種單鏈DNA病毒，宿主為大腸桿菌。感染大腸桿菌后可合成11個(gè)蛋白質(zhì)分子，總分子量約25萬(wàn)，相當(dāng)于6078個(gè)核苷酸所容納的信息量。而ΦX174病毒DNA本身卻只有5375個(gè)核苷酸，最多只能編碼總分子量為20萬(wàn)的蛋白質(zhì)分子?；蛑丿B的方式（1）一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因里面。（2）幾個(gè)基因部分重疊。（3）兩個(gè)基因之間只有一個(gè)堿基重疊。噬菌體ΦX174的重疊基因

重疊基因的DNA序列可能大部分相同，但由于翻譯時(shí)的讀碼框架不同、或起始部位不同而產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。

有些真核病毒的部分序列，對(duì)某一個(gè)基因來(lái)說(shuō)是內(nèi)含子，而對(duì)另一個(gè)基因而言卻是外顯子。病毒基因組的大部分序列具有編碼功能病毒基因組的大部分是用來(lái)編碼蛋白質(zhì)的，只有非常小的一部份沒(méi)有編碼翻譯功能。ΦX174基因組中不編碼的序列只占217/5375乳頭瘤病毒基因組約8.0Kb，其中不編碼的部分約為1.0kb。少數(shù)真核生物病毒的基因組也存在內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。病毒基因組的轉(zhuǎn)錄單元是多順?lè)醋佣囗樂(lè)醋觤RNA

(polycistroniemRNA)

：病毒基因組DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位，形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元。它們可被一起轉(zhuǎn)錄成含有多個(gè)mRNA的分子。噬菌體ΦX174ΦX174基因組中的D-E-J-F-G-H基因轉(zhuǎn)錄在同一個(gè)mRNA中，然后再翻譯成各種蛋白質(zhì)，其中Ｊ、F、G及H編碼外殼蛋白，D蛋白與病毒的裝配有關(guān)，E蛋白負(fù)責(zé)細(xì)菌的裂解，它們?cè)诠δ苌鲜窍嚓P(guān)的。病毒基因組都是單倍體

除了逆轉(zhuǎn)錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個(gè)基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次。逆轉(zhuǎn)錄病毒帶有逆轉(zhuǎn)錄酶，能使RNA反向轉(zhuǎn)錄生成DNA，因此其基因組可擁有兩個(gè)拷貝。噬菌體基因具有連續(xù)性噬菌體的基因是連續(xù)的，而真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的，具有內(nèi)含子。2.2原核生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能原核生物基因組通常比較簡(jiǎn)單，其基因組大小在106bp～107bp之間，所包含的基因數(shù)目幾百個(gè)到數(shù)千個(gè)之間。原核生物基因組通常由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，在細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體的形式，在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)致密的區(qū)域，稱為

類核（nucleoid）.大腸桿菌的類核結(jié)構(gòu)模型大腸桿菌染色體基因組的結(jié)構(gòu)和功能大腸桿菌基因組序列中的基因密度非常高，編碼區(qū)所占的比例較大。大腸桿菌中總共有4288個(gè)基因，平均編碼長(zhǎng)度為950bp，基因之間的間隔區(qū)長(zhǎng)度為118bp，而且這些結(jié)構(gòu)基因沒(méi)有內(nèi)含子。大腸桿菌DNA分子中的重復(fù)序列很少，但在大腸桿菌基因組中不同部位可以有稱為轉(zhuǎn)座子的50kb的重復(fù)片段。轉(zhuǎn)座因子原核生物轉(zhuǎn)座因子主要有二類：插入序列(insertionsequence，IS)復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(compositetransposon,Tn)

只有當(dāng)

IS

轉(zhuǎn)座到某一基因中使該基因失活或插入位點(diǎn)旁邊的染色體發(fā)生畸變等效應(yīng)時(shí)才會(huì)被發(fā)現(xiàn)。IS：2000bp以內(nèi)，兩端都有正向重復(fù)序列（directrepeats，DR）和反向重復(fù)序列（invertedrepeats，IR），中間1kb左右的編碼序列，僅編碼和轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。Tn：2000～20000bp之間，兩端由一對(duì)IS元件組成，帶有與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因以及其他基因。根據(jù)轉(zhuǎn)座的的機(jī)制和結(jié)果，可將轉(zhuǎn)座分為：復(fù)制型轉(zhuǎn)座（replicativetransposition）保守型轉(zhuǎn)座（conservativetransposition）復(fù)制型保守型大腸桿菌染色體外基因組的結(jié)構(gòu)和功能質(zhì)粒（plasmid）：一類染色體外具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。大腸桿菌質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA分子?？梢杂泄矁r(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）、缺口的環(huán)狀DNA、線性DNA三種結(jié)構(gòu)狀態(tài)。質(zhì)粒對(duì)宿主細(xì)胞的生存一般不是必需的，但質(zhì)粒帶有某些特殊的不同于宿主細(xì)胞的遺傳信息，其存在賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。

