蛋白質(zhì)工程制藥

關(guān)于蛋白質(zhì)工程制藥2第一節(jié)蛋白質(zhì)和多肽類藥物的分類一、多肽與蛋白質(zhì)肽：2-50蛋白質(zhì)：>50一般來說，大于20個(gè)氨基酸的多肽與蛋白質(zhì)沒有明顯界限。第2頁,共81頁，星期六，2024年，5月3二、多肽類藥物的分類與作用激素類加壓素、催產(chǎn)素、促皮質(zhì)素及衍生物下丘腦-垂體肽激素消化道激素其他激素和活性肽細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子含有多肽成分的其他生化藥物第3頁,共81頁，星期六，2024年，5月4三、蛋白質(zhì)類藥物的分類與作用激素、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子、血漿蛋白質(zhì)、黏蛋白、膠原蛋白、堿性蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、植物凝集素第4頁,共81頁，星期六，2024年，5月5四、多肽和蛋白質(zhì)類藥物的性質(zhì)酸堿性解離等電點(diǎn)pI離子結(jié)合蛋白質(zhì)形成的鹽在組織中廣泛存在；小離子與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合在組織和體液中起重要作用。第5頁,共81頁，星期六，2024年，5月6膠體性質(zhì)——電荷和水化膜應(yīng)用：除雜變性三維結(jié)構(gòu)破壞第6頁,共81頁，星期六，2024年，5月7五、多肽和蛋白質(zhì)類藥物的制備提取分離純化化學(xué)合成法蛋白質(zhì)工程法第7頁,共81頁，星期六，2024年，5月8提取分離純化原材料選擇預(yù)處理多肽和蛋白質(zhì)藥物提取純化來源豐富、目的物含量高、成本低破碎、防止變性水溶液提取、有機(jī)溶劑提?。ㄈ芙舛?、分子大小形狀、電性等）第8頁,共81頁，星期六，2024年，5月9蛋白質(zhì)工程法更換活性蛋白質(zhì)的關(guān)鍵氨基酸殘基調(diào)整蛋白質(zhì)分子的某些肽段、結(jié)構(gòu)域或寡糖鏈，生成合適的糖型，產(chǎn)生新的功能功能互補(bǔ)的兩種基因工程藥物在基因水平上融合第9頁,共81頁，星期六，2024年，5月10第二節(jié)、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)與合成第10頁,共81頁，星期六，2024年，5月11

蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的術(shù)語是20世紀(jì)80年代初產(chǎn)生的。通過序列修飾改造改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)并有應(yīng)用價(jià)值的第一個(gè)報(bào)道引起了人們廣泛的關(guān)注，紛紛成立了蛋白質(zhì)工程及設(shè)計(jì)的專門機(jī)構(gòu)。盡管通過蛋白質(zhì)工程研究已取得許多激動人心的成果，但是通過蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)確定、具有新的所希望性質(zhì)的穩(wěn)定的新蛋白質(zhì)并不容易。第11頁,共81頁，星期六，2024年，5月12公開性蛋白質(zhì)研究組織

研究組織目標(biāo)/特色ProteinStructureInitiative(美國NIH)十年內(nèi)定出一萬個(gè)蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)StructuralDiversityPilotProject(美國)Rockefeller大學(xué)主導(dǎo)之學(xué)術(shù)合作NMRParkProject(日本)利用NMR來決定老鼠蛋白質(zhì)之結(jié)構(gòu)ProteinStructureFactory(德國)醫(yī)學(xué)上重要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之高速分析StructuralBiologyIndustrialPlatform(歐洲)包含幾個(gè)主要製藥公司等16家公司所組成的聯(lián)盟第12頁,共81頁，星期六，2024年，5月13蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目的和類型

為蛋白質(zhì)工程提供指導(dǎo)性信息；探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)分為基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)及全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)（蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)）。第13頁,共81頁，星期六，2024年，5月14蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目前存在的問題設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性。所有設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)有正確的形貌、顯著的二級結(jié)構(gòu)及合理的熱力學(xué)穩(wěn)定性，但一般說來它們的三級結(jié)構(gòu)的確定性較差。第14頁,共81頁，星期六，2024年，5月15

