抗生素類藥物的分析

第十六章抗生素類藥物的分析

學(xué)習(xí)要求掌握：抗生素類藥物的類型、結(jié)構(gòu)、質(zhì)量和穩(wěn)定性特點、以及分析方法。熟悉：各類抗生素藥物的有關(guān)物質(zhì)來源、特點和檢查方法。了解：抗生素藥物的體內(nèi)樣品分析方法和臨床監(jiān)測應(yīng)用。。第一節(jié)概述第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素第三節(jié)氨基糖苷類抗生素第四節(jié)四環(huán)素類抗生素第五節(jié)抗生素類藥物中高分子雜質(zhì)的檢查

抗生素(Antibiotics)類藥物:臨床上常用的一類重要藥物;

抗生素的主要是生物合成，經(jīng)過發(fā)酵和提純兩步制得；也有少數(shù)是利用化學(xué)合成或半合成方法制得。ChP2010共收載近300個品種。一、抗生素類藥物的定義和特點

青霉素:1929年,Flemmimg發(fā)現(xiàn);鏈霉素:1943年,賽爾曼?瓦克斯曼

抗生素是生物(包括微生物、植物、動物)在其生命活動中產(chǎn)生的(或并用化學(xué)、生物或生化方法衍生的)，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)的總稱。第一節(jié)概述與化學(xué)合成藥物相比，其結(jié)構(gòu)、組成更復(fù)雜，表現(xiàn)為：1.化學(xué)純度較低:有三多：即同系物多，異構(gòu)體多，降解物多。2.活性組分易發(fā)生變異;3.穩(wěn)定性差。二、抗生素類藥物的分類1.根據(jù)產(chǎn)生抗生素的生物來源分類:細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素、真菌產(chǎn)生的抗生素、放線菌產(chǎn)生的抗生素、高等植物產(chǎn)生的抗生素、動物產(chǎn)生的抗生素；2.根據(jù)抗生素的作用對象分類:抗革蘭氏陽性菌的抗生素、抗革蘭氏陰性菌的抗生素、廣譜抗生素、抗真菌的抗生素、抗腫瘤的抗生素、抗病毒及抗原蟲系昆蟲的抗生素、抗結(jié)核分枝桿菌的抗生素；3.根據(jù)抗生素的作用機(jī)制分類:抑制細(xì)胞壁合成的抗生素、影響細(xì)胞膜功能的抗生素、抑制和干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抗生素、抑制細(xì)胞核酸合成的抗生素、抑制細(xì)菌生物能作用的抗生素；4.根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類:為以下九大類。根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(1)β-內(nèi)酰胺類抗生素(2)四環(huán)類抗生素(3)氨基糖苷類抗生素(4)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(5)多烯大環(huán)類抗生素(6)多肽類抗生素(7)酰胺醇類抗生素(8)抗腫瘤類抗生素(9)其它抗生素三、抗生素類藥物的細(xì)菌耐藥性細(xì)菌耐藥性(bacterialresistance)又稱抗藥性，是指細(xì)菌產(chǎn)生的對抗菌藥不敏感的現(xiàn)象，是細(xì)菌自身生存過程的一種特殊表現(xiàn)形式。

1.耐藥性的種類2.耐藥的機(jī)制四、抗生素藥物的質(zhì)量分析通過鑒別、檢查、含量(效價)測定三個主要方面來判斷其質(zhì)量的優(yōu)劣。分析方法可分為理化方法和生物學(xué)法兩大類。(一)鑒別試驗抗生素類藥物的鑒別試驗主要為理化方法，常用方法有：1.官能團(tuán)的顯色反應(yīng)如

-內(nèi)酰胺環(huán)的羥肟酸鐵反應(yīng)；鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)、坂口反應(yīng)。對于抗生素鹽類，通常鑒別酸根或金屬離子或有機(jī)堿。2.光譜法包括紅外光譜與紫外吸收光譜的鑒別?？股氐募t外光譜分析時需注意，由于抗生素存在多晶現(xiàn)象，有時對照品與供試品圖譜或?qū)φ請D譜不一致，最好用相同溶劑同時重結(jié)晶供試品和對照品，使處于相同晶型情況下再進(jìn)行測定，若多晶效應(yīng)是由于研磨和壓片過程中的晶相轉(zhuǎn)變所致，則應(yīng)采用溶液法試驗。3.色譜法包括TLC和HPLC法，采用對照品或標(biāo)準(zhǔn)品對照法。4.生物學(xué)法是檢查抗生素滅活前后的抑菌能力，并與已知含量的對照品對照后進(jìn)行鑒別，此法已很少應(yīng)用。(二)檢查抗生素類藥物的檢查項目包括：

