應(yīng)用指南 - 利用CTS AAV-MAX生產(chǎn)系統(tǒng)在DynaDrive一次性生物反應(yīng)器中生產(chǎn)1000L規(guī)模的AAV

應(yīng)用說明|CTSAAV-MAX系統(tǒng)和DynaDr隨著臨床和商業(yè)階段腺相關(guān)病毒（AAV先前的研究已經(jīng)證明了Gibco?CTS?AAV-MAX無輔助AAV生產(chǎn)系統(tǒng)在Thermo?作為該項(xiàng)研究的進(jìn)一步延續(xù)，本研究介紹了如何在5000LDynaDriveS.U.B.中將相同的工藝放大到1000L工作體積的商業(yè)生產(chǎn)規(guī)模，以及如何在此規(guī)模下成功實(shí)現(xiàn)這些工Theworldleaderinservingscience材料和方法CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0培養(yǎng)物在整個(gè)種子培養(yǎng)和生物反應(yīng)器中，將Gibco?CTS?病毒生產(chǎn)細(xì)?積為10L，3天后將其擴(kuò)增到50L的全工作體積。當(dāng)6胞/毫升（VC/mL）用于生產(chǎn)運(yùn)行。為了制備轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)CTSVPC2.0在接種后24小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)至目標(biāo)密度至少3.0×106 過程中，對照培養(yǎng)物在搖瓶中生長。測定生長動(dòng)力學(xué)、代謝參數(shù)和病毒基因組滴度，并與相應(yīng)的生物反應(yīng)器數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。66CTSAAV-MAXCTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0CTS病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基2（BPC）生物反應(yīng)器中培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)染表3列出了轉(zhuǎn)染900L培養(yǎng)液所需試劑的建議用量。轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA絡(luò)合前，所有試劑均在4-8℃下保存。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒?BPC（放置桶中）中，溫度為4-8℃。另外，?CTS?通過腳輪左右移動(dòng)Productainer菌焊接到5000L生物反應(yīng)器上，在室溫下進(jìn)行孵育，無需進(jìn)一步攪拌。孵育20分鐘后，使用無菌Levitronix?一次性泵以約11L/min的速度將溶液輸送到生物反應(yīng)器中。在9分鐘內(nèi)將復(fù)增強(qiáng)劑的BPC無菌焊接到生物反應(yīng)器上，并將增強(qiáng)劑加入到系待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物體積Viral-Plex絡(luò)合緩沖液為方便下游分析，在收獲當(dāng)天，即轉(zhuǎn)染后約72小時(shí)，從生物反???以消化任何非衣殼化核酸，然后啟動(dòng)攪拌，并在37℃溫度下孵育2小時(shí)，不通氣。然后從反應(yīng)器中取樣進(jìn)行病毒滴度分析。轉(zhuǎn)染效率、病毒基因組滴度和感染性滴度的量化熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)和總細(xì)胞計(jì)數(shù)來定量轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后測在收獲前和收獲時(shí)的不同時(shí)間點(diǎn)取樣并冷凍于-80℃下，使用靶向GFP基因序列的引物和探針，通過液滴數(shù)字PCR（ddPCR）以去除非衣殼化DNA。核酸酶處理后，使用每個(gè)樣本的連續(xù)稀通過轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080細(xì)胞來測定病毒感染性滴度。