從圖2-1(a)看出，天然蛋白質(zhì)有確定主鏈結(jié)構(gòu)及側(cè)鏈構(gòu)象。圖2-1(b)所示的設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是一組低能構(gòu)象的集合，缺乏結(jié)構(gòu)獨(dú)特性。第15頁,共81頁，星期六，2024年，5月16蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是一門新興的研究領(lǐng)域，其本身在不斷地發(fā)展，其內(nèi)容也在不斷地更新。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的必要性。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是多學(xué)科的交叉領(lǐng)域。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)在許多方面取得的顯著進(jìn)展。第16頁,共81頁，星期六，2024年，5月17基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)

一、概述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的認(rèn)識對蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是至關(guān)重要的，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)涉及一級結(jié)構(gòu)(序列)及三維結(jié)構(gòu)。即使蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是已知的，選擇一個(gè)合適的突變體仍是困難的，這說明蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)任務(wù)的艱巨性，它涉及多種學(xué)科的配合，如計(jì)算機(jī)模擬專家、X射線晶體學(xué)家、蛋白質(zhì)化學(xué)家、生物技術(shù)專家等的合作與配合。第17頁,共81頁，星期六，2024年，5月18計(jì)算機(jī)模擬

基因構(gòu)建突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品功能分析蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)第18頁,共81頁，星期六，2024年，5月19蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)大致涉及的幾個(gè)重要方面在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)開始之前，要對所要求的活性進(jìn)行篩選。測定它們的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等。第19頁,共81頁，星期六，2024年，5月20專一性突變產(chǎn)物是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成敗的關(guān)鍵。一些新技術(shù)，如PCR及自動化技術(shù)的發(fā)展使各種類型的基因工程變得快速、容易。計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)中占有重要位置。建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，確立突變位點(diǎn)或區(qū)域以及預(yù)測突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對蛋白質(zhì)工程是至關(guān)重要的。在明確突變位點(diǎn)或蛋白質(zhì)序列應(yīng)改變的區(qū)域后，可以進(jìn)行定位突變，但要得到具有預(yù)期結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)是不容易的，可能需要經(jīng)過幾輪的循環(huán)。第20頁,共81頁，星期六，2024年，5月21第21頁,共81頁，星期六，2024年，5月22設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決辦法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系對于蛋白質(zhì)工程及蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)都是至關(guān)重要的。如果我們想改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)，必須改變蛋白質(zhì)的序列。Hartley等于1986年完成了一個(gè)我們所要的有關(guān)蛋白質(zhì)重要性質(zhì)設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決辦法表，該表至今仍有參考價(jià)值。第22頁,共81頁，星期六，2024年，5月23設(shè)計(jì)目標(biāo)解決辦法熱穩(wěn)定性對氧化的穩(wěn)定性對重金屬的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性提高酶學(xué)性質(zhì)引入二硫橋增加內(nèi)氫鍵數(shù)目改善內(nèi)疏水堆積增加表面鹽橋把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基替換表面荷電基團(tuán)His、Cys以及Tyr的置換內(nèi)離子對的置換專一性的改變增加逆轉(zhuǎn)數(shù)(turnovernumber)改變酸堿度蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)及解決辦法第23頁,共81頁，星期六，2024年，5月24蛋白質(zhì)突變體的設(shè)計(jì)涉及如下3個(gè)步驟。（1）從天然蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)出發(fā)(實(shí)驗(yàn)測定或預(yù)測)，利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換的氨基酸。這是非常關(guān)鍵的步驟，一般應(yīng)注意如下問題。

a．應(yīng)確定對蛋白質(zhì)折疊敏感的區(qū)域，這些區(qū)域包括帶有特殊扭角的氨基酸、鹽橋、密堆積區(qū)等。

b．應(yīng)確定對功能非常重要的位置，這些可以從結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、生物化學(xué)或蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)及結(jié)構(gòu)上的考慮。第24頁,共81頁，星期六，2024年，5月25

