配子與胚胎生物工程課件

配子與胚胎生物工程Chapter8BiotechnologiesofGametesandEmbryos第四節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)Section４TransgenicAnimal第五節(jié)性別控制技術(shù)Section５

Sexcontrol第六節(jié)胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)技術(shù)Section６

Embryonicstemcellstechnique第七節(jié)哺乳動物嵌合體的生產(chǎn)Section７

Chimera第一節(jié)胚胎移植技術(shù)

Embryotransfer（ET）一、概述二、胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)與基本原則三、ET的技術(shù)程序四、ET的實際效果和影響妊娠率的因素五、ET存在的主要問題六、ET的發(fā)展前景 一、概述

（一）概念

胚胎移植（embryotransfer，ET）：又稱受精卵移植，是將體內(nèi)、或體外生產(chǎn)的哺乳動物早期胚胎移植到同種的生理狀態(tài)相同的雌性動物生殖道內(nèi)，使之繼續(xù)妊娠發(fā)育為新個體的技術(shù)，也稱借腹懷胎。提供胚胎的個體——供體（donor）接受胚胎的個體——受體（recipient）第一節(jié)胚胎移植技術(shù)

Embryotransfer

為了使供體♀多排卵，通常采用超排（superovulation）；

國外將常規(guī)的胚胎移植稱為超數(shù)排卵胚胎移植或稱為多排卵胚胎移植（multipleovulationandembryotransfer，MOET）；

目前，用體外生產(chǎn)胚胎（invitroproduction,IVP）技術(shù)或克?。╟loning）技術(shù)等方法也可以生產(chǎn)胚胎，擴(kuò)大了優(yōu)質(zhì)胚胎的來源，降低了ET的成本。牛胚胎移植技術(shù)路線示意圖（二）發(fā)展歷史

1890年劍橋大學(xué)WalterHeape從一頭純種安哥拉母兔取出2個4細(xì)胞胚胎，移植到一頭純種比利時母兔輸卵管上端(用同種公兔交配后3h),結(jié)果生出了4只比利時種仔兔和2只純種安哥拉仔兔。

這一結(jié)果說明早期發(fā)育的胚胎更換到另一個體的輸卵管(或子宮角)內(nèi)，如果胚胎的發(fā)育階段和所處的環(huán)境條件相適應(yīng)，它完全可以繼續(xù)正常發(fā)育，并成長為一個新個體。國外胚胎移植技術(shù)的發(fā)展歷史作者及年代事例動物Heape,1890Nicholas,1933Warwick,1949Kvansnickii,1951Willett,1951Marden

和Chang,1952Whittingham,1972國際胚胎移植學(xué)會成立,1975Steptoe，1978Newcomb和Elsden，1979首次胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎移植成功首次胚胎洲際運輸(保存在100C)經(jīng)長期冷凍,胚胎移植并產(chǎn)仔胚胎移植成功使用卡蘇輸精器兔大鼠綿羊和山羊豬牛兔牛人牛我國胚胎移植技術(shù)的發(fā)展歷史動物事例動物陳玉琦,1973中科院遺傳所,1974中科院遺傳所,1976譚麗玲,郭志勤等,1976中科院遺傳所,1979王建辰等,1980王運京等,1980中國農(nóng)科院畜牧所,1980張涌等,1987譚麗玲,馬世援等,1989郭志勤等,1989胚胎移植成功胚胎移植成功胚胎低溫保存(100C)產(chǎn)仔胚胎低溫保存(100C)產(chǎn)犢-1960C保存胚胎產(chǎn)仔胚胎移植成功非手術(shù)法胚胎移植成功-1960C保存胚胎產(chǎn)羔胚胎分割移植成功鮮胚分割移植成功凍胚分割移植成功兔綿羊兔綿羊兔奶山羊奶牛綿羊奶山羊奶牛奶牛（三）胚胎移植在畜牧生產(chǎn)上的意義1、充分發(fā)揮優(yōu)良種母畜繁殖潛力，提高種母畜繁殖效率；2、簡化良種引進(jìn)方法，代替種畜引進(jìn)；3、保存品種資源，建立基因庫；4、加速品種改良，擴(kuò)大良種畜群（MOET育種方案）；5、利于防疫；６、作為研究手段。二、胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)與基本原則（一）生理學(xué)基礎(chǔ)（二）胚胎移植遵循的基本原則（三）開展胚胎移植的條件（一）胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)

1、母畜發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育：母畜發(fā)情后數(shù)日甚至10余日內(nèi)，生殖系統(tǒng)的變化相同，即在相同的時期，生理狀態(tài)一致，子宮內(nèi)的環(huán)境相同。(在黃體存在的情況下)2、早期胚胎的游離狀態(tài)：在胚胎附植前，胚胎與子宮尚未建立起組織聯(lián)系。

3、胚胎移植不存在免疫問題：由于胎盤屏障的保護(hù)和妊娠時母體免疫機(jī)能發(fā)生的變化，胚胎可以在受體母畜子宮內(nèi)存活，正常發(fā)育至分娩。

4、胚胎的遺傳特性不受受體母畜的影響：胚胎的遺傳特性和性別在母畜體內(nèi)受精時就已經(jīng)決定了，受體母畜只是給移入的胚胎提供了一個孕育的環(huán)境，胚胎的遺傳特性不受受體母畜的影響。

（二）胚胎移植遵循的基本原則1、胚胎移植前后所處環(huán)境的同一性：指胚胎移植后的生活環(huán)境和胚胎的發(fā)育階段相適應(yīng)：（1）供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性；（2）供體和受體生理上的一致性，即發(fā)情時間的同期性（２４小時內(nèi)）；（3）動物解剖部位上的一致性，即胚胎移植前后于生殖道內(nèi)的位置要相同。

2、胚胎發(fā)育期限：胚胎的采集和移植時間不能遲于周期黃體的壽命，更不能遲于開始附植時，一般在周期黃體開始退化前幾天，在供體發(fā)情配種后3~8d內(nèi)收集胚胎，受體也在相同時間接受ET。