細(xì)菌質(zhì)粒所控制的一些性狀抗性抗生素抗性氨基糖甙類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類及磺胺類等重金屬抗性汞離子及有機(jī)汞制劑、鎳、鈷、銀、鉻、鉛、銻及鉍等陽(yáng)離子抗性砷酸鹽、亞砷酸鹽、鉻酸鹽及硼酸鹽等其它抗性紫外線，X射線，細(xì)菌素，質(zhì)粒控制的修飾系統(tǒng)等代謝能力簡(jiǎn)單糖類的代謝乳糖、蔗糖及綿籽糖等鹵化物的代謝2，4-二氯甲苯復(fù)雜碳化合物的代謝甲苯、萘、樟腦、苯胺、煙堿及烷烴等蛋白質(zhì)代謝明膠及酪蛋白等其他代謝色素生成，產(chǎn)硫化氫，胞外DNA酶等致病性侵襲力菌毛、夾膜、黏附因子及血漿凝固酶等毒素大腸桿菌腸毒素、破傷風(fēng)桿菌神經(jīng)毒素、炭疽桿菌外毒素及鼠疫菌素等結(jié)合轉(zhuǎn)移性傘毛的合成，表面排斥，致育性抑制，對(duì)信息素的反應(yīng)和抑制等質(zhì)粒能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子（autonomousreplicon）嚴(yán)緊控制（stringentcontrol）型質(zhì)粒：其復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到十幾個(gè)拷貝。松弛控制（relaxedcontrol）型質(zhì)粒：其復(fù)制與宿主不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。質(zhì)粒的穩(wěn)定性與不相容性

質(zhì)粒的不相容性（incompatibility）：兩種不同質(zhì)粒因利用同一復(fù)制和維持機(jī)制，在復(fù)制和隨后向子代細(xì)胞分配的過(guò)程中會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，從而不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，其中一種質(zhì)粒將被丟失。

攜帶不同復(fù)制和維持機(jī)制的質(zhì)粒屬于不同的不相容群，它們可以共存于同一細(xì)胞中。影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的因素：①宿主細(xì)胞分裂時(shí)質(zhì)粒能否均衡地分配到子代細(xì)胞。②質(zhì)粒分子自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2.3真核生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能真核生物的遺傳物質(zhì)絕大部分存在于細(xì)胞核染色體，少部分存在于線粒體或葉綠體中細(xì)胞核基因組和細(xì)胞器基因組。真核生物染色體基因組特點(diǎn)人類基因組中僅含有25000～30000個(gè)基因，遠(yuǎn)低于預(yù)期。在人類基因組中只有很少一部份（約2-3％）DNA序列用以編碼蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)RNA。人類基因組中存在大量基因間隔區(qū)序列，主要由重復(fù)DNA構(gòu)成。在基因內(nèi)部含大量?jī)?nèi)含子。單拷貝序列：占40%-80%，結(jié)構(gòu)基因基本上屬于單拷貝序列。中度重復(fù)序列：重復(fù)次數(shù)10～105，占10-40%。如rRNA、tRNA、組蛋白以及免疫球蛋白的基因等，另有部分可能與基因的調(diào)控有關(guān)。高度重復(fù)序列：拷貝數(shù)大于106

，占10-60%。如反向重復(fù)序列

(invertedrepeats)

和衛(wèi)星DNA

(satelliteDNA)。轉(zhuǎn)錄(RNApolI)45SrRNA前體18SrRNA28SrRNArDNA內(nèi)含子內(nèi)含子28S5.8S18S剪接5.8SrRNA5SrRNArRNA反向重復(fù)序列常見(jiàn)于基因的調(diào)控區(qū)，可能與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)。重復(fù)序列的多態(tài)性DNA多態(tài)性：DNA

序列發(fā)生變異從而導(dǎo)致的個(gè)體間核苷酸序列的差異。

主要包括

單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）和

串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（tandemrepeatspolymorphism）。SNP--由基因組DNA上的單個(gè)堿基的變異引起的DNA序列多態(tài)性。

據(jù)估計(jì)，人類基因組中每1kp就存在一個(gè)SNP位點(diǎn)，共有約300萬(wàn)個(gè)之多，是人群中個(gè)體差異最具代表性的DNA多態(tài)性。

相當(dāng)一部分SNP還直接或間接與個(gè)體的表型差異、對(duì)疾病的易感性或抵抗能力、對(duì)藥物的反應(yīng)性等相關(guān)。

大多數(shù)SNP位點(diǎn)十分穩(wěn)定，人類85%的SNP是共有的。高度重復(fù)序列中的無(wú)間隔反向重復(fù)序列很容易形成限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，也很容易因?yàn)橥蛔儺a(chǎn)生或是失去一個(gè)酶切位點(diǎn)，可以造成