c．應(yīng)該考察剩余位置對所希望改變的影響。

d．當(dāng)進(jìn)行互換或插入刪除殘基時(shí)應(yīng)考慮它們對結(jié)構(gòu)特征的影響，如疏水堆積、側(cè)鏈取向、氫鍵、鹽橋等。同時(shí)也要考慮它們對蛋白質(zhì)功能的影響?；Q或插入/刪除區(qū)域一般都在外環(huán)。有如下一些假設(shè)：氨基酸側(cè)鏈的改變不會影響該主鏈折疊的改變，插入/刪除某些部分不會影響表面區(qū)域，側(cè)鏈交換遵守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守原則。（2）利用能量優(yōu)化及蛋白質(zhì)動力學(xué)方法預(yù)測修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。（3）預(yù)測的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或結(jié)構(gòu)-穩(wěn)定性相關(guān)知識及理論計(jì)算預(yù)測新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)。在上述設(shè)計(jì)工作完成后，要進(jìn)行合成或突變實(shí)驗(yàn)并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新的蛋白質(zhì)。第25頁,共81頁，星期六，2024年，5月26計(jì)算機(jī)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)只是有效實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一種方法。它不能替代實(shí)驗(yàn)，正像蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測不能替代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定一樣。如果一個(gè)科學(xué)家設(shè)計(jì)一種具有新的催化性質(zhì)的酶，他必須了解催化過程及機(jī)理；了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)化學(xué)、生物化學(xué)方面的知識。因此蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的成功與否，必須要有理論與實(shí)驗(yàn)的緊密結(jié)合。第26頁,共81頁，星期六，2024年，5月27內(nèi)核假設(shè)所謂內(nèi)核是指蛋白質(zhì)在進(jìn)化中保守的內(nèi)部區(qū)域。在大多數(shù)情況，內(nèi)核由氫鍵連接的二級結(jié)構(gòu)單元組成。假定蛋白質(zhì)獨(dú)特的折疊形式主要由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用所決定。

二、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原理

第27頁,共81頁，星期六，2024年，5月28內(nèi)部密堆積，并且沒有重疊。

由兩個(gè)因素造成的。分子是從內(nèi)部排出的，這是總疏水效應(yīng)的一部分；由原子間的倫敦色散力所引起的，是由于短吸引力的優(yōu)化。第28頁,共81頁，星期六，2024年，5月29氫鍵都是最大滿足的蛋白質(zhì)的氫鍵形成涉及一個(gè)交換反應(yīng)，溶劑鍵被蛋白質(zhì)鍵所替代。隨著溶劑鍵的斷裂所帶來的能量損失是由折疊狀態(tài)的重組以及可能釋放一個(gè)結(jié)合的水分子而引起的熵的增益所彌補(bǔ)。第29頁,共81頁，星期六，2024年，5月30疏水及親水基團(tuán)需要合理地分布在溶劑可及表面及不可及表面。在金屬蛋白中，配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。對于金屬蛋白，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列結(jié)構(gòu)及功能的專一性。第30頁,共81頁，星期六，2024年，5月31三、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中的結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系的重要性

蛋白質(zhì)的序列、三維結(jié)構(gòu)，熱力學(xué)及功能性質(zhì)之間的關(guān)系是目前廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。它對于蛋白質(zhì)工程及蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)都是非常重要的。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識過程始于蛋白質(zhì)中重要功能殘基及蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的確定。第31頁,共81頁，星期六，2024年，5月32定位突變在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中的作用

通過定位突變替換單獨(dú)的氨基酸殘基是分析功能殘基的有力工具。選擇突變殘基，最重要的信息來自結(jié)構(gòu)特征。因此如果蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)是未知的，則突變功能殘基的研究帶有不確定性。第32頁,共81頁，星期六，2024年，5月33定位突變種類插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。最大量的定位突變是在體外利用重組DNA技術(shù)或PCR方法。第33頁,共81頁，星期六，2024年，5月34突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的評估溶解性熱力學(xué)分析Ｘ射線晶體學(xué)及ＮＭＲ譜園二色譜方法單克隆抗體探測構(gòu)象變化第34頁,共81頁，星期六，2024年，5月35熱力學(xué)分析可以用于測量突變蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性及化學(xué)變化自由能，并可作為構(gòu)象整體性的檢測。

X射線晶體學(xué)及NMR譜可以直接提供突變蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)及評估結(jié)構(gòu)整體性。圓二色譜方法是可用于分析突變體結(jié)構(gòu)的另一生物物理方法。第35頁,共81頁，星期六，2024年，5月36蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定根據(jù)已知結(jié)構(gòu)信息確定功能殘基突變法鑒定功能殘基利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基第36頁,共81頁，星期六，2024年，5月37不同動物胰島素在A鏈中的差異