3、胚胎的質(zhì)量：在胚胎收集和移植的全部操作過程中，胚胎不能受到任何不良因素（物理、化學(xué)、病原）的影響而危及生命力，經(jīng)鑒定確認(rèn)發(fā)育正常的胚胎才能移植。建立足夠的妊娠信號。４、經(jīng)濟(jì)效益或科學(xué)價值（三）開展胚胎移植的條件1、實驗室條件:溫度恒定、空氣潔凈、布局合理；2、技術(shù)條件：包括人員的技術(shù)水平及所需的設(shè)備；3、胚胎來源：從良種母畜獲得大量胚胎。三、胚胎移植的技術(shù)程序（一）供體和受體母畜的選擇（二）供體、受體母畜的同期發(fā)情（三）供體母畜的超排（四）供體母畜的配種（五）胚胎的收集（六）胚胎的檢查和保存（七）胚胎的移植三、胚胎移植的技術(shù)程序（一）供體和受體母畜的選擇

1、供體母畜

不僅應(yīng)具備優(yōu)良的遺傳品質(zhì)，而且其生殖機(jī)能還需要處于較高的水平。牛、豬產(chǎn)后兩個月以上才能作為供體。

2、受體母畜

雖不要求具有優(yōu)良的遺傳品質(zhì)，但應(yīng)該具有良好的繁殖性能和健康體態(tài)，體型中等以上。供體與受體的發(fā)情時間應(yīng)該相同，前后差異不超過1d。必要是時對供、受體進(jìn)行同期發(fā)情處理。三、胚胎移植的技術(shù)程序（二）同期發(fā)情1、同期發(fā)情的定義定義（Synchronizationofestrus）：是對具有正常發(fā)情周期的群體母畜采取措施，使之在一定時期內(nèi)發(fā)情并排卵的技術(shù)。亦稱發(fā)情同期化（Estrussynchronization）。實質(zhì)：是利用某些激素制劑人為地控制并調(diào)整一群母畜發(fā)情周期的進(jìn)程，使之在預(yù)定的時間內(nèi)集中發(fā)情和排卵，以便有計劃地合理地組織配種或進(jìn)行其他工作。

2、同期發(fā)情的原理：

黃體期占整個發(fā)情周期的大部分長度，也就是說，隨機(jī)的一群♀，大多數(shù)處于黃體期。黃體分泌P抑制卵泡發(fā)育成熟和母畜發(fā)情。要想使母畜發(fā)情，則必須控制P的濃度，即控制黃體的“消”，“長”——即是控制♀發(fā)情的關(guān)鍵。消：縮短黃體期

PG處理長：

“人為延長黃體期”

P處理

卵泡的發(fā)育是在黃體退化，P分泌下降后開始的，因此可以通過使用一定的激素，縮短黃體期或“人為延長黃體期”，然后使卵泡于同一時間開始發(fā)育，最終使母畜于同一時期發(fā)情。通過縮短和延長黃體期進(jìn)行同期發(fā)情縮短黃體期（PGF2α）延長黃體期（孕激素）正常發(fā)情周期正常黃體期和卵泡期3、牛的同期發(fā)情

1）、孕激素埋植物埋植法國外：普遍采用的是將3~6mg甲基炔諾酮（norgestomet）與硅橡膠混合后凝固成為直徑

3~4mm，長15~20mm的棒狀。（見后圖）國內(nèi)：用18甲基炔諾酮20~40mg與等量或半量磺胺結(jié)晶粉混合，一道研磨成細(xì)微粉末，填入內(nèi)徑約2.5mm、長25~30mm的管壁上燙有小孔的塑料管中，稱為藥物埋植管。（見后圖）P法孕激素埋植工具與埋植方法示意圖埋植Ｐ藥棒2）、孕激素陰道栓法目前廣泛使用的陰道栓有兩種類型。一種為鏍旋狀，稱為PRID（progesteronereleasingintravaginaldevice）。另一種為發(fā)泡硅橡膠制的棒狀Y型，稱為CIDR（intravaginaldevice,CHHPlasticMouldingCo.,Hamilton,NewZealand）。孕激素陰道栓處理的時間多是9~12d，取出時手扯吊在母畜外陰部的繩索即可取出陰栓，結(jié)束處理。孕激素處理結(jié)后，大多數(shù)母畜可在第2－4d內(nèi)發(fā)情。陰道栓圖陰道栓實圖PRIDCIDR實圖放置陰道栓a、PG一次肌肉注射法

PG肌肉注射是最簡便的同期發(fā)情方法。

PGF2α的用量為20~30mg（以25mg最常用），氯前列烯醇為400~800μg,要根據(jù)牛和水牛的個體大小而定。b、PG二次肌肉注射法

因PG不能影響牛和水牛排卵后5d以內(nèi)的黃體的壽命。一次處理可能僅有約70%的母牛有反應(yīng)，因此發(fā)展了間隔11~12d的兩次用藥的方法。c、PG子宮注入法

因肌注時經(jīng)全身循環(huán)達(dá)到卵巢時已大多被降解，而子宮內(nèi)給藥時PG可經(jīng)過子宮靜脈-卵巢動脈局部循環(huán)達(dá)到卵巢而不被降解，因此用量可減少且效果好。d、P+PG處理

先用P處理7-9d，結(jié)束處理前一日或結(jié)束時給予PG。前列腺素(PG)法3、（三）供體母畜的超排

Superovulation

1、概念及原理定義：在母畜發(fā)情周期的適當(dāng)時間，注射外源促性腺激素，使卵巢中比在自然情況下有較多有卵泡發(fā)育并排卵。

超排一般在進(jìn)行胚胎移植研究或胚胎的生產(chǎn)工作中，為了充分發(fā)揮胚胎移植的實際作用，降低單個胚胎生產(chǎn)成本而進(jìn)行，一般也僅用于牛和羊等單胎動物。排卵數(shù)介于10~15個最為理想。（三）供體母畜的超排