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP).Restricitonmap改變的酶切位點(diǎn)圖譜與檢測(cè)真核基因組存在多基因家族與假基因多基因家族(multigenefamily)：由某一祖先基因經(jīng)過(guò)重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一組基因。假基因(pseudogene)：與某些有功能的基因結(jié)構(gòu)相似，但不能表達(dá)有功能的基因產(chǎn)物的某些基因。

多基因家族大致可分為兩類：一個(gè)基因家族的不同成員成簇地分布在不同染色體上，但核酸序列高度同源，編碼一組功能上緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，如珠蛋白基因家族?；蚣易宄纱氐胤植荚谀骋粭l染色體上，它們可同時(shí)發(fā)揮作用，合成某些蛋白質(zhì)，如組蛋白基因家族就成簇地集中在第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)2帶到3區(qū)6帶區(qū)域內(nèi)，這種分布方式與DNA復(fù)制時(shí)需要大量的組蛋白有關(guān)。

假基因的產(chǎn)生有兩種方式：由突變引起的基因序列變化而失去功能，這樣產(chǎn)生的假基因帶有內(nèi)含子，稱為常規(guī)假基因（conventionalpseudogene）。mRNA經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再插入基因組，由于插入位點(diǎn)不合適或序列發(fā)生變化而導(dǎo)致失去功能。這種類型的假基因不含內(nèi)含子，稱為已加工的假基因（processedpseudogenes）。真核生物細(xì)胞器基因組真核生物有兩類細(xì)胞器能攜帶遺傳物質(zhì)：線粒體和葉綠體。這些遺傳物質(zhì)獨(dú)立于細(xì)胞核基因組外，能夠自行復(fù)制和表達(dá)，又稱為染色體外基因組。線粒體基因組編碼其自身蛋白質(zhì)合成體系的某些成員，如rRNA和tRNA等，以及呼吸鏈中的某些成員，如ATP酶、NADH還原酶、細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體中的某些組分。其它成員由細(xì)胞核基因組編碼。

高等動(dòng)物線粒體基因組具有獨(dú)特的特點(diǎn)：

①母系遺傳。子代線粒體基因組來(lái)自母親，父系的線粒體基因組在精卵結(jié)合時(shí)一般不能進(jìn)入卵細(xì)胞。

②線粒體DNA損傷后不易修復(fù)，突變率較高，可能與衰老及某些疾病有關(guān)。

③遺傳密碼與通用遺傳密碼存在差別，如UGA（終止密碼子）編碼Trp，AGA/AGG（Arg）為終止密碼子等。2.3基因組學(xué)基因組學(xué)（Genomics）：對(duì)生命有機(jī)體全基因組進(jìn)行序列分析和功能研究的學(xué)科。人類基因組計(jì)劃（TheHumanGenomeProject，HGP），1998-2003.結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：目的是在生物體的整體水平上測(cè)定出全部蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與其他生物分子復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)?；蚨ㄎ豢寺。豪梦⑿l(wèi)星和SNP全基因組掃描來(lái)搜索與疾病性狀緊密相關(guān)的位點(diǎn)，從而確定疾病相關(guān)基因的位置并進(jìn)一步獲得克隆。功能基因組學(xué)：根據(jù)已有基因的功能推測(cè)基因組中具有相似結(jié)構(gòu)的基因的功能，通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證。有效的方法有定點(diǎn)突變、基因敲除（knock-out）和RNA干擾及過(guò)量表達(dá)技術(shù)等。蛋白質(zhì)組學(xué)

Proteomics醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)?第三章SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China84

主要內(nèi)容3.1概述3.2蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容和技術(shù)3.3蛋白質(zhì)組學(xué)的研究意義及應(yīng)用蛋白質(zhì)組（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)）1994年由澳大利亞科學(xué)家Wilkins提出，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念，指的是不同細(xì)胞在不同時(shí)相表達(dá)不同的蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)組（原核生物和真核生物）3.1概述對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體整體性、動(dòng)態(tài)性和系統(tǒng)性各國(guó)政府支持，國(guó)際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：1996年澳大利亞建立了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NCI）投資1000萬(wàn)美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。NCI和FDA（美國(guó)食品藥品管理局）共同投資數(shù)百萬(wàn)美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。英國(guó)建立三個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心對(duì)已完成或即將完成全基因組測(cè)序的生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。1997年召開(kāi)了第一次國(guó)際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會(huì)議1998年在美國(guó)舊金山召開(kāi)了第二屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議1999年1月在英國(guó)倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會(huì)議2001年4月在美國(guó)成立了國(guó)際人類蛋白質(zhì)組研究組織（HPO）。我國(guó)也于1998年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì)2003成立了中國(guó)人類蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO），并分別于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召開(kāi)了中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，2004年10月在中國(guó)北京召開(kāi)了第三屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics):指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。細(xì)胞器蛋白質(zhì)組學(xué)：通過(guò)純化細(xì)胞器或用質(zhì)譜儀鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物組成來(lái)確定蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的位置。表達(dá)蛋白組學(xué)：把細(xì)胞、組織中的所有蛋白質(zhì)建立成定量表達(dá)圖譜或掃描EST圖。蛋白質(zhì)組學(xué)包括:SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China903.2蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容和技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本流程蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)Westernblot、免疫組化驗(yàn)證蛋白質(zhì)并確定其定位根據(jù)氨基酸序列合成寡核苷酸探針，克隆基因蛋白質(zhì)功能研究，包括蛋白質(zhì)生物活性、抗體制備、蛋白質(zhì)相互作用等方面蛋白質(zhì)樣品電泳前蛋白質(zhì)樣品的處理雙向電泳分離Westernblot檢測(cè)選擇目標(biāo)蛋白斑點(diǎn)，膠內(nèi)酶切質(zhì)譜分析（MALDI/TOF或ESI/MS/MS）獲得肽質(zhì)量指紋譜或肽序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印到膜上