羧基端第37頁,共81頁，星期六，2024年，5月38四、天然蛋白質(zhì)的剪裁

什么是分子剪裁：分子剪裁是指在對天然蛋白質(zhì)的改造中替換1個(gè)肽段或一個(gè)結(jié)構(gòu)域。將小鼠單克隆抗體分子重鏈的互補(bǔ)決定簇用基因操作方法插到人的抗體分子的相應(yīng)部位上，使得小鼠單抗分子所具有的抗原結(jié)合專一性轉(zhuǎn)移到人的抗體分子上。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。第38頁,共81頁，星期六，2024年，5月39結(jié)構(gòu)域由α螺旋、β折疊等二級結(jié)構(gòu)單位按一定的拓?fù)鋵W(xué)規(guī)則構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)實(shí)體。構(gòu)域是蛋白質(zhì)分子中一種基本的結(jié)構(gòu)單位，結(jié)構(gòu)域拼接是通過基因操作把位于兩種不同蛋白質(zhì)上的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成融合蛋白，它兼有原來兩種蛋白的性質(zhì)。

五、結(jié)構(gòu)域的拼接第39頁,共81頁，星期六，2024年，5月40第40頁,共81頁，星期六，2024年，5月41六、結(jié)構(gòu)與功能的容忍度蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能對殘基的替換有一定的容忍度，即結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系有一定的穩(wěn)健度。第41頁,共81頁，星期六，2024年，5月42Fersht等替換了Barnase的所有內(nèi)核殘基。結(jié)果表明23％的突變體保留了酶的活性。Mathews及其合作者在溶菌酶內(nèi)核中替換多至10個(gè)殘基。實(shí)驗(yàn)證明多重取代的蛋白仍具有活性以及協(xié)同折疊。第42頁,共81頁，星期六，2024年，5月43全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)一、特征全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是另一類蛋白質(zhì)工程，合成具有特異結(jié)構(gòu)與功能的新蛋白質(zhì)。根據(jù)所希望的結(jié)構(gòu)及功能設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列。第43頁,共81頁，星期六，2024年，5月44

