GB/T 40974-2021 核酸樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)方法（正式版）

ICS07.080GB/T40974—2021核酸樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)方法國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)GB/T40974—2021 I 4.1.1DNA濃度 4.1.2DNA純度 4 4 54.2.1RNA濃度 54.2.2RNA純度 5 5參考文獻(xiàn) 7IGB/T40974—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)生物樣本標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC559)提出并歸口。1GB/T40974—2021核酸樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)方法本文件不適用于小分子核酸樣本的質(zhì)量評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義3.1核苷酸nucleotide3.2由核苷酸或脫氧核苷酸通過(guò)3',5'-磷酸二酯鍵連接而成的一類(lèi)生物大分子。具有非常重要的生物3.3帶有遺傳信息的生物大分子。由四種主要的脫氧核苷酸(脫氧單磷酸腺嘌呤dAMP、脫氧單磷酸鳥(niǎo)嘌呤dGMP、脫氧單磷酸胞嘧啶dCMP和脫氧單磷酸胸腺嘧啶dTMP)通過(guò)3',5'-磷酸二酯鍵連接而3.4核糖核酸ribonucleicacid;RNA核酸的一類(lèi)。由核苷酸通過(guò)3',5'-磷酸二酯鍵連接而注：不同種類(lèi)的RNA鏈長(zhǎng)不同，行使各式各樣的生物功能，如與蛋白質(zhì)生物合成有關(guān)的RNA有信使RNA(mes-sengerRNA,mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transferRNA,tRNA)和核糖體RNA(ribosomeRNA,rRNA);與轉(zhuǎn)錄后加工有關(guān)的RNA有核小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)、核仁小RNA(smallnucleolarRNAs,snoRNAs);與生物調(diào)控有關(guān)的RNA有微RNA(microRNAs,miRNA)、干擾小RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等。3.5質(zhì)粒plasmid細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。2核酸純度nucleicacidpurity注1:雜質(zhì)含量越少純度越高。注2:簡(jiǎn)稱純度。注2:簡(jiǎn)稱完整性。S分之間遷移速度而實(shí)現(xiàn)分離的一類(lèi)液相分離技術(shù)。DNA完整值DNAintegritynumber;DIN值為1~10,數(shù)值越大表明DNA完整性越好。DQS值為0～5,數(shù)值越大表明DNA完整性越好。RNA完整值RNAintegritynum3GB/T40974—20214質(zhì)量評(píng)價(jià)方法4.1.1DNA濃度4.1.1.1分光光度法DNA在260nm有最大的吸收峰，按式(1)計(jì)算DNA濃度：C=OD?60×n×C?！?1)式中：CDNA濃度，單位為納克每微升(ng/μL);OD?60——在波長(zhǎng)260nm處DNA的吸光度；n——DNA溶液的稀釋倍數(shù)；C?——OD值為1對(duì)應(yīng)的DNA濃度。雙鏈DNA對(duì)應(yīng)的C。為50ng/μL,單鏈DNA對(duì)應(yīng)的C。為33ng/μL,寡核苷酸對(duì)應(yīng)的C。為20ng/μL～30ng/pL。樣品不純或超出分光光度計(jì)的量程范圍時(shí)不宜使用分光光度法進(jìn)行濃度測(cè)定。4.1.1.2熒光染料檢測(cè)法一般用標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(ng/mL)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度作回歸曲線，將樣本溶液的熒光強(qiáng)度代入回歸方程，計(jì)算出樣本的濃度。對(duì)于微量和低濃度樣本，宜采用熒光染料檢測(cè)法，此方法受其他雜質(zhì)的影響較小。4.1.1.3熒光定量PCR法絕對(duì)定量分析：起始濃度(Log)與Ct值呈線性關(guān)系，通過(guò)已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可以作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣本的Ct值，可計(jì)算出樣本中的濃度。相對(duì)定量分析(2-△△Ct法):即通過(guò)計(jì)算測(cè)試樣本目的基因相對(duì)于對(duì)照樣本目的基因表達(dá)量的相對(duì)變化，達(dá)到相對(duì)定量分析的目的。其中，△△Ct值按式(2)計(jì)算：△△Ct=(Ct?—Ct?)—(Ct?o—Ct??)……………(2)式中：測(cè)試樣品與對(duì)照樣品的差異倍數(shù)；Ct?——測(cè)試樣品的目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)；Ct?——測(cè)試樣品的內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)；Ct??——對(duì)照樣品的目的基因PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)；Ct??——對(duì)照樣品的內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。4GB/T40974—20214.1.1.4數(shù)字PCR法采用微滴發(fā)生器將含有核酸分子反應(yīng)體系形成成千上萬(wàn)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待測(cè)DNA靶分子，或含一個(gè)至數(shù)個(gè)待測(cè)DNA靶分子，且每個(gè)微滴都作為一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)器。