1.影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項目結(jié)晶性、酸堿度、水分或干燥失重等；

2.控制有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)的檢查項目溶液的澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘渣、重金屬等；

3.與臨床安全性密切相關(guān)的檢查項目異常毒性、熱源或細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌等；

4.其他檢查項目對于多組分抗生素還要進(jìn)行組分分析等(如硫酸慶大霉素的“慶大霉素C組分的測定”)。此外，有些抗生素還規(guī)定“懸浮時間與抽針試驗”(如注射用普魯卡因青霉素)、“聚合物”(如

-內(nèi)酰胺類抗生素)、“雜質(zhì)吸光度”(如四環(huán)素類抗生素)等。(三)含量或效價測定

1.微生物檢定法本法系在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，計算抗生素活性(效價)的方法。

測定方法可分為管碟法和濁度法：

管碟法:瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，比較抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。

濁度法:液體培養(yǎng)基中,抑制作用，測定細(xì)菌濁度值的大小，以測定供試品效價的一種方法。優(yōu)點：靈敏度高、需用量小，測定結(jié)果較直觀；測定原理與臨床應(yīng)用的要求一致，更能確定抗生素的醫(yī)療價值；而且適用范圍廣，較純的精制品、純度較差的制品、已知的或新發(fā)現(xiàn)的抗生素均能應(yīng)用；對同一類型的抗生素不需分離，可一次測定其總效價，是抗生素藥物效價測定的最基本的方法。缺點：操作步驟多，測定時間長，誤差大，理化方法逐漸取代了生物學(xué)法，

但對于分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多組分的抗生素，生物學(xué)法仍然是首選的效價測定方法。

微生物檢定法的優(yōu)缺點2.理化方法

對于提純的產(chǎn)品以及化學(xué)結(jié)構(gòu)已確定的抗生素，能較迅速、準(zhǔn)確地測定其效價，并具有較高的專屬性。不足：官能團(tuán)的特殊化學(xué)反應(yīng)，對含有具同樣官能團(tuán)雜質(zhì)的供試品就不適用。而且當(dāng)該法是利用某一類型抗生素的共同結(jié)構(gòu)部分的反應(yīng)時，所測得的結(jié)果，往往只能代表藥物的總含量，并不一定能代表抗生素的生物效價。

要求測定結(jié)果必須與生物效價吻合。3.抗生素活性表示方法

抗生素的活性以效價單位表示，即指每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。

效價是以抗菌效能(活性部分)作為衡量的標(biāo)準(zhǔn)，效價用單位(U)或微克(

g)表示。各種抗生素的效價基準(zhǔn)是人們?yōu)榱松a(chǎn)科研方便而規(guī)定的，如1mg青霉素鈉定為1670U；1mg慶大霉素定為590U；1mg硫酸卡那霉素定為670U。

一種抗生素有一個效價基準(zhǔn)，同一種抗生素的各種鹽類的效價可根據(jù)其分子量與標(biāo)準(zhǔn)鹽類進(jìn)行換算。例1mg青霉素鉀的單位(U)=1670×356.4/372.5=1598U/mg。第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素

本類抗生素包括青霉素類和頭孢菌素類，它們的分子結(jié)構(gòu)中均含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，因此統(tǒng)稱為β-內(nèi)酰胺類抗生素。

發(fā)展史1929年，弗來明(AlexanderFleming)發(fā)現(xiàn)青霉素。1958年謝漢合成6-氨基青霉烷酸(6-APA)成功。開創(chuàng)了半合成青霉素的時代1961年，頭孢菌素C被發(fā)現(xiàn)，頭孢菌素迅速發(fā)展。80年代:廣譜碳青霉烯類上市。一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)青霉素類的基本結(jié)構(gòu)頭孢菌素的基本結(jié)構(gòu)1.化學(xué)結(jié)構(gòu)：β-內(nèi)酰胺環(huán)側(cè)鏈A：