Superovulation

2、超數(shù)排卵方法（超排）

通過注射體外激素，使卵巢同時有較多的（幾個—幾十個）的卵母細(xì)胞發(fā)育，并都達(dá)到成熟的過程。超數(shù)排卵的程序供體牛

（選發(fā)情后9-13天間）

注射激素促卵泡素(FSH，分4-5天，早晚各注射一次）發(fā)情

輸精

經(jīng)7天后使用沖卵管由子宮內(nèi)將早期胚胎沖出0天9天10天11天12天13天14天20天發(fā)情FSHFSHFSHFSH發(fā)情輸精沖胚（PG）牛卵巢卵泡波-2Wave牛卵巢卵泡波

-3Wave2、超數(shù)排卵方法（超排）Day0 AM–埋植CIDR -注射5mg17β雌激素

和100mg孕酮Day4 AM–開始FSH處理PM-FSHDay5 AM–FSHPM-FSHDay6 AM–FSH，PGF PM–FSH，RemoveCIDRDay7AM–FSHPM-FSHDay8 PM–輸精（AI）Day9 AM–輸精（AI）Day15 -收集胚胎（Embryocollection）

1210864LHProgestogenandestradiol-17

~4.daysWaveemergenceBoetal.,1994Folliculardiameter(mm)Days卵泡波的同期化處理FSH3、提高超數(shù)排卵效果的措施1）選擇合適的畜群和個體2）采取規(guī)范的飼養(yǎng)和管理3）采用優(yōu)質(zhì)藥品和科學(xué)方案（四）供體母畜的配種

選擇適當(dāng)?shù)臅r間，使用優(yōu)良種公畜的精液對供體母畜進(jìn)行輸精。

為了得到較多的發(fā)育正常的胚胎，使用密度大、活率高的精液輸精，并且將輸精次數(shù)增加到2-3次，間隔8-10h。（五）胚胎的收集是利用沖冼液將胚胎從生殖道內(nèi)沖出，并收集在器皿中。胚胎的收集分手術(shù)法和非手術(shù)法，前者適用于各種家畜或動物，后者僅用于牛、馬等大動物，且只能在胚胎進(jìn)入子宮角中才能進(jìn)行。

胚胎收集的時間：一般在配種后3~8d，發(fā)育至4~8細(xì)胞期后；牛胚胎最好在發(fā)育至桑椹胚晚期或胚泡早期進(jìn)行收集和移植。胚胎沖洗液

Embryoflushingsolution

一般多用杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）布林特氏液合成輸卵管液惠屯氏液海姆氏

TCM199培養(yǎng)液

一般在其中都加上1~5%犢牛血清（FCS）

或

0.3~1%牛血清白蛋白（BSA）（五）胚胎的收集（續(xù)）

1、手術(shù)法收集胚胎（各種家畜和實驗動物）（1）在腹部中線處作一切口，然后將子宮角和卵巢一起拉出，檢查排卵點或血紅體數(shù)量。（2）沖冼胚胎：向子宮注入沖冼液并在輸卵管接?。ㄅ！⒀蚝屯玫龋?，或從輸卵管注入沖冼液再從子宮角處接?。ㄘi、馬等）。

手術(shù)沖胚法：從子宮向輸卵管傘方向沖洗手術(shù)沖胚法：從輸卵管傘向子宮方向沖洗手術(shù)沖胚法：從子宮角子宮體沖洗2、非手術(shù)法收集胚胎（大家畜）（1）牛的非手術(shù)收集胚胎可利用三路式導(dǎo)管沖卵器。外管前端連接以氣囊，當(dāng)將沖卵器插入子宮內(nèi)時，充氣使氣囊脹大，堵住子宮頸內(nèi)口以免沖洗液經(jīng)子宮頸流出。將沖洗液通過內(nèi)管注入子宮角內(nèi)，然后由另一導(dǎo)管導(dǎo)出沖洗液。（2）每側(cè)子宮角需沖洗100-150ml。沖洗液的導(dǎo)出應(yīng)順暢，并盡可能回收全部注入的容量。（五）胚胎的收集（續(xù)）母牛非手術(shù)沖卵示意圖SiliconCatheter（六）胚胎的檢查

收集到的沖冼液，需靜置10min，使胚胎下沉到容器底部，然后移去上清液，再放于解剖鏡下檢查胚胎的數(shù)量和發(fā)育情況，再將發(fā)育正常的胚胎收集到注射器或移植管內(nèi)供移植用。

胚胎的檢查項目：

1、受精卵整體的形態(tài)和體積大?。?/p>

2、透明帶形狀，厚度及損傷程度；

3、發(fā)育正常胚胎的卵裂球應(yīng)該具有整齊的外形，大小一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚齡一致；

4、卵細(xì)胞表面顆粒的狀態(tài)和多少等。檢卵胚胎質(zhì)量分級評定標(biāo)準(zhǔn)

1（Ａ）級：優(yōu)秀。胚胎細(xì)胞團(tuán)呈均勻?qū)ΨQ的球形，單個卵裂球（或細(xì)胞）的大小、顏色、密度一致，胚胎的發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育階段一致。不規(guī)則的細(xì)胞相對較少。至少有85%的細(xì)胞物質(zhì)是完整的、具有活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。這些判斷是以在卵周隙中突出細(xì)胞與正常胚胎細(xì)胞的百分比為基礎(chǔ)的。透明帶必須是光滑的而不應(yīng)是凹陷的或平坦的，否則會使胚胎黏附于培養(yǎng)皿或細(xì)管上。

2（Ｂ）級：良好。胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個細(xì)胞的顏色和密度存在一定的不規(guī)則。至少有50%的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好的、具活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。

3（Ｃ）級：質(zhì)差。胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個細(xì)胞的顏色和密度存在嚴(yán)重的不規(guī)則。至少有25%的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好的、具有活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。

