GBT 35911-2018 偽狂犬病病毒熒光PCR檢測(cè)方法

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I1偽狂犬病病毒熒光PCR檢測(cè)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了偽狂犬病病毒熒光PCR檢測(cè)的操作方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T25172豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。熒光PCR熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timepolymerasechainreaction)Ct值每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(cyclethreshold)DNA脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)Taq酶TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)TE緩沖液Tris-EDTA緩沖液(Tris-EDTAbuffer)PRV偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus)4.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至4℃、離心速度可達(dá)12000r/min以上。4.3組織研磨器或者研缽。4.4普通冰箱：2℃~8℃。4.5普通冰柜：-20℃以下。4.6超低溫冰箱：可控溫至-70℃以下。配備與移液器匹配的吸頭。4.8高壓滅菌鍋。5耗材5.20.2mLPCR薄壁管或八聯(lián)管。26試劑6.1除非另有說(shuō)明，在檢測(cè)中使用的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。6.2DNAzol,商品化DNA抽提試劑，于2℃~8℃保存。6.3無(wú)水乙醇，-20℃預(yù)冷。6.475%乙醇，無(wú)水乙醇和雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷。6.58mmol/LNaOH溶液，配制見(jiàn)附錄A。6.7Taq酶及10倍Taq酶反應(yīng)緩沖液：Taq酶濃度為5U/μL,Taq酶反應(yīng)緩沖液中Mg2+濃度6.9引物和TaqMan探針，其序列見(jiàn)附錄B。6.10偽狂犬病病毒陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品：陽(yáng)性對(duì)照使用滅活疫苗或組織培養(yǎng)滅活毒，-20℃保存?zhèn)溆?；陰性?duì)照可采用健康豬的組織材料。7樣品采集和處理7.1采樣工具7.1.2一次性無(wú)菌采樣拭子7.1.3組織研磨器或者研缽，經(jīng)160-C于熱滅菌2h。7.1.4真空采血管。7.2樣品采集7.2.1血液樣晶采集：用無(wú)菌注射器采集血液，注入含1/104%EDTA溶液的無(wú)菌容器中，充分混勻，編號(hào)備用。7.2.2精液樣品采集。按照GB/T25172的方法采集和保存精液。7.2.3鼻拭子采集：用棉拭子取受檢動(dòng)物鼻腔分泌物，置于2mLPBS緩沖液中備用。7.2.5細(xì)胞培養(yǎng)物：細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次，第3次解凍后，將細(xì)胞培養(yǎng)物置于1.5mL無(wú)DNA酶7.3樣品保存和運(yùn)輸上述采集的樣品可立即用于檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的樣品，在2℃~8℃下保存應(yīng)不超過(guò)24h,-20℃±5℃下應(yīng)不超過(guò)3個(gè)月，-70℃以下可長(zhǎng)期保存。樣品運(yùn)送采用低溫保存進(jìn)行運(yùn)輸，并在規(guī)定溫度下的保存期內(nèi)送達(dá)。7.4樣品處理7.4.1血液和精液樣品無(wú)需進(jìn)行前處理，直接用于核酸提取。7.4.2鼻拭子樣品：充分渦旋震蕩含有鼻拭子的管子1min～3min,棄去拭子后2000r/min離心35min,取上清后用于后續(xù)的核酸提取。心5min,取上清用于后續(xù)的核酸提取。7.4.4細(xì)胞培養(yǎng)物：4000r/min,4℃離心10min,取上清用于后續(xù)的核酸提取。8.1DNA抽提8.1.1在核酸提取區(qū)操作。DNA抽提使用DNAzol手工提取，也可以使用等效的商品化試劑盒提取。8.1.2取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽(yáng)性對(duì)照+陰性對(duì)照，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)8.1.3每管先加入800ADNAzal,再分別加入被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各200pI,顛倒10次混勻，4℃或室溫10000r/min離心10min。4℃或室溫10000r/min離心5min。8.1.5棄上清，沿管璧緩緩加入0.8mL~1ml.75%乙醇，顛倒3次≈6次混勻，4C10000r/min離心5min。反復(fù)洗滌兩次后，將離心管倒扣于吸水紙工。直然晾干或用移液器移去殘液?？煞€(wěn)定保存兩年。8.2熒光PCR檢測(cè)在試劑配制區(qū)進(jìn)行。設(shè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管數(shù)為n,n為待檢樣品數(shù)土陽(yáng)性管數(shù)+陰性管數(shù)，每個(gè)反應(yīng)的體系見(jiàn)附錄C,為了避免移液器取樣損失，建議按m+1個(gè)反應(yīng)進(jìn)行配制。配制反應(yīng)液在冰盒8.2.2反應(yīng)液的分裝將8.2.1中配制的熒光PCR反應(yīng)液充分PCR管置于96孔板上，按順序加樣并做好標(biāo)識(shí)，轉(zhuǎn)移至核酸提取區(qū)在核酸提取區(qū)進(jìn)行。在每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)加入0.2pL的內(nèi)參照質(zhì)粒，并分別加入8.1制備的核酸在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行。將8.2.3中離心后的PCR管放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，設(shè)置探針：5′選擇FAM、8.2.4.2循環(huán)條件設(shè)置與檢測(cè)第一階段，預(yù)反應(yīng)50℃/2min;49.2.2PRV陽(yáng)性對(duì)照：FAM通道Ct值≤30,HEX通道Ct值≤30,ROX通道Ct值≤36,且3個(gè)通道5溶液配制6引物和探針gH-P(探針)5'-FAM-TCGCG