-內(nèi)酰胺環(huán)B：氫化噻唑環(huán)青霉素類（penicillins）側(cè)鏈A：

-內(nèi)酰胺環(huán)B：氫化噻嗪環(huán)頭孢菌素類（cephalosporins）AB6-APA

7-ACA藥物名稱物理性質(zhì)鑒別檢查含量測定阿莫西林Amoxicillin白色或類白色結(jié)晶性粉末；味微苦。在水中微溶，在乙醇中幾乎不溶。[

]D(水溶液)+290o～+315o。1.TLC或HPLC2.IR1.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；2.阿莫西林聚合物；3.殘留溶劑：丙酮與二氯甲烷；4.水分HPLC法阿莫西林鈉AmoxicillinSodium白色或類白色粉末或結(jié)晶；無臭或微臭，味微苦；有引濕性。在水或乙醇中易溶，在乙醚中不溶。[

]D(水溶液)+240o～+290o。1.TLC或HPLC2.IR3.鈉鹽的鑒別1.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；2.殘留溶劑：乙醇與乙酸甲酯；3.2-乙基己酸；4.水分；5.可見異物；6.不溶性微粒；7.細(xì)菌內(nèi)毒素；8.無菌HPLC法青霉素Ⅴ鉀PhenoxymethylpenicillinPotassium白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末；無臭或微臭，微苦。在水中易溶，在三氯甲烷、乙醚或液體石蠟中幾乎不溶。[

]D(水溶液)+215o～+230o。1.HPLC2.IR3.鉀鹽的鑒別1.吸光度；2.結(jié)晶性；3.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；4.青霉素Ⅴ聚合物；5.水分HPLC法青霉素鈉BenzylpenicillinSodium白色結(jié)晶性粉末；無臭或微有特異性臭；有引濕性；遇酸、堿或氧化劑等即迅速失效，水溶液在室溫放置易失效。在水中極易溶解，在乙醇中溶解，在脂肪油或液狀石蠟中不溶。1.HPLC2.IR3.鈉鹽的鑒別1.吸光度；2.結(jié)晶性；3.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；4.青霉素聚合物；5.可見異物；6.不溶性微粒；7.細(xì)菌內(nèi)毒素；8.無菌HPLC法氨芐西林Ampicillin白色結(jié)晶性粉末；味微苦。在水中微溶，在三氯甲烷、乙醇、乙醚或不揮發(fā)油中不溶；在稀酸溶液或稀堿溶液中溶解。[

]D(水溶液)+280o～+305o。1.TLC或HPLC2.IR1.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；2.N,N-二甲基苯胺：GC；3.水分HPLC法普魯卡因青霉素ProcaineBenzylpenicillin白色微晶性粉末；遇酸、堿或氧化劑等即迅速失效。在甲醇中易溶，在乙醇或三氯甲烷中略溶，在水中微溶。[

]D(水溶液)+280o～+305o。1.TLC或HPLC2.IR1.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；2.青霉素聚合物；3.殘留溶劑：乙酸乙酯與正丁醇；4.水分；5.細(xì)菌內(nèi)毒素；6.無菌HPLC法β-內(nèi)酰胺類抗生素部分原料藥的物理性質(zhì)、鑒別、檢查和含量測定

β-內(nèi)酰胺類抗生素部分原料藥的物理性質(zhì)、鑒別、檢查和含量測定

藥物名稱物理性質(zhì)鑒別檢查含量測定頭孢他啶Ceftazidime白色或類白色結(jié)晶性粉末；無臭或微有特臭。在磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中略溶，在水或甲醇中微溶，在丙酮或三氯甲烷中不溶。E1%1cm(磷酸鹽緩沖液pH6.0)400～430。1.HPLC2.IR1.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；2.頭孢他啶聚合物；3.吡啶：HPLC；4.可見異物；5.不溶性微粒；6.細(xì)菌內(nèi)毒素；7.無菌HPLC法頭孢克洛Cefaclor白色至微黃色粉末或結(jié)晶性粉末，微臭。在水中微溶，在甲醇、乙醇、三氯甲烷或二氯甲烷中幾乎不溶。[