4（Ｄ）級：死亡或退化。退化的胚胎、卵母細(xì)胞或1細(xì)胞胚胎，沒有活力。

（七）、胚胎的保存1、異種活體保存2、常溫保存3、低溫保存4、超低溫保存1）、常規(guī)的慢速冷凍盡管低溫生物學(xué)有了許多發(fā)展，但新的胚胎冷凍方法卻很少用于生產(chǎn)實踐。目前，大多數(shù)的哺乳動物胚胎采用傳統(tǒng)的慢速冷凍方法冷凍保存，使用滲透較快的低溫保護(hù)劑，緩慢的冷卻速度和比較快的解凍速度。傳統(tǒng)的慢速冷凍方法分為以下幾步：1）室溫下胚胎置于小分子量可滲低溫保護(hù)溶液中（如乙二醇、甘油、二甲基亞楓或丙二醇），且在胚胎和冷凍保護(hù)液之間達(dá)到平衡；2）一般在-5℃～-7℃植冰；3）可控的、緩慢降溫（0.33～1.0℃／分）；4）降溫到-30℃或-70℃時，投入液氮中保存；5）快速解凍；6）在培養(yǎng)或移植前，在室溫下除去低溫保護(hù)劑，為保持細(xì)胞的正常生理功能。每一步冷凍方法都是至關(guān)重要的。4、超低溫保存胚胎裝管圖2）、玻璃化冷凍玻璃化冷凍定義為在冷凍液處于完全玻璃化狀態(tài)下冷凍保存細(xì)胞，組織或器官（Rall，1985）。為在一定冷凍速度下形成玻璃化（直接投入液氮，-2500℃/分）。需要使用高濃度的可滲低溫保護(hù)劑，然而，濃度過高會對細(xì)胞有毒害作用。從理論上講，如果要以-1500℃/分的速率進(jìn)行降溫，那么，1.5M的任何低溫保護(hù)劑都可以形成玻璃化，但這需要昂貴而復(fù)雜的儀器。近幾年，人們通過減少冷凍液的體積和冷凍液與冷凍和解凍直接接觸的方法來提高冷凍和解凍速度，從而最大限度的減少冷凍液對胚胎的損害，其中OPS法（Vajta，1998a；1998b）和cryoloop（Arav，1997；Martino，1996；Papis，2000）法獲得較好的效果。

3）、胚胎的解凍a、常規(guī)冷凍法的解凍方法b、玻璃化冷凍的解凍方法（八）胚胎的移植：手術(shù)和非手術(shù)法

1、手術(shù)法移植（各種家畜和實驗動物）

在受體腹部作一切口，找到排卵一側(cè)的卵巢并觀察黃體發(fā)育情況，然后用注射器或移植管將含有胚胎的培養(yǎng)液或沖冼液注入到子宮角內(nèi)或輸卵管內(nèi)。山羊胚胎移植2、牛胚胎非手術(shù)移植示意圖

1、受體牛在發(fā)情后6—8天之間均可進(jìn)行移植（發(fā)情之時定為0小時）。移植前對受體牛進(jìn)行直腸觸摸，檢查黃體是否合格。合格者用于移植。

2、

在移植之前必須先進(jìn)行尾椎硬膜外麻醉，擦拭外陰部。

3、對照供體牛采胚記錄表和合格受體的發(fā)情記錄，合理地搭配受體和胚胎。

4、解凍胚胎。

5、重新將胚胎裝入0.25ml塑料細(xì)管（直接解凍移植法不需要重新裝管）。

6、細(xì)管裝入移植槍。

7、把裝有細(xì)管的移植槍套上硬外套，用塑料環(huán)卡緊，再套上軟外套。

8、將胚胎移植到受體黃體側(cè)的子宮角大彎處。

9、做好受體移植記錄。

牛非手術(shù)法胚胎移植操作步驟

1、在移植后70—90天對受體牛進(jìn)行妊娠檢查，對已妊娠的受體要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，避免應(yīng)激反應(yīng)。

2、妊娠受體在產(chǎn)前3個月要補(bǔ)充足量的維生素、微量元素，適當(dāng)限制能量攝入，既要保證胎兒的正常發(fā)育，又要避免難產(chǎn)。

3、妊娠的受體牛的飼養(yǎng)管理四、ET的實際效果和影響妊娠率的因素（一）、ET的實際效果1、胚胎來源1）排卵率2）回收率3）受精率2、胚胎冷凍和胚胎分割的應(yīng)用（二）、影響妊娠率的因素

1、胚胎因素2、母體因素3、其他因素五、ET存在的主要問題

1、胚胎來源有限

2、缺乏熟練的技術(shù)人員

3、胚胎冷凍技術(shù)不完善

4、費用高、要求高

5、手術(shù)法容易出現(xiàn)粘連的問題六、胚胎移植的發(fā)展前景（以牛、羊為例）1、牛胚胎移植技術(shù)應(yīng)用前景

因為牛的經(jīng)濟(jì)價值高、單胎、繁殖周期長、常年發(fā)情，所以采用胚胎移植技術(shù)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶牛、肉牛，正適于當(dāng)今國內(nèi)奶牛、肉牛生產(chǎn)旺盛需求，其更具廣闊發(fā)展空間和持續(xù)發(fā)展前景。

2、羊胚胎移植技術(shù)應(yīng)用前景

相比之下，羊的經(jīng)濟(jì)價值不及牛，繁殖率較牛高，繁殖周期較牛短，且移植術(shù)目前僅限于手術(shù)法，供體可利用次數(shù)少等因素制約。但從近期發(fā)展態(tài)勢看，又強(qiáng)于牛，其主要原因是：優(yōu)質(zhì)羊價位高，公母羊都有一個良好市場。

20世紀(jì)60年代初至20世紀(jì)80年代中期，人們以家兔、小鼠和大鼠等為實驗材料，進(jìn)行了大量基礎(chǔ)研究，在精子獲能機(jī)理和獲能方法方面取得很大進(jìn)展。精子由最初在同種或異種雌性生殖道孵育獲能，發(fā)展到用子宮液、卵泡液、子宮內(nèi)膜提取液或血清等在體外培養(yǎng)獲能，最后用化學(xué)成分明確的溶液培養(yǎng)獲能。同時，通過射出精子和附睪精子獲能效果的比較研究，人們發(fā)現(xiàn)射出精液中含有去能因子，并認(rèn)識到獲能的實質(zhì)是去除精子表面的去能因子。這些理論和方法上的成就，推動了體外受精技術(shù)的發(fā)展，試管小鼠(Whittingham，1968)、大鼠(Toyoda和Chang，1974)、嬰兒(Steptoe和Edwards，1978)、牛(Brackett等，1982)、山羊(Hamda，1985)、綿羊(Hanada，1985)和豬(Chang等，1986)等相繼出生。