圖像分析樣品處理蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)鑒定

蛋白質(zhì)組學(xué)研究流程圖3.2.2蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容1蛋白質(zhì)組表達(dá)模式（組成）的研究蛋白質(zhì)組成分鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建、新型蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、同源蛋白質(zhì)比較、蛋白質(zhì)加工和修飾分析。2蛋白質(zhì)組功能模式（作用）的研究基因產(chǎn)物識(shí)別、基因功能鑒定、基因調(diào)控機(jī)制分析。重要生命活動(dòng)的分子機(jī)制（如細(xì)胞周期、分化與發(fā)育、環(huán)境反應(yīng)與調(diào)節(jié)等）。醫(yī)藥靶分子的尋找和分析（包括新藥靶分子、腫瘤分子標(biāo)記、人體病理介導(dǎo)分子等）。3.2.3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)一、雙向凝膠電泳技術(shù)二、液相色譜技術(shù)三、生物質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)鑒定四、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)

一、雙向凝膠電泳技術(shù)

（一）2-DE的概念2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilizedpHgradient，IPG）等電聚焦電泳與第二向SDS組成的分離系統(tǒng)，也稱雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡(jiǎn)稱2-DE。等電聚焦電泳是基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的差異進(jìn)行分離，SDS則是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（Mw）的不同進(jìn)行分離。第一向等電聚焦酸pH梯度低分子量高分子量第二向SDS圖

雙向凝膠電泳示意圖IPG膠條堿1、第一向電泳―IPG等電聚焦電泳

1）等電聚焦電泳的基本原理等電聚焦（IEF）是60年代發(fā)展起來(lái)的一種蛋白質(zhì)分析分離手段，如圖7-3所示，在電場(chǎng)中電泳基質(zhì)形成一個(gè)從正極到負(fù)極不斷增大的pH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向正極移動(dòng)，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向負(fù)極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子運(yùn)動(dòng)到各自的pI處時(shí)，所帶凈電荷變?yōu)榱?，于是停止遷移而留在該位置上。這種不同的蛋白質(zhì)分別聚集在各自的pI處，形成一條狹窄穩(wěn)定的區(qū)帶而彼此分開(kāi)的現(xiàn)象稱為等電點(diǎn)聚焦。＋－1098765432pHpI＝8.0蛋白質(zhì)pI＝4.0蛋白質(zhì)圖

等電聚焦的“聚焦效應(yīng)”+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10第一向：等電聚焦

2）IPG等電聚焦電泳1975年Gasparic和Bjellqvist合成出了用于IPG制備的單體化合物Immobiline，它是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，結(jié)構(gòu)式如圖7-4：CH2=CH-C-N-ROH=（R代表羧基或第三氨基）圖Immobiline分子式將Immobiline摻入聚丙烯酰胺凝膠聚合單體中，當(dāng)凝膠聚合時(shí)，Immobiline通過(guò)－CH＝CH－雙鍵共價(jià)鑲嵌到聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)中。利用一系列弱酸和弱堿性的Immobiline進(jìn)行滴定，在滴定終點(diǎn)附近形成pH梯度并且參與丙烯酰胺凝膠聚合，從而將pH梯度固定化。這種pH梯度是由固定在凝膠基質(zhì)上的羧基和氨基形成的緩沖對(duì)來(lái)維持，不容易變動(dòng)，因此稱為固相pH梯度（IPG）。2、第二向電泳―SDS-PAGE1）SDS的原理在PAGE系統(tǒng)中加入SDS和還原劑后所組成的電泳系統(tǒng)。SDS是一種陰離子去垢劑，疏水端能插入蛋白質(zhì)分子內(nèi)，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵及疏水作用，改變蛋白質(zhì)分子的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)；還原劑則斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，結(jié)構(gòu)變得舒展。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，所帶負(fù)電荷大大超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子間原有電荷的差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再與電荷相關(guān)，而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)的分子量大小。102+–pH3pH7.5pH10chargesize第二向：SDS電泳