]D(水溶液)+105o～+120o。E1%1cm(水溶液)230～255。1.TLC或HPLC2.IR1.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；2.殘留溶劑：二氯甲烷；3.水分HPLC法頭孢呋辛酯Cefuroximeaxetil白色或類白色粉末；幾乎無臭，味苦。在丙酮中易溶，在三氯甲烷中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在乙醚中微溶，在水中不溶。E1%1cm(甲醇)390～420。1.HPLC2.IR1.結(jié)晶性；2.異構(gòu)體：HPLC；3.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；4.水分HPLC法頭孢拉定Cephradine白色或類白色結(jié)晶性粉末；微臭。在水中略溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中幾乎不溶。[

]D(醋酸鹽緩沖液pH4.6)+80o～+90o。1.TLC或HPLC2.IR1.結(jié)晶性；2.頭孢氨芐：HPLC；3.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；4.頭孢拉定聚合物；5.水分；6.可見異物；7.不溶性微粒；8.細(xì)菌內(nèi)毒素；9.無菌HPLC法頭孢氨芐Cefalexin白色或乳黃色結(jié)晶性粉末；微臭。在水中微溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中不溶。[

]D(水溶液)+149o～+158o。E1%1cm(水溶液)220～245。1.HPLC2.IR1.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；2.水分HPLC法頭孢羥氨芐Cefadroxil白色或類白色結(jié)晶性粉末，有特異臭味。在水中微溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中幾乎不溶。1.三氯化鐵反應(yīng)2.HPLC3.IR1.結(jié)晶性2.有關(guān)物質(zhì)：HPLC3.水分HPLC法頭孢替唑鈉CeftezoleSodium白色至淡黃色結(jié)晶性粉末；無臭，有引濕性。在水中易溶，在甲醇中微溶，在乙醇和乙醚中幾乎不溶。[

]D(水溶液)-5o～-9o。E1%1cm(水溶液)270～300。1.UV2.HPLC3.IR4.鈉鹽的鑒別1.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；2.頭孢替唑聚合物；3.水分；4.可見異物；5.不溶性微粒；6.細(xì)菌內(nèi)毒素；7.無菌HPLC法頭孢噻吩鈉CefalotinSodium白色或類白色的結(jié)晶性粉末；幾乎無臭。在水中易溶，在乙醇中微溶，在三氯甲烷和乙醚中不溶。[

]D(水溶液)+124o～+134o。1.HPLC2.IR3.鈉鹽的鑒別1.吸光度；2.有關(guān)物質(zhì)：HPLC；3.頭孢噻吩聚合物；4.殘留溶劑：乙醇與丙酮；5.2-乙酸己酸；6.水分；7.可見異物；8.不溶性微粒；9.細(xì)菌內(nèi)毒素；10.無菌HPLC法2．性質(zhì)(1)β-內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性：β-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素的結(jié)構(gòu)活性中心，其性質(zhì)活潑，是分子結(jié)構(gòu)中最不穩(wěn)定部分，其穩(wěn)定性與含水量和純度有很大關(guān)系。干燥條件下青霉素和頭孢菌素類藥物均較穩(wěn)定，室溫條件下密封保存可貯存3年以上，但他們的水溶液很不穩(wěn)定，隨pH和溫度而有很大變化。青霉素水溶液在pH6～6.8時較穩(wěn)定。本類藥物在酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子(銅、鉛、汞和銀)或氧化劑等作用下，易發(fā)生水解和分子重排，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞而失去抗菌活性。(2)旋光性：青霉素類分子中含有三個手性碳原子，頭孢菌素類含有兩個手性碳原子，故都具有旋光性。根據(jù)此性質(zhì)，可用于定性和定量分析。(3)酸性與溶解度：青霉素類和頭孢菌素類分子中的游離羧基具有相當(dāng)強(qiáng)的酸性，大多數(shù)青霉素類化合物的pKa在2.5～2.8之間，能與無機(jī)堿或某些有機(jī)堿形成鹽。其堿金屬鹽易溶于水，而有機(jī)堿鹽難溶于水，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑。青霉素的堿金屬鹽水溶液遇酸則析出游離基的白色沉淀。(4)紫外吸收特性：青霉素類分子中的母核部分無共軛系統(tǒng)，但其側(cè)鏈酰胺基上R取代基若有苯環(huán)等共軛系統(tǒng)，則有紫外吸收特征。如青霉素鉀(鈉)的R為芐基，因而其水溶液在264nm波長處具有較強(qiáng)的紫外吸收。而頭孢菌素類母核部分具有O＝C－N－C＝C結(jié)構(gòu)，R取代基具有苯環(huán)等共軛系統(tǒng)，有紫外吸收。100℃

