T-SBZYC 01-2021 地理標(biāo)志產(chǎn)品 施秉太子參 組織培養(yǎng)與脫毒種苗擴繁技術(shù)規(guī)程

CCS65.020.20T/SBZYC施秉縣牛大場鎮(zhèn)中藥材協(xié)會發(fā)布IT/SBZYC01-2021前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4組織培養(yǎng) 5馴化 36擴繁 4T/SBZYC01-2021本文件按照GB/T1.1-2020《文件化工作導(dǎo)則第1部分文件的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草；請注意：本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本文件由施秉縣牛大場鎮(zhèn)中藥材協(xié)會提出歸口；本文件由本文件由黔東南州農(nóng)業(yè)科學(xué)院、施秉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、施秉縣中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心、貴州三泓藥業(yè)股份有限公司、貴州省黔康生態(tài)科技農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司、貴州徽貴藥業(yè)有限公司起草；本文件主要起草人：陳建祥、左群、陳秀德、舒禮華、蔣永英、蔣祥勇、王燕。1T/SBZYC01-2021地理標(biāo)志產(chǎn)品施秉太子參組織培養(yǎng)與脫毒種苗擴繁技術(shù)規(guī)程本規(guī)程規(guī)定了地理標(biāo)志產(chǎn)品施秉太子參組織培養(yǎng)技術(shù)術(shù)語和定義，組織培養(yǎng)、馴化、擴繁。本規(guī)程適用于地理標(biāo)志產(chǎn)品施秉太子參脫毒組培苗生產(chǎn)、擴繁。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB437硫酸銅（農(nóng)用）。GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。GB19489實驗室生物安全通用要求。GB/T317白砂糖GB/T603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備。GB/T628化學(xué)試劑硼酸。GB/T647化學(xué)試劑硝酸鉀。GB/T659化學(xué)試劑硝酸銨。GB/T664化學(xué)試劑七水合硫酸亞鐵（硫酸亞鐵）。GB/T666化學(xué)試劑七水合硫酸鋅（硫酸鋅）。GB/T671化學(xué)試劑硫酸鎂。GB/T1272化學(xué)試劑碘化鉀。GB/T1274化學(xué)試劑磷酸二氫鉀。GB/T1401化學(xué)試劑乙二胺四乙酸二鈉。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。GB/T15899化學(xué)試劑一水合硫酸錳（硫酸錳）。GB/T22278良好實驗室規(guī)范原則。T/SBZYC02地理標(biāo)志產(chǎn)品施秉太子參種植技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1脫毒組培苗選用優(yōu)良太子參植株莖尖、莖段作為外植體，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)再生出來的脫毒試管苗。4組織培養(yǎng)2T/SBZYC01-20214.1組培室要求符合GB19489和GB/T22278規(guī)定。4.2培養(yǎng)基選擇GB/T1272、GB/T1274、GB/T1401、GB/T15899的規(guī)定。4.3培養(yǎng)基制備4.3.1母液配制和保存將培養(yǎng)基配方擴大若干倍，一般為10倍~100倍的濃縮液體。藥品配制嚴(yán)格按照GB/T603規(guī)定方法配制，用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定要求。稱取藥品的藥匙必須專藥專用。將配制好的母液分別貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)和日期，貯存在2℃~4℃的冰箱中，貯藏時間控制在90d內(nèi)。儲藏期間，如有霉菌和沉淀產(chǎn)生，需重新配置。4.3.2植物生長調(diào)節(jié)劑母液配制和保存將各種植物生長調(diào)節(jié)劑單獨配成濃度為50mg/100mL~100mg/100mL。多數(shù)植物生長調(diào)節(jié)劑難溶于水，其溶解方法：NAA、IBA、IAA等常用少量95%的乙醇溶解，然后加熱溶解，再加蒸餾水定容。6-BA、KT等先用少量1mol/L鹽酸溶解，再加蒸餾水定容。所用水要符合GB/T6682的要求。配制好植物生長調(diào)節(jié)劑分別貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽寫上名稱、配制濃度和日期，貯存在2℃~4℃的冰箱中，貯藏時間控制在90d內(nèi)。儲藏期間，如有霉菌和沉淀產(chǎn)生，需重新配置。4.3.3培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基由MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、水組成，蔗糖和水分別符合GB317和GB5749規(guī)定。