全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是根據(jù)所希望的結(jié)構(gòu)及功能設(shè)計(jì)序列，稱反折疊研究。蛋白質(zhì)的功能是直接與它的三維結(jié)構(gòu)相關(guān)的，通過序列的改變來操縱結(jié)構(gòu)提供功能的多樣性?；谔烊坏鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)改造的蛋白質(zhì)工程可以優(yōu)化蛋白質(zhì)的活性，改善它們的藥效動力學(xué)性質(zhì)。而全新蛋白設(shè)計(jì)是另一類蛋白質(zhì)工程，它合成具有新奇的結(jié)構(gòu)與功能的新蛋白質(zhì)。第44頁,共81頁，星期六，2024年，5月45二、蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)內(nèi)容蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)功能的從頭設(shè)計(jì)第45頁,共81頁，星期六，2024年，5月46三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)１．二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝２．配體誘導(dǎo)組裝３．通過共價(jià)交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自組裝４．在合成模板上肽的組裝５．線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)６．基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)第46頁,共81頁，星期六，2024年，5月47設(shè)計(jì)一個(gè)新奇的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的中心問題是設(shè)計(jì)一個(gè)具有穩(wěn)定及獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)的序列。要達(dá)到這個(gè)目標(biāo)需要克服的基本障礙是線性聚合鏈的構(gòu)象熵。例如，如果在具有100個(gè)殘基的蛋白質(zhì)中每個(gè)殘基采取10個(gè)可能構(gòu)象中的一個(gè)構(gòu)象，則這條鏈折疊成為確定的三維構(gòu)象所消耗的熵是568.48kJ／mol。這個(gè)數(shù)字代表不合適的自由能的真實(shí)的量。因此要實(shí)現(xiàn)正確的折疊必須借助于許多合適的相互作用，要使一個(gè)序列能折疊為確定的三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)的相互作用能必須超過構(gòu)象熵。第47頁,共81頁，星期六，2024年，5月48可以采用不同的策略達(dá)到這個(gè)目標(biāo)。最主要是使相互作用的強(qiáng)度與數(shù)目達(dá)到最大。另一個(gè)策略是通過共價(jià)交叉連接減小折疊的構(gòu)象熵。根據(jù)第一原理設(shè)計(jì)一個(gè)蛋白質(zhì)，我們必須依賴于分析已知結(jié)構(gòu)的天然蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)單元，例如螺旋、β折疊片、(環(huán))以及轉(zhuǎn)折，得到一些結(jié)構(gòu)知識，這些知識涉及氨基酸形成二級結(jié)構(gòu)的傾向性等。十多年來，科學(xué)家對螺旋已有很好的認(rèn)識，近幾年的重點(diǎn)在于二級結(jié)構(gòu)在三維空間形成的獨(dú)特的構(gòu)象通過長程相互作用可控形成超二級結(jié)構(gòu)。我們可以有把握地設(shè)計(jì)并合成螺旋束，β折疊片以及ββα模塊，它們的形成規(guī)律比較清楚，成功的概率也比較高。蛋白質(zhì)中不同層次的結(jié)構(gòu)組織見圖2-6。第48頁,共81頁，星期六，2024年，5月49第49頁,共81頁，星期六，2024年，5月50分析己知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可以認(rèn)為復(fù)雜的三級折疊和四級結(jié)合可以分解為有數(shù)的二級結(jié)構(gòu)單元，例如螺旋、串、轉(zhuǎn)角，它們通過LOOP連接為三級結(jié)構(gòu)。特殊折疊的穩(wěn)定性是由一定距離殘基間鍵相互作用決定的。全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)要求很好地認(rèn)識蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的規(guī)律。在了解殘基形成二級結(jié)構(gòu)單元的傾向性后，要安排殘基的最大的疏水相互作用形成一個(gè)緊密的疏水內(nèi)核。離子相互作用及氫鍵可以進(jìn)一步用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。另外一種途徑是根據(jù)主鏈的構(gòu)象限制設(shè)計(jì)二級結(jié)構(gòu)。第50頁,共81頁，星期六，2024年，5月51

1．二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的最簡單、最直接的策略是合成單一二級結(jié)構(gòu)單元(α螺旋或折疊股)作為多肽鏈的片段的模塊途徑，然后復(fù)制這些二級結(jié)構(gòu)片段并把它們連接為整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通常，這些二級結(jié)構(gòu)是兩親性的。疏水表面埋藏在內(nèi)核形成緊密的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，如圖2-7所示。第51頁,共81頁，星期六，2024年，5月52

2．配體誘導(dǎo)組裝全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的第二個(gè)策略是使用一個(gè)配體(典型的是一個(gè)金屬離子)誘導(dǎo)模塊蛋白片段的組裝，如圖2-10所示。一個(gè)配位結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)在結(jié)構(gòu)中幾個(gè)相互作用片段的界面處。如果這個(gè)位點(diǎn)對配體有很高的親和力，則結(jié)合配體的合適的自由能將充分克服熵消耗并驅(qū)動肽自組裝。第52頁,共81頁，星期六，2024年，5月533．通過共價(jià)交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自組裝設(shè)計(jì)全新蛋白的主要障礙是肽鏈的構(gòu)象熵。當(dāng)幾個(gè)沒有連接的肽鏈進(jìn)行自組裝時(shí)，熵勢壘是比較難以克服的。通過共價(jià)交叉連接可以減少構(gòu)象熵。因此共價(jià)連接他們的預(yù)組織肽是直接形成所希望結(jié)構(gòu)的有力途徑，如圖2-13所示。第53頁,共81頁，星期六，2024年，5月54

4．在合成模板上肽的組裝

Mutter及其合作者發(fā)展了一種模板組裝合成蛋白(TASPs)方法。他們不是使用天然蛋白中的turn和loops連接二級結(jié)構(gòu)單元，而是使用圖2-16中所顯示的人工模板。同天然線性蛋白質(zhì)不同。螺旋和折疊股在一個(gè)特殊折疊過程有一個(gè)正確的相對取向。TASP分子的螺旋和股通過模板結(jié)構(gòu)導(dǎo)向形成所希望的構(gòu)象。第54頁,共81頁，星期六，2024年，5月55