2、發(fā)展歷史（續(xù)）第二節(jié)體外受精

Invitrofertilization，IVF

一、概念、意義及發(fā)展歷史二、IVF的基本程序三、IVF的應(yīng)用前景一、概念、意義及發(fā)展歷史1、概念：

在自然條件下，哺乳動物精子和卵子的受精過程是在體內(nèi)完成的。如將精子和卵子分別從公、母畜體內(nèi)取出并經(jīng)過一系列的處理，使精卵在體外條件下結(jié)合的過程，稱為體外受精(invitrofertilization，IVF)。由于卵子和精子的受精過程是在實驗室中完成，故通過這一技術(shù)而產(chǎn)下的動物又稱為“試管動物”，如“試管?！?、“試管豬”、“試管嬰兒”等。第二節(jié)體外受精I(xiàn)nvitrofertilization2、發(fā)展歷史早在1878年，德國人Scnenk就以家兔和豚鼠為材料，開始探索哺乳動物的體外受精技術(shù)，但一直沒有獲得成功。直到1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞人Austin同時發(fā)現(xiàn)了哺乳動物的精子獲能現(xiàn)象，這一領(lǐng)域的研究才獲得突破性進(jìn)展。1959年，張明覺以家兔為實驗材料，從一只交配后12h的母兔子宮中沖取精子(即體內(nèi)獲能的精子)，從另外兩只超數(shù)排卵處理母兔的輸卵管中收集卵子，精子和卵子在體外人工配制的溶液中完成受精過程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受體的輸卵管中，其中4只妊娠，并產(chǎn)下15只健康仔兔，這是世界上首批試管動物，它們的正常發(fā)育標(biāo)志著體外受精技術(shù)的建立。

20世紀(jì)80年代中期以后，以牛為代表的家畜IVF技術(shù)發(fā)展迅速，1986年P(guān)arrish等用含肝素的介質(zhì)處理牛的冷凍精液，然后與體外成熟的卵母細(xì)胞體外受精獲得成功。這對牛IVF的研究和應(yīng)用具有重要意義，因為這種方法可利用屠宰場廢棄的卵巢和冷凍精液進(jìn)行胚胎體外生產(chǎn)，不僅成本低廉，而且效果穩(wěn)定。此后，牛的卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎培養(yǎng)體系逐步趨于成熟，胚胎體外生產(chǎn)效率得到很大提高。目前，采用IVF-ET技術(shù)，每對廢棄的牛卵巢可獲得3頭左右的犢牛。為充分利用良種母牛的遺傳資源，20世紀(jì)80年代后期，牛的活體取卵技術(shù)（OvumpickUP.OPU）發(fā)展迅速?；铙w取卵和IVF-ET結(jié)合已成為歐、美和大洋洲等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家的農(nóng)場主為擴(kuò)大良種母牛群選擇的重要繁殖技術(shù)。

牛的體外受精技術(shù)不僅應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)，同時，也成為研究其他胚胎生物技術(shù)，如克隆、轉(zhuǎn)基因、胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)和性別控制等的重要輔助手段。

2、發(fā)展歷史（續(xù)）體外受精技術(shù)的發(fā)展簡史

動物報道時間報道者兔小鼠大鼠人牛豬恒河猴狒狒綿羊山羊狨猴馬貓犬19591968197419781982198619841984198519851988199019701976ChangWhittinghamToyodaSteptoeBrackettChengBavisterBamaceda花田章花田章Lopata

ZhangHammerMahi3、意義（1）研究哺乳動物配子發(fā)生、受精和胚胎早期發(fā)育機(jī)理。

（2）在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價而高效的手段，對充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價值。

（3）在人類，IVF技術(shù)是治療某些不孕癥和克服性連鎖病的重要措施之一。（4）體外受精技術(shù)還是哺乳動物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分。

二、體外受精的基本操作程序：卵母細(xì)胞的體外成熟（invitromaturation,IVM）卵子和精子的體外受精（invitrofertilization,IVF）受精卵的體外培養(yǎng)（invitroculture,IVC）二、體外受精的基本程序（一）卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)1、離體卵巢采卵：是從屠宰母畜的卵巢采集卵母細(xì)胞（主要來源）（1）卵泡抽吸法（2）卵巢解剖法2、活體采卵：是從活母畜的卵巢采集卵母細(xì)胞（優(yōu)良品種）

B超引導(dǎo)法：借助超聲波(B超)探頭和屏幕的引導(dǎo)，從活母畜卵巢采集卵母細(xì)胞。操作員先將帶有B超探頭和采卵針的采卵器通過陰道插入子宮，同時通過將卵巢貼在探頭上。根據(jù)B超屏幕所顯示的卵泡位置，利用采卵針穿刺卵泡并同時抽吸卵母細(xì)胞。

B-超活采儀B超活體采卵

活體采集的牛卵母細(xì)胞3、卵母細(xì)胞的體外成熟（IVC）1）、培養(yǎng)液：用于卵母細(xì)胞體外成熟的最為廣泛基礎(chǔ)培養(yǎng)液是M199。培養(yǎng)時尚要加入一定的血清和激素。2）、溫度和氣相：牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的溫度一般為38～39℃。所有哺乳動物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的氣相一般要求在含5％C02的空氣和最大濕度的環(huán)境。3）．培養(yǎng)時間：牛和羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的時間一般為22～24h，而馬為30～36h，豬為40～44h。4）．培養(yǎng)方法：卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)方法一般采用微滴法、封閉法和開放法三種。CO2培養(yǎng)箱（二）卵母細(xì)胞的體外受精（IVF）1、精子的制備：懸浮法（swimup）；直接離心法；哌可（Percoll）密度梯度離心法2、精子獲能處理：肝素處理法；鈣離子載體法；高滲溶液處理法3、受精液：通常使用Tyrode’s改良液和BO液4、受精方法：微滴法、四孔培養(yǎng)板法5、精卵共培養(yǎng)的時間、溫度和氣相：受精后，卵母細(xì)胞應(yīng)立即放入溫度39℃，含5％CO2的空氣和最大相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～44h，其中牛22～24h，將假定的受精卵從受精液中取出，再在早期胚胎體外培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)18～33h。受精后40～44h檢查受精卵的分裂率（三）早期胚胎的體外培養(yǎng)（IVC）1、培養(yǎng)液：基本成分主要包括無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物和蛋白質(zhì)等。2、胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)：常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)、輸卵管離體培養(yǎng)系統(tǒng)、與體細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。3．培養(yǎng)方法：卵子在受精24h后，轉(zhuǎn)移到預(yù)先制備好的顆粒單層中繼續(xù)培養(yǎng)。一般使用微滴培養(yǎng)法。4、培養(yǎng)的溫度和氣相環(huán)境：和卵母細(xì)胞成熟的條件一樣。5．胚胎的回收及其質(zhì)量評定：以牛為例，整個體外受精程序，從卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)開始，經(jīng)過體外受精和體外培養(yǎng)直至受精卵發(fā)育到囊胚階段，一共經(jīng)歷8d的時間。如定受精當(dāng)天為0d，則受精后第5～6d即可回收桑椹胚，第7～8d回收囊胚。