Proteinsmigratethroughthegelatarateproportionaltotheirsize.Smallestproteinstravelthefurthestdistance2）SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量進(jìn)行SDS時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率與分子量有如下關(guān)系：lgM=K－Rf（M為蛋白質(zhì)分子量，Rf為蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率，K為常數(shù)）。將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（含有5～6種已知分子量的蛋白質(zhì)）和待測(cè)蛋白在同一塊膠上電泳，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)（lgM）與Rf作圖，得到一條直線，為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算待測(cè)蛋白的Rf，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其分子量。104SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China105雙向電泳的流程樣品制備第一向等電聚焦第二向SDS凝膠上蛋白的檢測(cè)蛋白的軟件的檢測(cè)（二）凝膠上蛋白質(zhì)的檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品經(jīng)2-DE分離后，凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)須用一定的方法使其顯現(xiàn)出來(lái)，讓儀器或人眼檢測(cè)到。1、考馬斯亮藍(lán)染色考馬斯亮藍(lán)染色是最常用的蛋白質(zhì)染色方法?？捡R斯亮藍(lán)R-250化學(xué)名為三苯基甲烷，R代表紅藍(lán)色?？捡R斯亮藍(lán)R-250與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)可逆結(jié)合，染色線性范圍可達(dá)1～55μg，靈敏度為30～100ng蛋白質(zhì)。考馬斯亮藍(lán)染色的最大優(yōu)點(diǎn)是染色重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，不影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定，靈敏度比常用的氨基黑高100倍，但低于銀染色和熒光染色，不能滿足對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)要求，樣品用量大。2、銀染色原理在酸性硝酸銀溶液中蛋白質(zhì)與銀離子發(fā)生作用，然后在堿性pH條件下，銀離子被甲醛還原成銀顆粒沉淀在蛋白質(zhì)上而呈顯棕黑色。銀染色靈敏度很高，是考馬斯亮藍(lán)染色法的100倍，但操作繁瑣，重復(fù)性不如考馬斯亮藍(lán)染色，對(duì)糖蛋白、鈣結(jié)合蛋白的染色效果差。考染和銀染的比較3、熒光染料染色熒光染料染色法是利用結(jié)合于蛋白質(zhì)的熒光染料發(fā)出的熒光來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)。用于蛋白質(zhì)染色的熒光染料很多，有的共價(jià)結(jié)合于蛋白質(zhì)上，有的和蛋白質(zhì)形成非共價(jià)結(jié)合。目前商品化的熒光染料有SYPRORuby,其染色方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高達(dá)1～10ng，染色線性范圍寬，對(duì)糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定，是一種較理想的蛋白質(zhì)染色方法，但價(jià)格較昂貴。

（三）雙向凝膠電泳圖譜的計(jì)算機(jī)分析細(xì)胞或組織樣本經(jīng)2-DE分離后，得到一張含有成百上千個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的凝膠電泳圖譜。凝膠圖譜分析包括確定蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的位置、大小、染色深淺、pI和分子量；圖譜間的比較、差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的確定；圖譜質(zhì)量的優(yōu)化、數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存管理、數(shù)據(jù)庫(kù)分析等內(nèi)容。借助先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物信息學(xué)工具，能客觀、有效地從電泳圖譜中提取到有價(jià)值的信息。1、數(shù)字化雙向凝膠電泳圖譜的獲取獲取數(shù)字化的雙向凝膠電泳圖譜是進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析的前提。圖像掃描儀、數(shù)碼照像系統(tǒng)、激光密度儀等可將凝膠（或轉(zhuǎn)印膜）上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)圖像轉(zhuǎn)化成數(shù)字化的圖像文件，空間分辨率和密度分辨率是衡量圖像數(shù)字化設(shè)備的兩個(gè)主要參數(shù)。

2、圖像加工凝膠電泳圖譜上除了密布深染色的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)外，往往還帶有一定程度的背景染色，降低了圖像的質(zhì)量并干擾低豐度蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)。因此要對(duì)數(shù)字化電泳圖譜作增強(qiáng)對(duì)比度、背景消減等處理，以消除背景染色。同時(shí)，還需對(duì)圖像的大小及方向進(jìn)行調(diào)整，利于圖譜間的比較。

3、蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)圖像分析軟件自動(dòng)進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的識(shí)別，通過(guò)適當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)置，可消除圖譜中的條紋，使蛋白斑點(diǎn)盡可能呈點(diǎn)狀分布，變得更加清晰。自動(dòng)檢測(cè)完成后，仍有一些低豐度蛋白點(diǎn)未被識(shí)別出，還有一些是“假點(diǎn)”，另有一些點(diǎn)因距離過(guò)近被識(shí)別成一個(gè)點(diǎn)，需要手工進(jìn)行添加、刪除和分割。整個(gè)檢測(cè)完成后，分析系統(tǒng)會(huì)給出關(guān)于每個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的編號(hào)、量值、峰值和位置等方面的信息。