5．線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)

不用模板或交叉連接而通過線性多肽折疊形成球形的確定的三維結(jié)構(gòu)是全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)追求的目標(biāo)之一。把一個(gè)線性肽折疊形成獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)的主要障礙是構(gòu)象熵，這需要精心設(shè)計(jì)一系列的相互作用才能穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。這方而工作已取得重大進(jìn)展。第55頁,共81頁，星期六，2024年，5月56

6．基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)

蛋白質(zhì)組學(xué)是目前備受關(guān)注的新領(lǐng)域，它包括天然蛋白質(zhì)的多樣性、相互作用、結(jié)構(gòu)以及功能。它回答的問題是“什么是天然存在的”。組合庫方法要回答的問題是“什么是可能的”。要問答這個(gè)問題是要構(gòu)筑大的全新蛋白質(zhì)庫。比較庫中的全新蛋白質(zhì)與自然進(jìn)化選擇的蛋白質(zhì)，可以得到很多有用的信息。第56頁,共81頁，星期六，2024年，5月57

所有可能的氨基酸序列是一個(gè)天文數(shù)字，例如一個(gè)含有100個(gè)殘基的序列可能有20100種。但是實(shí)際能形成獨(dú)特三維結(jié)構(gòu)的序列僅占序列空間的很小部分。

組合庫的構(gòu)筑既要顧及序列的多樣性又要利用合理設(shè)計(jì)大大減少序列的數(shù)目。

第57頁,共81頁，星期六，2024年，5月58組合庫設(shè)計(jì)的一個(gè)核心問題是埋藏疏水部分。一個(gè)常用的方法是基于極性（P）和非極性(N)氨基酸的“二元模式”。“二元模式”一方面要有利于形成二級結(jié)構(gòu)，另一方面又要埋藏疏水殘基。二元模式可用于二級結(jié)構(gòu)兩親片段，一面完全是極性殘基，另一面完全是非極性殘基。第58頁,共81頁，星期六，2024年，5月59組合庫的設(shè)計(jì)中要考慮優(yōu)化疏水核，通過篩選發(fā)現(xiàn)最優(yōu)的堆積相互作用。主要使用兩種篩選方法：第一種是使用一維1H-NMR譜；第二種方法是使用電噴霧質(zhì)譜(ES-MS)觀察H-D交換動力學(xué)。除了考慮疏水核堆積外還要考慮優(yōu)化二級結(jié)構(gòu)單元間的界面。近年來發(fā)展了一些計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)方法，在開始實(shí)驗(yàn)之前先進(jìn)行計(jì)算機(jī)篩選。一般分為兩步，第一步建立側(cè)鏈的旋轉(zhuǎn)構(gòu)象庫(rotemer)；第二次把Rotomer庫作為輸入，計(jì)算低能序列組合的可能性。第59頁,共81頁，星期六，2024年，5月60三、蛋白質(zhì)功能的全新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)是產(chǎn)生既能折疊為預(yù)想的結(jié)構(gòu)又具有有趣和有用的功能。功能設(shè)計(jì)主要涉及鍵合及催化。為達(dá)到這些目的可以采用兩條不同的途徑：反向?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)與工程底物的契合，改變功能；從頭設(shè)計(jì)功能蛋白質(zhì)。第60頁,共81頁，星期六，2024年，5月61計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是一個(gè)理論與實(shí)驗(yàn)之間的循環(huán)。這個(gè)循環(huán)已經(jīng)在蛋白質(zhì)的合理設(shè)計(jì)中得到了許多重要進(jìn)展。計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)包括能量表達(dá)、能量優(yōu)化、側(cè)鏈構(gòu)象的離散化、殘基分類(內(nèi)核、表面、邊界)、功能位點(diǎn)設(shè)計(jì)、專一性、穩(wěn)定性及序列空間的穩(wěn)健性預(yù)測等方面內(nèi)容。第61頁,共81頁，星期六，2024年，5月62一、抗病毒藥β-干擾素穩(wěn)定性的改進(jìn)-SH17形成二聚體失去活性-OH17氨基酸取代×二聚體二硫鍵第三節(jié)、蛋白質(zhì)工程在制藥中的應(yīng)用第62頁,共81頁，星期六，20