SN∕T 4849.5-2017 出口食品及飲料中常見小漿果成分的檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法 第5部分：蔓越莓和藍(lán)莓

出口食品及飲料中常見小漿果成分的檢測方法實(shí)時(shí)熒光PCR法第5部分：蔓越莓和藍(lán)莓I本部分為SN/T4849的第5部分。1檢測方法實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T4849的本部分規(guī)定了出口食品及飲料中蔓越莓和藍(lán)莓成分的檢測方法實(shí)時(shí)熒光PCR法。莓為原輔料的食品及飲料中蔓越莓和藍(lán)莓成分的定性檢測(清汁及果酒除外)低檢出限(LOD)為1%(體積比)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測漿果是指由一個(gè)子房或聯(lián)合其他花器發(fā)育成的柔軟多汁的肉質(zhì)單果，由一rocarpon),小果紅莓苔子(毛蒿豆)(Vaciniummicrocarpum),紅莓苔子(北方蔓越橘)(Vaccinium2dNTP:脫氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleosidetriphosphate)。dTTP:脫氧胸苷三磷酸(deoxythymidUNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracilN-glTris:三羥甲基氨基甲烷[Tris(HydroEDTA:乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetTaq:水生棲熱菌(ThernusaquOD:光度密度(opticald用特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)熒光信號曲線判定是否存在蔓越莓或藍(lán)莓成分。針詳見表1。蔓越莓和藍(lán)莓?dāng)U增靶標(biāo)序列參見附錄A。引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長度靶基因內(nèi)參照F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAR:AGGAGCCGTGTGAGATGAP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGA蔓越莓和F:CATTTTAGCTTCAAATGGR:TGAGTCCGTACCATTGAP:FAM-ACGCTTGAAAGATAGCCCAGAAAGTCGA35.2三氯甲烷(氯仿)。5.3異丙醇。5.670%乙醇(體積分?jǐn)?shù))。5.8蛋白酶K(20mg/mL)。5.9實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)混合液：12.5μL反應(yīng)體系包括：1U～2U(Unit,酶學(xué)單位)的Taq酶、1×6儀器設(shè)備6.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。6.2核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。6.3恒溫水浴鍋。6.4離心機(jī)：離心力≥12000g。6.6粉碎裝置。6.7渦旋震蕩器。6.8pH計(jì)。6.10烘箱。7檢測步驟7.1樣品前處理鮮果、冷凍果樣品直接粉碎，6000r/min離心，取沉淀物部分。果干、果醬、蜜餞類樣品先用蒸餾水浸泡清洗3次，再粉碎。果汁樣品取適量15000r/min離心30min,取沉淀部分。7.2DNA提取取50mg~500mg樣品，加入1mLCTAB提取緩沖液，同時(shí)加入0.01倍體積的20mg/mL蛋白酶K,65℃溫育1h～2h,期間不時(shí)震蕩混勻，應(yīng)保證樣品自由懸浮于液體中，必要時(shí)再加入適量CTAB提取緩沖液；取出后12000r/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清至2mL離心管中，加入0.7倍體積的三氯甲烷，劇烈震蕩混勻，12000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min;轉(zhuǎn)移上清至另一滅菌的離心管中，再加入0.7倍體積的三氯甲烷，劇烈震蕩混勻，室溫下12000r/min離心10min;轉(zhuǎn)移上清至干凈離心管中，加入等體積的CTAB沉淀液混勻，室溫沉淀1h;13000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min;棄上清，加入350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀；加入0.8倍體積的異丙醇或2倍體積-20℃冰箱中預(yù)冷的無水乙醇混勻，-20℃放置30min,12000r/min4℃離心10min,棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000g4℃離心10min,棄上清，室溫下晾干。加入50pL～100μL雙蒸水，室溫10min,混勻，4-20℃保存。使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)zbo和A?s0。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)混合液DNA模板(5ng/μL～100ng/μL)滅菌ddH?O5b)40<Ct值<45,則重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次。再次擴(kuò)增后，Ct值<45,應(yīng)查看相應(yīng)的擴(kuò)增曲線并結(jié)合熒檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。6CATTTTAGCTTCAAATGGTTCGTCTCTTTTGATGAATAAATGGTTTCTGGGAATGTTATTTTTCCATATGGGCTCAACCAAGAAGGATATCCAATAATTCCTTCGACTTTCTGGGCTATCTTTCAAGCGTACGATTAAAATTTGGCTTCAAACGGGTCGNNTCN