-青霉噻唑?；u胺酸青霉素青霉烯酸青霉噻唑酸青霉酸青霉醛青霉胺圖

青霉素的降解反應(yīng)圖

頭孢噻吩鈉降解產(chǎn)物圖二、鑒別試驗本類藥物的鑒別試驗，現(xiàn)版ChP，USP，BP采用的方法主要為HPLC、IR和TLC法。(一)色譜法(二)光譜法(三)呈色反應(yīng)(四)各種鹽的反應(yīng)(一)色譜法利用比較供試品溶液主峰與對照品溶液主峰的保留時間(tR)是否一致或比較供試品溶液與對照品溶液所顯主斑點的位置和顏色是否相同進(jìn)行鑒別。HPLC法一般都規(guī)定在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致。中國藥典對鑒別試驗中有HPLC法又有TLC法的，規(guī)定可在兩種鑒別方法中選做一種。

(二)光譜法

1.紅外吸收光譜(IR)紅外吸收光譜反映了分子的結(jié)構(gòu)特征，各國藥典對收載的β-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎均采用了本法進(jìn)行鑒別。該類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)羰基的伸縮振動(1750cm-1～1800cm-1)，仲酰胺的氨基、羰基的伸縮振動(3300cm-1，1525cm-1，1680cm-1)、羧酸離子的伸縮振動(1600cm-1，1410cm-1)是該類抗生素共有的特征峰。特征吸收峰歸屬峰位(cm-1)歸屬3600~2600νO-H1780νC=O1690νC=O1585,1480νCOO-1250νC–O圖

阿莫西林的紅外光譜圖(KBr壓片法)2.紫外吸收光譜(UV)本類藥物的紫外光譜鑒別法通常利用最大吸收波長鑒定法：將供試品配成適當(dāng)濃度的溶液，直接測定紫外吸收光譜，根據(jù)其最大吸收波長或最大吸收波長處的吸光度進(jìn)行鑒定。如頭孢唑啉鈉的紫外鑒別法：取本品適量，加水溶解并稀釋制成每1ml中約含16

g的溶液，在272nm的波長處有最大吸收。(三)呈色反應(yīng)1.羥肟酸鐵反應(yīng)青霉素及頭孢菌素在堿性中與羥胺作用，β-內(nèi)酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。2.類似肽鍵的反應(yīng)本類藥物具有-CONH-結(jié)構(gòu)，一些取代基有

-氨基酸結(jié)構(gòu)，可顯雙縮脲和茚三酮反應(yīng)。3.其他呈色反應(yīng)側(cè)鏈含有-C6H5-OH基團(tuán)時，能與重氮苯磺酸試液產(chǎn)生偶合反應(yīng)而呈色。此外，本類藥物還可與變色酸-硫酸、硫酸-甲醛等試劑反應(yīng)而呈色。(四)各種鹽的反應(yīng)鉀、鈉離子的火焰反應(yīng)青霉素類、頭孢菌素類藥品中，許多制成鉀鹽或鈉鹽供臨床使用，因而可利用鉀、鈉離子的火焰反應(yīng)進(jìn)行鑒別。如阿莫西林鈉、頭孢尼西鈉、頭孢西丁鈉、頭孢曲松鈉等鈉離子的鑒別；青霉素Ⅴ鉀、青霉素鉀等鉀離子的鑒別。三、檢查

本類抗生素的雜質(zhì)主要有高分子聚合物，有關(guān)物質(zhì)，異構(gòu)體等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用測定雜質(zhì)的吸光度來控制雜質(zhì)量的。此外，有的還進(jìn)行結(jié)晶性、抽針與懸浮時間等有效性試驗，部分抗生素還檢查有機(jī)溶劑殘留量。(一)聚合物(二)有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體(三)吸光度(四)有機(jī)溶劑(五)結(jié)晶性四、含量測定