所需蔗糖濃度3g/L，瓊脂粉濃度4g/L。培養(yǎng)基配制流程，見圖1。劑分液節(jié)糖脂劑調(diào)水母長蔗瓊生培養(yǎng)容器加熱溶解洗滌調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHEQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up13(分),裝)播種凝固高壓滅菌封口圖1太子參培養(yǎng)基的配制流程圖4.3.3.1誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BA0～1.0+NAA0～0.1，按照培養(yǎng)基配制程序配制。4.3.3.2繼代增殖培養(yǎng)基為:MS+6-BA0.5～1.5+NAA0.01～0.1，按照培養(yǎng)基配制程序配制。4.3.3.3壯苗及生根培養(yǎng)基為:MS+6-BA0+NAA0，按照培養(yǎng)基配制程序配制。4.3.4pH值調(diào)節(jié)太子參培養(yǎng)基最佳pH值控制在5.6~5.8，一般用pH計或pH試紙測試，常用（1mol/L）NaOH或HCl進行調(diào)整。4.3.5培養(yǎng)基分裝和滅菌3T/SBZYC01-2021將配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝，分裝量以占培養(yǎng)容器的1/4～1/3為宜。操作時，盡量避免將培養(yǎng)基粘到容器口和容器壁上，否則容易引起污染。將已分裝好培養(yǎng)基封口并注明配制日期和培養(yǎng)基種類后即進行滅菌，滅菌鍋內(nèi)壓力為0.105MPa、溫度達(dá)121℃狀態(tài)下保持15min～20min進行滅菌。4.4環(huán)境滅菌對環(huán)境進行定期滅菌。方法是用75%乙醇或0.1%新吉爾滅進行噴灑。對無菌操作室（接種室）、培養(yǎng)室和準(zhǔn)備室采用紫外燈滅菌方法。接種所用的超凈工作臺在空氣過濾滅菌的基礎(chǔ)上再配合使用紫外燈照射滅菌20min~30min，再用75%乙醇對超凈工作臺表面進行擦拭。4.5接種工具滅菌接種用的工具、無菌水等必須在滅菌鍋內(nèi)壓力為0.105MPa、溫度達(dá)121℃狀態(tài)下保持15~20min進行滅菌。4.6外植體選擇與處理4.6.1選擇生長健壯、無病蟲害的優(yōu)良太子參植株為外植體材料。將太子參的莖尖、莖段用5%~10%洗衣粉漂洗2min~3min，洗去莖尖、莖段上的蠟質(zhì)層及泥土、粉塵，用自來水沖洗30min后拿到接種室，用75%酒精表面消毒20s，無菌水沖洗2次；再用0.1%Hg消毒3min~8min，無菌水沖洗8次~10次，以除去殘留消毒液。4.7外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)將處理好的太子參外植體，在無菌條件下，用解剖刀和解剖針在顯微鏡下剝離0.5mm~1mm的莖尖，切取莖段（每段留一個節(jié)分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。莖尖、莖段應(yīng)插入培養(yǎng)基，芽不能陷入培養(yǎng)基中。接種后做好標(biāo)記。經(jīng)7d~10d培養(yǎng)，芽開始萌動生長，30d后芽長到1cm~2cm，同時有少量叢芽分化。4.8繼代增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的不定芽轉(zhuǎn)接于繼代增殖培養(yǎng)基中，經(jīng)30d培養(yǎng)，形成叢生芽，并有少量根系分化。4.9脫毒檢驗獲得的叢生芽須經(jīng)有資質(zhì)的檢驗單位檢測，確認(rèn)無毒后，進入壯苗及生根培養(yǎng)。4.10壯苗及生根培養(yǎng)將叢生芽轉(zhuǎn)接到壯苗及生根培養(yǎng)基中，經(jīng)30d左右，形成完整的試管苗，并有根系的分化。4.11培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25±2℃,光照時間12h/d，光照強度2000LX~3000LX。太子參組織培養(yǎng)技術(shù)流程見圖2。5馴化5.1大棚與基質(zhì)消毒移栽前，用0.02%~0.04%高錳酸鉀和0.1%~0.5%甲醛對大棚進行熏蒸消毒。用0.04%高錳酸鉀溶液對基質(zhì)消毒滅菌。5.2煉苗4→←→←T/SBZYC01-2021試管苗移栽前，將生長健壯、根5條~6條，長0.cm5~1.0cm，帶3葉~4葉的試管苗連同培養(yǎng)瓶放置移栽大棚2d~3d，然后打開瓶口再放置2d~3d，使試管苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境。5.3脫毒苗移栽將馴化后的脫毒苗用鑷子小心取出，洗去根部培養(yǎng)基，用500倍多菌靈或甲基托布津浸泡30min，用自來水沖洗干凈后，定植于已滅菌的基質(zhì)（珍珠巖:腐殖土=1:2）中。移栽后用遮陽率75%~90%的遮陽網(wǎng)搭小拱棚遮陽，待苗生長5d~7d后拆除。優(yōu)良單株↓塊根芽頭或種子 ↓ 微莖尖 病毒檢測↓脫毒苗↓增殖培養(yǎng)→→生根培養(yǎng)煉苗栽培↓商品種←←2-3代繁殖原原種圖2太子參組織培養(yǎng)技術(shù)流程5.4脫毒苗管理及種參收獲5.4.1脫毒苗移栽后要注意保濕，基質(zhì)內(nèi)含水量保持在50%~60%。移栽一周后，每周噴施1/2MS營養(yǎng)液1次~2次，定期用500倍多菌靈或甲基拖布津噴灑殺菌劑