4、凝膠匹配（斑點(diǎn)匹配）凝膠匹配是指通過(guò)比較兩塊（或多塊）凝膠圖譜，將圖譜上對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)（代表同一種蛋白質(zhì)）標(biāo)識(shí)出來(lái)，稱為匹配斑點(diǎn)；只在一塊膠上出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)也標(biāo)識(shí)出來(lái)，稱為未匹配斑點(diǎn)，代表可能的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

5、數(shù)據(jù)分析分析軟件根據(jù)凝膠匹配的結(jié)果，對(duì)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行分析，找出不同凝膠圖譜間存在質(zhì)變和量變的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。新開(kāi)發(fā)的分析軟件還能對(duì)凝膠上的蛋白斑點(diǎn)添加注釋、評(píng)語(yǔ)及其它相關(guān)信息等。

6、雙向凝膠圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)雙向凝膠圖譜分析產(chǎn)生成千上萬(wàn)的數(shù)據(jù)信息，必須有一個(gè)好的存儲(chǔ)、調(diào)用和查詢機(jī)制來(lái)進(jìn)行管理?，F(xiàn)行的雙向凝膠電泳圖像分析軟件具有數(shù)據(jù)庫(kù)支持功能，形成圖像－數(shù)據(jù)庫(kù)間查詢鏈接。一個(gè)蛋白質(zhì)在圖譜中標(biāo)示出來(lái)，即可在數(shù)據(jù)庫(kù)中查到其相應(yīng)的描述信息，如該蛋白質(zhì)的名稱、分子量、等電點(diǎn)等；反之，如果蛋白質(zhì)的名稱及其它信息已知，也可在圖譜上顯示斑點(diǎn)位置。隨著互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的發(fā)展，還可通過(guò)因特網(wǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間凝膠圖譜的比較。（四）2-DE的分辨率、重復(fù)性及局限性2-DE系統(tǒng)有很高的分辨率。商品化的IPG膠條以及標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作使得2-DE具有很高的重復(fù)性，可在不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行圖譜的比較，給蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的共享帶來(lái)了極大的方便。目前沒(méi)有一種分離技術(shù)在分辨率上能與雙向凝膠電泳相媲美。2-DE存在的不足和缺陷：首先，2-DE的分辨率仍不能滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要，人類基因組有3～5萬(wàn)個(gè)基因，可能表達(dá)的蛋白質(zhì)達(dá)數(shù)十萬(wàn)種，這對(duì)2-DE技術(shù)的分離能力提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)；其次，2-DE對(duì)極酸、極堿性和疏水性膜蛋白的分離效果不盡人意，對(duì)具有重要功能的低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)也是個(gè)很大的難題；最后，2-DE操作過(guò)程的自動(dòng)化是一個(gè)亟待解決的難點(diǎn)，自動(dòng)化的操作平臺(tái)可減少人為誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，帶來(lái)高通量的分析速度，滿足大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要。（五）雙向凝膠電泳分離前的樣品處理

1、分部提取法用不同的蛋白質(zhì)提取液分部抽提細(xì)胞或組織裂解液，先用水溶液抽提，離心后的上清液中含大部分水溶性蛋白；再用對(duì)膜蛋白具有中等溶解度的提取液抽提沉淀，離心后上清液中含中等疏水性的蛋白質(zhì)，包括膜表面蛋白和膜相關(guān)蛋白；最后用強(qiáng)溶解力的提取液抽提沉淀，得到疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)。

2、亞細(xì)胞成分的分離亞細(xì)胞成分的分離是指分離細(xì)胞中的各種細(xì)胞器和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞骨架、核基質(zhì)、核仁等，用于蛋白質(zhì)組研究。這是近來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一個(gè)分支—亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)，它不但可提高蛋白質(zhì)的檢出效率，還能獲得許多關(guān)于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能方面的重要信息。3、激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）

1996年基因公司發(fā)明了一種稱為激光捕獲顯微切割（LCM）的新技術(shù)，能從臨床病理切片標(biāo)本中切下病變細(xì)胞，獲得純凈的細(xì)胞群。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalUniversityKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,China124二、液相色譜技術(shù)離子交換色譜：靜電結(jié)合反相色譜：疏水作用親和色譜：專一親和力凝膠色譜：分子大小色譜技術(shù)色譜法又稱色譜分析、色譜分析法、層析法，是一種制備分離和分析方法。利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動(dòng)相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。離子交換色譜以離子交換樹(shù)脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動(dòng)相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法。在以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交換色譜基本原理離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)(或功能基團(tuán))和反離子構(gòu)成的，基質(zhì)與電荷基因以共價(jià)鍵連接，電荷基因與反離子以離子鍵結(jié)合。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，假設(shè)以RA+代表陽(yáng)離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽(yáng)離子B+發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：RA++B+