各國藥典收載的青霉素類和頭孢菌素類的含量測定除少數(shù)幾個樣品采用抗生素微生物檢定法測定外，大多采用HPLC測定方法。高效液相色譜法是近年來發(fā)展最快的方法，它能有效地分離供試品中可能存在的降解產(chǎn)物、未除盡的原料及中間體等雜質(zhì)，并能準(zhǔn)確定量，適用于本類藥物的原料、各種制劑及生物樣本的分析測定。ChP2010收載的本類抗生素中除磺芐西林鈉采用微生物檢定法測定含量外，其余均采用HPLC法測定含量。

ChP2010頭孢克洛含量的HPLC測定法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸二氫鉀溶液(取磷酸二氫鉀6.8g，加水溶解并稀釋成1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.4)-乙腈(928?)為流動相；檢測波長為254nm。取頭孢克洛對照品及頭孢克洛

-3-異構(gòu)體對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1ml中分別含頭孢克洛及頭孢克洛

-3-異構(gòu)體約0.2mg的混合溶液，取20

l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，頭孢克洛峰與頭孢克洛

-3-異構(gòu)體峰的分離度應(yīng)符合要求。測定法取本品約20mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20

l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取頭孢克洛對照品適量，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計算出供試品中C15H14ClN3O4S的含量。規(guī)定按無水物計算，含C15H14ClN3O4S不得少于95.0%。USP34Cefaclor(頭孢克洛)Assay—Mobilephase—Dissolve1gofsodium1-pentanesulfonateinamixtureof780mLofwaterand10mLoftriethylamine.AdjustwithphosphoricacidtoapHof2.5±0.1,add220mLofmethanol,andmix..Standardpreparation—Transferabout15mgofUSPCefaclorRS,accuratelyweighed,toa50-mLvolumetricflask,dilutewithMobilephasetovolume,andmix.Sonicatebriefly,ifnecessary,toachievedissolution,andavoidheatingthesolution.[note—UsethisStandardpreparationwithin8hoursifstoredatroomtemperature,orwithin20hoursifstoredunderrefrigeration.]Assaypreparation—Transferabout15mgofCefaclor,accuratelyweighed,toa50-mLvolumetricflask,dilutewithMobilephasetovolume,andmix.Sonicatebriefly,ifnecessary,toachievedissolution,andavoidheatingthesolution.[note—UsethisAssaypreparationwithin8hoursifstoredatroomtemperature,orwithin20hoursifstoredunderrefrigeration.]Resolutionsolution—PrepareasolutioninMobilephasecontainingabout0.3mgofcefaclorand0.3mgofUSPCefaclor,Delta-3IsomerRSpermL.Chromatographicsystem—Theliquidchromatographisequippedwitha265-nmdetectoranda4.6-mm×25-cmcolumncontaining5-μmpacking.Theflowrateisabout1.5mLperminute.ChromatographtheResolutionsolution,andrecordtheresponsesasdirectedforProcedure:therelativeretentiontimesforcefaclorandcefaclor,delta-3isomerareabout0.8and1.0,theresolution,R,betweenthecefaclorpeakandthecefaclor,delta-3isomerpeakisnotlessthan2.5,thetailingfactorisnotmorethan1.5,andtherelativestandarddeviationforreplicateinjectionsisnotmorethan2%.Procedure—[note—Usepeakareaswherepeakresponsesareindicated.]Separatelyinjectequalvolumes(about20μL)oftheStandardpreparationandtheAssayintothechromatograph,recordthechromatograms,andmeasuretheresponsesforthemajorpeaks.Calculatethepotency,inμgpermg,ofcefaclor(C15H14ClN3O4S)ineachmgoftheCefaclortakenbytheformula:(WS/WU)(P)(rU/rS)inwhichWSandWUaretheweights,inmg,ofUSPCefaclorRSandofCefaclortakentopreparetheStandardpreparationandtheAssaypreparation,respectively;Pisthedesignatedpotency,inμgofcefaclor(C15H14ClN3O4S)permg,ofUSPCefaclorRS;andrUandrSarethepeakresponsesofthecefaclorpeaksobtainedfromtheAssaypreparationandtheStandardpreparation,respectively.Cefaclorhasapotencyofnotlessthan950μgandnotmorethan1020μgofC15H14ClN3O4Spermg,calculatedontheanhydrousbasis.USP（2009）版與Ch.P方法相比，USP方法更為嚴(yán)謹(jǐn)。第三節(jié)氨基糖苷類抗生素氨基糖苷類抗生素抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)都是以堿性環(huán)己多元醇為苷元，與氨基糖縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素(AminoglycosidesAntibiotics)。主要有硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、鹽酸大觀霉素、硫酸小諾霉素、硫酸巴龍霉素、硫酸卡那霉素、硫酸西索霉素、硫酸阿米卡星、硫酸依替米星、硫酸核糖霉素、硫酸新霉素等，它們的抗菌譜和化學(xué)性質(zhì)都有共同之處。硫酸鏈霉素StreptomycinSulfate硫酸巴龍霉素ParomomycinSulfate硫酸慶大霉素Gentamycinsulfate硫酸奈替米星NetilmicinSulfate