1--cell2--cell4--8cell桑椹胚

囊胚體外受精

體外培養(yǎng)三、家畜體外受精技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀和存在的問題（一）發(fā)展現(xiàn)狀動物卵裂率囊胚率冷凍后存活率鮮胚移植后的產(chǎn)仔率牛８０％－９０％４０％－５０％８０％３０％－４０％羊８０％－９０％３０％－４０％８０％５０％豬９０％６０％－７０％－５０％（二）存在的問題和發(fā)展方向1、存在的問題１）囊胚發(fā)育率低，細(xì)胞數(shù)少。２）產(chǎn)仔率低，胎兒初生重高。2、發(fā)展的方向１）深入研究卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的分子機(jī)理；２）加強(qiáng)腔前卵泡的培養(yǎng)研究，充分利用優(yōu)良母畜的遺傳資源；３）加強(qiáng)體外受精與其他生物技術(shù)的結(jié)合。四、輔助受精技術(shù)(assistedfertilization)透明帶下注射(Subzonalinjection,SUZI)透明帶鉆孔(Zonadrilling,ZD)活精子透明帶部分切口(Partialzonadissection,PZD)卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射(Intracytoplasmicsperminjection,ICSI)這些通過對哺乳類配子進(jìn)行顯微操作以協(xié)助其受精的技術(shù)稱為顯微受精。精子顯微注射體外受精技術(shù)Intracytoplasmic

Sperm

Injection:

ICSI

顯微受精技術(shù)在動物受精和發(fā)育機(jī)理研究、畜牧業(yè)生產(chǎn)及人醫(yī)臨床實踐中有著廣闊的應(yīng)用前景：精液的利用率可成百萬倍的提高，可以使優(yōu)良種公畜得到最充分的應(yīng)用；精子的保存技術(shù)將大為簡化，將來或許只要精子核物質(zhì)完整就可以達(dá)到受精的目的，這對世界珍稀動物資源的保護(hù)將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響；與其他技術(shù)結(jié)合，如將已經(jīng)過性別鑒定的精子注入卵子受精，可人為控制家畜后代的性別。第三節(jié)克隆技術(shù)Animalcloning一、概述二、胚胎分割三、單個卵裂球分離培養(yǎng)四、細(xì)胞核移植一、概述“克隆”的定義動物克?。菏侵赣梢粋€動物經(jīng)無性繁殖（asexualreproduction）或孤雌生殖而產(chǎn)生的多個具有與親本相同遺傳信息的同質(zhì)性后代，包括孤雌激活生殖、卵裂球分離與培養(yǎng)、胚胎分割以及核移植等。胚胎分割：人為的將早期胚胎分割成兩個或幾個，然后移植給受體母畜可以獲得一卵雙胎甚至多胎。根據(jù)供體細(xì)胞核的來源分為：胚胎細(xì)胞克隆和體細(xì)胞克隆

二、牛胚胎分割二、囊胚的分割（續(xù)）三、卵裂球培養(yǎng)示意圖四、細(xì)胞核移植（nucleartransplantationornucleartransfer，NT，記憶）：核移植（nucleartransplantationornucleartransfer,NT），也稱作細(xì)胞核移植，是指將一個核供體通過顯微操作方法移植到一個核受體中，組成核質(zhì)雜合細(xì)胞，這種核質(zhì)雜合細(xì)胞也叫作重構(gòu)胚。核供體：①初期胚胎細(xì)胞；

②ES細(xì)胞；

③各種體細(xì)胞：如胎兒成纖維細(xì)胞，乳腺細(xì)胞，皮膚細(xì)胞（耳、成體、胎兒），肌肉細(xì)胞，卵丘細(xì)胞，內(nèi)臟細(xì)胞（肝、脾、心、肺、腸、舌）；

④生殖系列細(xì)胞：PGCs、精母細(xì)胞、足細(xì)胞和精巢細(xì)胞。

核受體：①去核卵母細(xì)胞；

②去核合子；

③去核2-細(xì)胞期胚胎的卵裂球。（一）動物克隆研究的歷史和現(xiàn)狀體細(xì)胞克隆首例胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植的方法動物核移植技術(shù)程序（二）、細(xì)胞核移植的方法