→RB++A+

離子交換色譜離子交換劑對(duì)溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，這種結(jié)合力的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。強(qiáng)酸性(陽(yáng)性)離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力比對(duì)Na+的??；強(qiáng)堿性(陰性)離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力比對(duì)Cl-的小得多；弱酸性離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力遠(yuǎn)比對(duì)Na+的大；弱堿性離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力比對(duì)Cl-的大。反相液相色譜反相液相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)是基于蛋白質(zhì)的疏水性，因此通常采用非極性的烷基固定相作為填料，其表面化學(xué)性質(zhì)和流動(dòng)相的選擇應(yīng)最大限度地滿足疏水的要求。通常在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑（三氟乙酸）來(lái)增大蛋白質(zhì)和多肽的疏水性。親和色譜（Affinitychromatography）利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。親和層析示意圖親和色譜（Affinitychromatography）常用專一而又可逆的親和力的生物分子具有是成對(duì)互配的主要的有：酶和底物、酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。

注意在成對(duì)互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對(duì)樣品溶液中的另一方分子進(jìn)行親和層析，達(dá)到分離純化目的。凝膠過(guò)濾色層分離法基本原理當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過(guò)凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，向下移動(dòng)的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對(duì)分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。分子篩凝膠色譜原理三、生物質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)鑒定（一）質(zhì)譜的基本原理質(zhì)譜分析法（MS）是指在一定條件下，將樣品分子電離成離子，然后通過(guò)測(cè)定這些離子的質(zhì)荷比（m/z）和強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定性和定量的一種分析方法。質(zhì)譜分析法的過(guò)程為：將樣品氣化并電離成帶電離子，然后通過(guò)一定方法將不同m/z的離子分開(kāi)，并測(cè)定其強(qiáng)度，繪出質(zhì)譜圖，對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析可得到關(guān)于樣品分子結(jié)構(gòu)和定量方面的信息。有機(jī)分子受到電子轟擊后，會(huì)斷裂形成不同的多種離子，以離子的為橫座標(biāo)，離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得到的質(zhì)譜圖稱為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，也叫棒圖。10080604020020401008060分子離子峰基峰相對(duì)強(qiáng)度（％）質(zhì)荷比（m/z)質(zhì)譜棒圖

完整的現(xiàn)代質(zhì)譜儀由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)五部分組成，此外還有一個(gè)保持質(zhì)譜儀高真空度的真空系統(tǒng)。離子源和質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀最重要的兩個(gè)部件，也是不同質(zhì)譜儀的主要差別所在。電噴霧質(zhì)譜（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI）為離子源的質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物大分子研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可或缺的分析工具，因此被稱為生物質(zhì)譜（BMS）。

進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測(cè)器數(shù)據(jù)采集及分析真空系統(tǒng)

（二）生物質(zhì)譜電噴霧質(zhì)譜技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是誕生于80年代末期的兩項(xiàng)電離技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性的變革。具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍，使得在pmol的水平上準(zhǔn)確地分析分子量高達(dá)幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)的生物大分子成為可能，并得到迅速的發(fā)展。被稱做是“軟”電離技術(shù)，因?yàn)樵陔x子化過(guò)程中不會(huì)破壞分子結(jié)構(gòu)，能實(shí)現(xiàn)分子量大于10,000質(zhì)量單位的生物大分子的質(zhì)量分析。1、離子源離子源的作用是使樣品分子電離成離子，并把離子加速后引入質(zhì)量分析器。1）MALDI離子源在MALDI離子源中，樣品分子需要一些小分子有機(jī)物的輔助才能離子化，這些小分子物質(zhì)稱為基質(zhì)（matrix）。將樣品與過(guò)量基質(zhì)形成的混合溶液加于樣品靶上，待溶劑揮發(fā)后樣品分子與基質(zhì)形成共結(jié)晶，激光照射樣品，基質(zhì)吸收激光能量后，均勻地傳遞給樣品分子，使樣品分子氣化并離子化。

2）ESI離子源由ESI離子源和相應(yīng)的質(zhì)量檢測(cè)器構(gòu)成的質(zhì)譜儀稱為ESI－MS。ESI是當(dāng)今質(zhì)譜中最軟的電離技術(shù)，其原理是，樣品溶液通過(guò)毛細(xì)管導(dǎo)入離子源，毛細(xì)管終端加有高電壓，樣品溶液在強(qiáng)電場(chǎng)和霧化氣的作用下形成帶電荷的霧滴，隨著溶劑的蒸發(fā)，帶電霧滴不斷變小，電荷密度不斷加大，當(dāng)?shù)竭_(dá)某一臨界點(diǎn)時(shí)產(chǎn)生離子發(fā)射，生成氣態(tài)樣品離子，然后進(jìn)入質(zhì)量分析器測(cè)定m/z。 N2霧化氣4000V樣品溶液大氣壓真空TOF質(zhì)量分析器電噴霧過(guò)程2、質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器的作用是把從離子源出來(lái)、具有不同m/z的離子分開(kāi)，按先后順序到達(dá)檢測(cè)器。質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的主體結(jié)構(gòu)，生物質(zhì)譜中使用的質(zhì)量分析器主要有四極桿質(zhì)量分析器、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器等類型。。四極桿質(zhì)量分析器示意圖電極桿（加有直流電壓和射頻電壓）被檢離子其它離子到檢測(cè)器離子源3、生物質(zhì)譜儀