將HT1080細(xì)胞與離心后裂解液上清的連續(xù)稀釋液在37℃下培養(yǎng)過夜，對感染滴度進(jìn)行定量。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP。通過總衣殼ELISA和ddPCR對完整衣殼的百分比進(jìn)行定量。ddPCR滴度總衣殼總衣殼每天采集樣本以評估細(xì)胞的生長速率和健康狀況。從生物反應(yīng)器中取出約15mL并棄去，以沖洗取樣管路。然后采集新的2022、營養(yǎng)和代謝物水平。使和細(xì)胞活力與對照搖瓶獲得的細(xì)胞密度和細(xì)胞活力相當(dāng)（圖1）。在整個(gè)生產(chǎn)過程中，生物反應(yīng)器和對照搖瓶產(chǎn)生的葡萄糖、乳酸鹽和氨水平相當(dāng)活細(xì)胞密度(×10cells/mL）9876543210–1–0.500.511.522.5310090807060504030200細(xì)胞活力（%）工藝時(shí)間（天）對照搖瓶的平均VCD5000LDynaDriveS.U.B.的VCD 對照搖瓶的平均細(xì)胞活力5000LDynaDriveS.U.B.的細(xì)胞活力葡萄糖濃度（g/L）4.54.03.53.02.52.00.50.0葡萄糖濃度（g/L）4.54.03.53.02.52.00.50.0–1–0.500.511.522.53工藝時(shí)間（天）對照搖瓶的平均值5,000LDynaDriveS.U.B.圖2.125mL搖瓶和5000LDynaDriveS.U.B.在1000L工作體積下生產(chǎn)AAV6-GFP時(shí)，CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0的葡萄糖濃度曲線乳酸鹽濃度（g/L）0.20.033工藝時(shí)間（天）對照搖瓶的平均值5,000LDy圖3.125mL搖瓶和5000LDynaDriveS.U.B.在1000L工作體積下生產(chǎn)AAV6-GFP時(shí)，CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0的乳酸鹽濃度曲線對照搖瓶的平均值5,000LDynaDriveS.U.B.圖4.125mL搖瓶和5000LDynaDriveS.U.B.在1000L工作AAV6-GFP時(shí)，CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0的氨濃度曲線瓶的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)。圖6和圖7中的基因組滴度和感染性滴度結(jié)果反映出了這一點(diǎn)。生產(chǎn)運(yùn)行和平均對照搖瓶的完整衣殼百分比也相當(dāng)（圖8）。903005,000LDynaDriveS.U.B.率05,000LDynaDriveS.U.B.生產(chǎn)AAV6-GFP時(shí)，CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.感染性滴度（TU/mL）05,000LDynaDriveS.U.B.對照搖瓶的平均值生產(chǎn)AAV6-GFP時(shí)，CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.09080完整衣殼（%）完整衣殼（%）60504030205,000LDynaDriveS.U.B.對照搖瓶的平均值生產(chǎn)AAV6-GFP時(shí)，CTS病毒容器、耗材和操作空間，從而降低了種子細(xì)胞生產(chǎn)流程的復(fù)雜性。它還可通過減少連接數(shù)量和轉(zhuǎn)移損失，來提高種子培養(yǎng)本身的效率。測試的氣流和攪拌速率能實(shí)現(xiàn)充分的O2傳質(zhì)，從而維持所需的DO設(shè)定值，而不會(huì)對細(xì)胞造成剪切損傷或產(chǎn)生過多泡沫。可擴(kuò)展性，可滿足基因治療研究人員當(dāng)前和未來的需求。1000L工作體積一次性生物反應(yīng)器的操作規(guī)程及種子細(xì)1.