1、核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備

胚胎細(xì)胞、體細(xì)胞、ES細(xì)胞1）、胚胎細(xì)胞作為核供體先用1%的鏈酶蛋白酶或pH2.5的臺氏液去掉透明帶，再用機(jī)械吹打或酶消化發(fā)使其分散為單個游離的卵裂球。一般選擇16～32-細(xì)胞期或晚期桑椹的胚胎細(xì)胞較為合適。2）、體細(xì)胞作為核供體經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA消化后，將細(xì)胞接種培養(yǎng)于DMEM。之后放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至70%～80%時進(jìn)行傳代。傳代3～8代的細(xì)胞用于核移植。3）、胚胎干細(xì)胞作為核供體ES細(xì)胞既具有胚胎細(xì)胞所不具備的數(shù)量優(yōu)勢，又具有體細(xì)胞所不能保持的低分化。ES細(xì)胞是全能的，在一定條件下，它可以分化成各種功能細(xì)胞。2、受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備大量實驗表明，MII期卵母細(xì)胞適用于所有的供體核，目前基本上都采用去核的MII期卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)。受體卵母細(xì)胞在核移植前需要進(jìn)行去核。目前常用的去核方法有如下幾種：盲吸法，熒光引導(dǎo)去核法，微分干涉及極性顯微鏡去核法，離心去核法，化學(xué)試劑去核法，末期去核法，吸引法去核，擠壓法去核，點擊法去核1）、盲吸法：吸取極體附近的部分細(xì)胞質(zhì)。PB12）、熒光引導(dǎo)去核法：用Hoechst33342（2～8mg/ml）染色10～15min，然后，在熒光顯微鏡下確定核的位置。4）、離心去核法：根據(jù)細(xì)胞核的密度大于細(xì)胞質(zhì)，用離心的方法可使沒有透明帶的卵母細(xì)胞核被甩向一側(cè)而最后脫離卵母細(xì)胞。5）、化學(xué)試劑去核法：用化學(xué)試劑處理處于第一次減數(shù)分裂中期的小鼠卵母細(xì)胞，使染色體相互緊密結(jié)合，形成染色體復(fù)合體，在卵母細(xì)胞排出PB1時，染色體復(fù)合體隨PB1一起排出。6）、末期去核法：激活處理成熟卵母細(xì)胞，使其排出PB2，然后吸取其周圍附近的細(xì)胞質(zhì)。7）、吸引法去核：在注入核供體的同時吸引除掉原有卵母細(xì)胞核。8）、擠壓法去核：在PB1附近，將透明帶切開，調(diào)準(zhǔn)切口，固定卵母細(xì)胞，使切割針與其成垂直方向，向下擠壓除去PB1連同下面的一小部分細(xì)胞質(zhì)。9）、點擊法去核：在PB1附近，將卵母細(xì)胞透明帶切開1/3，調(diào)準(zhǔn)切口，使其與切割針成垂直方向，固定卵母細(xì)胞，用顯微針點擊透明帶，除去PB1連同下面的一小部分細(xì)胞質(zhì)。5、激活系統(tǒng)1）、化學(xué)激活

⑴7%乙醇：處理時間5～7min ⑵離子霉素：4umol/L，5min ⑶鈣離子載體（A23187）：5umol/L，5min ⑷6-DMAP：1.9～2.0mmol/L；3～5h或更長

⑸星形胞菌素：2umol/L；15～30min2）、電激活

3、移核1）、帶下注射移核法2）、卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注核法4、細(xì)胞融合系統(tǒng)1）、化學(xué)法2）、仙臺病毒法3）、電融合法融合過程6、核移植重構(gòu)胚的培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)：用瓊脂包埋，移入暫時的中間受體（如羊、兔）的輸卵管內(nèi)，培養(yǎng)4～5d后，然后回收胚胎進(jìn)行移植。

體外培養(yǎng)：重組胚激活后，在現(xiàn)有的胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)。7、繼代細(xì)胞核移植又叫連續(xù)細(xì)胞核移植，即將核移植胚胎的卵裂球分開，作為供核細(xì)胞，再進(jìn)行連續(xù)多代的核移植，以便從一枚胚胎得到更多的克隆胚胎。8、克隆胚胎的移植

如牛：先做同期發(fā)情處理，然后將胚胎移到受體動物如牛和水牛的黃體側(cè)子宮角。（三）、核移植技術(shù)（克隆技術(shù)）存在的問題：結(jié)果不穩(wěn)定，效率低（1～6%）；克隆動物懷孕期長、出生體重異常偏大、生后對環(huán)境的適應(yīng)性差；存活率低；細(xì)胞質(zhì)的遺傳問題。（四）、核移植的應(yīng)用前景1、擴(kuò)大優(yōu)良畜種和稀有動物的數(shù)量2、提高轉(zhuǎn)基因動物效率3、核-質(zhì)間互作關(guān)系的研究4、克隆技術(shù)的醫(yī)學(xué)價值核移植產(chǎn)生的彌猴美國俄勒崗州靈長類研究中心通過早期胚胎卵裂球移植入卵母細(xì)胞后產(chǎn)生的幼猴。第四節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)動物

TransgenicAnimal一、概述二、哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究意義三、哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要環(huán)節(jié)四、哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的主要問題一、概述1976年Jaenisch等獲得含有SV40DNA的嵌合體小鼠。1980年，Gordon應(yīng)用顯微注射法首次成功地將重組的外源DNA直接注入小鼠受精卵雄原核中，獲得了攜帶外源基因小鼠。1982，Palmiter將大鼠的生長激素基因用微注射方法導(dǎo)入小鼠的受精卵中獲得巨型小鼠（supermouse），從而在理論上和實踐意義上都將轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高一步，引起生物學(xué)界極大的關(guān)注，為基因工程育種提供誘人的前景。早期以提高生長為主以生產(chǎn)藥用蛋白和可移植的器官表達(dá)熒光的轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)：通過一定方法把人工重組的外源DNA導(dǎo)入受體動物的基因組中或把受體基因組中的一段DNA切除，從而使受體動物的遺傳信息發(fā)生人為改變，并且這種改變能穩(wěn)定地遺傳給后代的技術(shù)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)基因組改變的動物稱轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal）。二、哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究意義1、在基礎(chǔ)生物學(xué)中2、在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中3、在畜牧業(yè)中三、制備轉(zhuǎn)基因動物的基本程序1、目的基因克隆和體外重組

1）人工合成

2）互補(bǔ)DNA（cDNA）的克隆

3）DNA克隆2、外源基因的導(dǎo)入將目的基因轉(zhuǎn)入→培養(yǎng)→產(chǎn)下后代3、外源DNA整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的分子檢測是否是轉(zhuǎn)基因動物2、外源基因的導(dǎo)入方法