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，采用微滴分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1,沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為0。根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的比例，通過(guò)分析軟件可計(jì)算出待測(cè)靶DNA分子的濃度。4.1.2DNA純度純雙鏈DNAOD260/OD280比值應(yīng)為1.8。低于1.6可能有蛋白和酚污染。高于1.9可能有RNA污染。純雙鏈DNAOD260/OD230比值應(yīng)在2.0～2.2,若OD260/OD230比值低于2.0,可能有鹽離子等雜質(zhì)的殘留。4.1.2.2瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法；瓊脂糖凝膠具有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將之置于電場(chǎng)中，帶有負(fù)電荷的核酸分子就會(huì)向正電極遷移。泳道口中如果存在較亮的條帶，說(shuō)明含有蛋白污染，宜在提取過(guò)程中增加去蛋白的步驟，去除多余蛋白等雜質(zhì)。電泳條帶最前面如果有較小的條帶，說(shuō)明存在RNA污染，宜在提取過(guò)程中加入適當(dāng)濃度的RNA酶進(jìn)行消化處理。4.1.3DNA完整性條帶位置為滯后于標(biāo)記(Marker)的最大的條帶。質(zhì)粒DNA存在三個(gè)構(gòu)型，共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋構(gòu)型，開(kāi)環(huán)DNA構(gòu)型和線性DNA構(gòu)型，這三種構(gòu)型分子電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)椋撼菪?、線性和開(kāi)環(huán)。超螺旋比例越高，質(zhì)粒DNA完整性越好。自動(dòng)化凝膠電泳可提供DNA完整值參數(shù)，用于評(píng)價(jià)從高度完整的DNA(DIN值為10)到嚴(yán)重降解的DNA(DIN值為1)的各種樣品。毛細(xì)管凝膠電泳分析方法可提供DNA片段峰分布分析如下：a)質(zhì)量好的DNA,目標(biāo)主峰銳利起峰，目標(biāo)主峰前無(wú)彌散片段；b)部分降解的DNA,目標(biāo)主峰前有少量彌散片段(目標(biāo)主峰依然明顯);c)嚴(yán)重降解的DNA,目標(biāo)主峰不明顯(無(wú)目標(biāo)主峰),有大量彌散片段。微流控分析是在精細(xì)加工的微流控芯片上進(jìn)行電泳分離樣品，檢測(cè)激光激發(fā)的熒光信號(hào)，由分析軟件生成可視化電泳圖和凝膠樣圖像，對(duì)DNA、RNA及蛋白樣本進(jìn)行大小測(cè)定、定量分析與質(zhì)量評(píng)價(jià)。微流控分析法可測(cè)量從高度完整的DNA(DQS值為5)到嚴(yán)重降解的DNA(DQS值為0)的各種5GB/T40974—2021樣品。4.2RNA樣本4.2.1RNA濃度用標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得在波長(zhǎng)260nm處，RNA的吸光度為1(即OD??0為1),則樣品中RNA濃度為44ng/μL。n——RNA溶液的稀釋倍數(shù)；C?——OD值為1對(duì)應(yīng)的RNA濃度。一般用標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(ng/mL)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度作直線回歸，將樣本溶液的熒光強(qiáng)度代入回歸RNA溶液的OD260/OD280比值在1.9～2.1,說(shuō)明純度較好。OD260/OD280值<1.8,說(shuō)明蛋白質(zhì)污染較多；OD260/OD280值>2.2,說(shuō)明RNA已經(jīng)降解，且可能有異硫氰酸殘存。4.2.2.2瓊脂糖凝膠電泳法如在4kb～5kb甚至再高分子量處出現(xiàn)條帶，說(shuō)明有明顯DNA殘留。4.2.3RNA完整性核糖體RNA(rRNA)占總RNA的80%～85%,在凝膠上可以清晰地看到28S和18SrRNA。完整的RNA,電泳條帶顯示28S(2kb左右):18S(1kb左右)約為2:1。如果出現(xiàn)條帶變小或明顯的拖尾甚至彌散，說(shuō)明RNA有降解。自動(dòng)化凝膠電泳可以提供RNA完整值參數(shù)，用于評(píng)價(jià)從高度完整的RNA(RIN°值為10)到嚴(yán)重降解的RNA(RINC值為1)的各種樣品。6GB/T40974—2021依據(jù)RIS值可對(duì)RNA的完整性進(jìn)行評(píng)分，RIS值越高，代表RNA的完整性越好。的80%～85%)。RNA28S:18S比值約為2:1,二者的峰面積較大，電泳條帶清晰且寬，說(shuō)明RNA完RIN值可作為RNA研究領(lǐng)域內(nèi)質(zhì)量評(píng)估的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，用于總RNA、mRNA和小RNA的完整性分析?？蓹z測(cè)從高度完整的RNA(RIN值或RQS值為10)到嚴(yán)重降解的RNA(RIN值或RQS值為1)GB/T40974—2021[1]鄭嵐，周?chē)?guó)平，陳凌燕，等.血液核酸擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制方法探討[J].中國(guó)輸血雜志，2012(S1-482).[2]張佳年，計(jì)駿，劉炳亞，等.深低溫凍存胃癌樣本的核酸與蛋白質(zhì)質(zhì)量控制研究[J].中國(guó)腫瘤臨床，2016(1期):27-34.[3]陳保文，沈小兵，都偉欣，等.結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑生產(chǎn)質(zhì)量控制與臨床研究概述[J].中國(guó)防癆雜志，2012(02):53-54.[4]李蓮，田彩霞，廖冬梅，等.臨床實(shí)驗(yàn)室核酸擴(kuò)增分析前的質(zhì)量控制[J].西部醫(yī)學(xué)，2011(4):786-786.[5]何成濤，馬貴明，趙靜.血站核酸檢測(cè)工作的質(zhì)量控制[J].臨床血液學(xué)雜志(輸血與檢驗(yàn)),2015(2