1）基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）由MALDI離子源和TOF質(zhì)量分析器構(gòu)成的質(zhì)譜儀稱為MALDI-TOF-MS。在MALDI離子源產(chǎn)生的樣品離子先通過(guò)一個(gè)加速電場(chǎng)獲得動(dòng)能，經(jīng)過(guò)一個(gè)真空無(wú)場(chǎng)管的飛行到達(dá)檢測(cè)器，m/z小的離子較早到達(dá)檢測(cè)器，根據(jù)離子在無(wú)場(chǎng)管中的飛行時(shí)間，計(jì)算出m/z。MALDI產(chǎn)生的是單正電荷離子，一個(gè)質(zhì)譜峰代表一種分子離子，從質(zhì)譜峰的位置可直接讀出待測(cè)物的分子量。2）ESI-MS由ESI離子源和相應(yīng)的質(zhì)量檢測(cè)器構(gòu)成的質(zhì)譜儀稱為ESI－MS。ESI離子源最常與四極桿質(zhì)量分析器聯(lián)用。3）串聯(lián)質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜由離子源、多個(gè)質(zhì)量分析器及碰撞室組成，對(duì)樣品離子及其碎片進(jìn)行連續(xù)分析，提供關(guān)于離子結(jié)構(gòu)方面的信息。下圖為串聯(lián)質(zhì)譜示意圖。離子源四極桿質(zhì)量過(guò)濾器碰撞室四極桿質(zhì)量分析器離子檢測(cè)器串聯(lián)質(zhì)譜示意圖4）質(zhì)譜儀的主要性能指標(biāo)分辨率（R）分辨率是指質(zhì)譜儀將不同值的離子分辨開(kāi)的能力。靈敏度靈敏度指質(zhì)譜儀可檢測(cè)到的最小樣品量，由于儀器本身具有噪音信號(hào)，如果樣品量低于一定限度，則樣品信號(hào)與噪音信號(hào)相混淆，難以區(qū)別。質(zhì)量測(cè)定范圍指質(zhì)譜儀能夠測(cè)定的樣品質(zhì)量范圍，是研究生物大分子的重要的性能指標(biāo)之一，現(xiàn)代生物質(zhì)譜儀檢測(cè)的蛋白質(zhì)分子量可達(dá)幾十萬(wàn)道爾頓。（三）蛋白質(zhì)的鑒定蛋白質(zhì)樣本經(jīng)2-DE分離后，需對(duì)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定，以確定其身份。利用獲得的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的各種屬性參數(shù)，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，尋找與這些參數(shù)相符合的蛋白質(zhì)。如果在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋不到，可能為新蛋白質(zhì)，需用其它方法進(jìn)一步鑒定和研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究需要有高通量的蛋白質(zhì)鑒定方法，MS技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地獲得多種蛋白質(zhì)屬性參數(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)工具，可迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。因此，MS已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可或缺的有力工具。下面介紹兩種應(yīng)用MS技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的方法。1、肽質(zhì)量指紋圖譜法基本過(guò)程為：蛋白質(zhì)混合物樣品經(jīng)過(guò)2-DE分離后，從膠上切下需要鑒定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，用胰蛋白酶進(jìn)行水解，胰蛋白酶在特定位點(diǎn)切割蛋白質(zhì)，形成長(zhǎng)短不一的多肽混合物，用MALDI-TOF質(zhì)譜儀對(duì)多肽混合物進(jìn)行質(zhì)量分析，得到肽片段質(zhì)譜圖，一個(gè)質(zhì)譜峰代表一種肽片段離子。由于各種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，胰酶水解后產(chǎn)生的肽片段數(shù)目及質(zhì)量均不相同，具有特征性，因此將得到的肽片段質(zhì)譜圖稱為PMF。下圖為卵白蛋白PMF：2、肽序列標(biāo)簽鑒定法

蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，在蛋白質(zhì)上隨意選取一個(gè)四肽序列，根據(jù)概率論計(jì)算，另一個(gè)蛋白質(zhì)上出現(xiàn)相同四肽序列的概率為1/204，即1/160,000，因此從理論上說(shuō)，只要測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)中5~6個(gè)氨基酸殘基的序列，就足以作為鑒別蛋白質(zhì)的特異性標(biāo)簽，稱為肽序列標(biāo)簽。MALDI-TOF（四）蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白組序列數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、管理的主要形式是實(shí)現(xiàn)已知蛋白質(zhì)的分析鑒定與未知蛋白的發(fā)現(xiàn)前提,也是總結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的規(guī)律,實(shí)現(xiàn)模擬與預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)

瑞士的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)瑞士的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)

由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）和歐洲生