1）顯微注射法-微注射法（microinjection）

它是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因動物的有效途徑。2）逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法3）胚胎干細(xì)胞法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的流程圖4）精子載體法意大利Lavitrano等1989年首次報道利用精子作為載體獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。5）細(xì)胞核移植法6）生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法3、外源DNA整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的分子檢測1）外源基因的整合檢測2）外源基因的轉(zhuǎn)錄檢測3）外源基因的表達(dá)檢測四、哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的主要問題1、效率低，成本高2、外源基因的隨機(jī)整合和異常表達(dá)3、轉(zhuǎn)基因與動物保護(hù)的矛盾4、轉(zhuǎn)基因動物釋放及生物安全四、哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展趨勢1、提高效率，降低成本2、加強(qiáng)基因頂點鄭和技術(shù)研究3、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展將對人類產(chǎn)生深刻的影響第五節(jié)性別控制技術(shù)Sexcontrol

一、性別控制技術(shù)定義和意義二、性別控制技術(shù)的發(fā)展概況三、哺乳動物的性別控制技術(shù)四、性別控制技術(shù)的發(fā)展前景一、性別控制的定義和意義（一）定義：指通過對動物正常生殖過程進(jìn)行人為干預(yù)，使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望性別后代的一種繁殖新技術(shù)。受精之前——通過在體外對精子進(jìn)行干預(yù)，使在受精之前便決定后代的性別。受精之后——通過對胚胎性別鑒定，從而獲得所需性別的后代。（二）性別控制的意義：1、可使受性別限制的生產(chǎn)性狀（如泌乳性狀）和受性別影響的生產(chǎn)性狀（如肉用,毛用性狀等）能獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。2、可增強(qiáng)良種選種中的強(qiáng)度和提高育種效率,以獲得最大的遺傳進(jìn)展。3、對人類來說,通過精子性別的選擇,可以避免懷孕一個與X相關(guān)隱性疾病的嬰兒。而與X相關(guān)的隱性疾病至今已有370多種。畜牧業(yè)：提高畜牧業(yè)生產(chǎn)的效率人類：避免患上與性別相關(guān)的遺傳疾病二、性別控制技術(shù)的發(fā)展概況1、1906年Stevens和Wilson，以昆蟲為研究對象，首先發(fā)現(xiàn)精子中X染色體,Y染色體。2、1923年P(guān)ainter發(fā)現(xiàn)人精子中的X染色體,Y染色體。3、1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色體決定雄性的理論。4、1966年Jacobs發(fā)現(xiàn)雄性性別決定因素位于Y染色體的短臂5、1989年P(guān)almer等找到了Y染色體上的性別決定區(qū)（sexdetermingregionoftheYchromosome,SRY)。6、1992年英國的劍橋Mastercalf公司利用分離的精子和體外受精技術(shù)得到性控犢牛。三、哺乳動物的性別控制技術(shù)（一）X、Y精子的分離1、X、Y精子的差異DNA含量

DNA含量的差異是由于性染色體的不同所引起，但因測定方法的不同而引起測定值各異。1968年，Schilling用沉淀法分離精子，他發(fā)現(xiàn)沉。淀于下層精子的DNA含量高于上層的精子，但DNA含量之差卻因測定方法不同而異。用顯微光譜法測定時為3.7％，用福爾根法測定時為0.3％，用紫外線分光鏡測定時為4.9％。隨后的研究表明，這一差值并不是因為X精子、Y精子的不同而引起的，若以單倍體的平均DNA含量的百分比表示，則X精子、Y精子DNA含量差值在所有動物都介于2.5％一4.5％之間。隨著流式細(xì)胞分類器的問世，人們已成功分離出含DNA多的X精子和含DNA少的Y精子。

2、X精子與Y精子的分離技術(shù)流式細(xì)胞分離法：用流式細(xì)胞分離法測量DNA的含量能將含X染色體和Y染色體的精子分開，分離后的精子純度超過90％。此法分離X精子、Y精子的依據(jù)是兩條性染色體DNA含量不同。哺乳動物的X精子比Y精子一般大2.9％～4.2％，且X精子帶的DNA比Y精子多2.8％～7.5％(豬為3.5％、牛為3.9％、羊為4.2％)。Johnson(1994)研究表明，X精子與Y精子在染色體的DNA組成上存在最高可達(dá)12.5％的差別，這是兩者之間的不同，依據(jù)這一原理設(shè)計出流式細(xì)胞分類器。各種動物X、Y染色體DNA含量差異精子分離流程示意圖精子分離Chamber（二）早期胚胎的性別鑒定1、核型分析法：細(xì)胞遺傳學(xué)方法又稱為核型分析法。常采用切割胚，一半用于鑒定性別，一半用于冷凍或移植。其基本原理是取一部分細(xì)胞，先用秋水仙素處理，再固定染色，檢查性染色體，根據(jù)人色體中期的譜帶差異、Y染色體的大小及形態(tài)判斷性別，準(zhǔn)確綠達(dá)100%。但過程復(fù)雜，且要求操作人員有豐富的經(jīng)驗。胚

胎

性

別

鑒

定2、SRY—PCR鑒定法：從早期胚胎中取出一個或幾個卵裂球，用特異性引物擴(kuò)增SRY基因，能夠產(chǎn)生出擴(kuò)增DNA片段的胚胎即為雄性，反之為雌性。再把確定性別的胚胎移植到子宮。3、免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法是指利用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測胚胎上是否存在雄性特異性H-Y抗原，從而進(jìn)行胚胎性別鑒定的一種方法。細(xì)胞毒性分析法、間接免疫熒光法和囊胚形成抑制法。1、細(xì)胞毒性分析法：在補(bǔ)體（豚鼠血清）存在的情況下，H-Y抗體可以與H-Y陽性雄性胚胎結(jié)合，使卵裂球溶解，破壞胚胎的發(fā)育。2、間接免疫熒光法：間接免疫熒光法是以H-Y抗體作為第一抗體，以異硫氰酸熒光素（FLTC）標(biāo)記的山羊抗鼠r-球蛋白作為第二抗體。將上述兩種抗體依次與胚胎共同培養(yǎng)，雄性胚胎上的抗原先與第一抗體結(jié)合，第一抗體再與第二抗體結(jié)合，通過洗滌，將沒有結(jié)合到胚胎上的第二抗體去除，由于第二抗體是熒光標(biāo)記的，所以在熒