亞培養(yǎng)和擴(kuò)增CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0(VPC2.0)，直至其密度達(dá)到4x106至6x106個(gè)活細(xì)胞/毫升（VC/mL），結(jié)合培養(yǎng)體積，細(xì)胞總數(shù)達(dá)到3x109至6x109，接種到50LDynaDriveS.U.B.或ThermoScienti?c?HyPerforma?5:1S.U.B.，工作體積為10L。這將產(chǎn)生0.3x106或0.6x106VC/mL的起始密度，具體取決于進(jìn)行4天還是3天傳代。注：在轉(zhuǎn)染前，解凍細(xì)胞至少復(fù)蘇3代。HyPerforma5:1S.U.B.：a.接種前兩天，將BPC裝載到硬件中，并夾緊未使用的所b.向S.U.B.注入培養(yǎng)基之前，可根據(jù)需要用N2或空氣吹掃BPC。則需要準(zhǔn)備可高溫高壓滅菌電極，通過滅菌套管對電極進(jìn)行高壓滅菌，并在添加培養(yǎng)基前將其插入S.U.B.。d.接種前一天，在S.U.B中加入8LCTS病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基e.開啟S.U.B的攪拌功能，加熱至37°C，同時(shí)向系統(tǒng)中注入N2。預(yù)熱反應(yīng)器且DO讀數(shù)穩(wěn)定后，開始校準(zhǔn)DOf.校準(zhǔn)DO電極后，打開運(yùn)行級聯(lián)回路以平衡系統(tǒng)，并抽取離線樣品以檢查pH校準(zhǔn)。如果使用一次性pH電極，則將校準(zhǔn)信息輸入控制器，然后根據(jù)需要執(zhí)行單點(diǎn)偏移3.當(dāng)搖瓶中細(xì)胞密度達(dá)到4x106至6x106VC/mL時(shí)，對步驟1中準(zhǔn)備的DynaDriveS.U.B.或HyPerforma5:1S.U.B.進(jìn)行接種，加入CTSVPC2.0，使最終密度為0.3x106或0.6x106VC/mL（分別用于4天或3天傳代最終工作體積為10L，得到N-3培養(yǎng)物。N-3反應(yīng)器的設(shè)定值見表4。表4.50LS.U.B.中N-3培養(yǎng)物的建議設(shè)定值LHyPerforma5:1DynaDriveS.U.B.中S.U.B.中37°C±0.537°C±0.54.28in.4.37in.40%（用0-0.25slpm空氣和0-1slpmO2控40%（用0-1slpmO2控pHCO2控制）CO2控制）4.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4×106至6×106VC/mL時(shí)，向培養(yǎng)物中加入新鮮的CTSVPM，使工作體積達(dá)到50L，使4天或3天傳代的細(xì)胞密度分別達(dá)到0.3×106VC/mL或0.6×106VC/mL。這將是N-2培養(yǎng)。按表5調(diào)整反應(yīng)器的設(shè)定值。表5.50LS.U.B.中N-2培養(yǎng)物的建議設(shè)定值LHyPerforma5:1DynaDriveS.U.B.中S.U.B.中37°C±0.537°C±0.550L50L4.28in.4.37in.40%（用0-0.25slpm空氣和0-1slpmO2控制）40%（用0-1.5slpmO2pHCO2控制）CO2控制）7/aavmax/dynadrive5.在接種N-1和N培養(yǎng)物之前，按以下步驟準(zhǔn)備3000L或a.接種前兩天，將BPC裝載到硬件中，并夾緊未使用的所b.向S.U.B.注入培養(yǎng)基之前，可根據(jù)需要用N2或空氣吹掃BPC。則需要準(zhǔn)備可高溫高壓滅菌電極，通過滅菌套管對電極進(jìn)行高壓滅菌，，并在添加培養(yǎng)基前將其插入S.U.B.。d.接種前一天，在S.U.B中加入250LCTe.開啟S.U.B的攪拌功能，加熱至37°C，同時(shí)向系統(tǒng)中2。預(yù)熱反應(yīng)器且DO讀數(shù)穩(wěn)定后，開始校準(zhǔn)DOf.校準(zhǔn)DO電極后，打開運(yùn)行級聯(lián)回路以平衡系統(tǒng)，并抽則將校準(zhǔn)信息輸入控制器，然后根據(jù)需要執(zhí)行單點(diǎn)偏移S.U.B.進(jìn)行接種，加入CTSVPC2.0，使最終密度為0.3x），注：本種子細(xì)胞擴(kuò)增方案（步驟1-6）只是一擴(kuò)增到大規(guī)模生物反應(yīng)器中的示例，可根據(jù)您的工藝進(jìn)行必