一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)藥物名稱物理性質(zhì)鑒別檢查含量測定硫酸鏈霉素StreptomycinSulfate白色或類白色的粉末；無臭或幾乎無臭，味微苦；有引濕性。在水中易溶，在乙醇或三氯甲烷中不溶。1.坂口反應(yīng)2.麥芽酚反應(yīng)3.IR4.硫酸鹽的鑒別反應(yīng)1.硫酸鹽EDTA滴定法2.有關(guān)物質(zhì)：HPLC(蒸發(fā)光散射檢測器);3.可見異物;4.不溶性微粒;5.異常毒性;6.細(xì)菌內(nèi)毒素;7.無菌微生物檢定法硫酸巴龍霉素ParomomycinSulfate白色或微黃色的粉末；無臭，引濕性極強(qiáng)，遇光易變色。在水中易溶，在甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。[

]D(水溶液)+50o～+55o。1.TLC或HPLC2.IR3.硫酸鹽的鑒別反應(yīng)巴龍霉素組分：HPLC(蒸發(fā)光散射檢測器)微生物檢定法硫酸慶大霉素Gentamycinsulfate白色或類白色的粉末；無臭；有引濕性。在水中易溶，在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。[

]D(水溶液)+107o～+121o。1.TLC或HPLC2.IR3.硫酸鹽的鑒別反應(yīng)1.硫酸鹽：HPLC;2.慶大霉素C組分HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器;3.有關(guān)物質(zhì)：HPLC(蒸發(fā)光散射檢測器);4.水分;5.細(xì)菌內(nèi)毒素微生物檢定法硫酸奈替米星NetilmicinSulfate白色或類白色的粉末或疏松塊狀物；無臭，味微苦；有引濕性。在水中易溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中不溶。[

]D(水溶液)+88o～+96o。1.HPLC2.硫酸鹽的鑒別反應(yīng)1.硫酸鹽：HPLC’2.有關(guān)物質(zhì)：HPLC(蒸發(fā)光散射檢測器);3.水分;4.可見異物;5.不溶性微粒;6.細(xì)菌內(nèi)毒素微生物檢定法氨基糖苷類抗生素部分原料藥的物理性質(zhì)、鑒別、檢查和含量測定

(一)結(jié)構(gòu)鏈霉素巴龍霉素慶大霉素(二)性質(zhì)氨基糖苷類抗生素的分子結(jié)構(gòu)具有一些共同或相似處。慶大霉素、巴龍霉素、奈替米星等分子中氨基環(huán)醇(脫氧鏈霉胺)結(jié)構(gòu)與鏈霉素中鏈霉胍相近；D-核糖與鏈霉糖相似；胺基己糖(D-葡萄糖胺)結(jié)構(gòu)與鏈霉素中N-甲基葡萄糖胺相似，因此，他們具有相似的性質(zhì)。1.溶解度與堿性該類抗生素的分子中含有多個羥基(故也稱多羥基抗生素)和堿性基團(tuán)(分子式中有*號處)，同屬堿性、水溶性抗生素，能與礦酸或有機(jī)酸成鹽，臨床上應(yīng)用的主要為硫酸鹽。他們的硫酸鹽易溶于水，不溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚等有機(jī)溶劑。2.旋光性本類抗生素分子結(jié)構(gòu)中含有多個氨基糖，具有旋光性。如ChP2010二部中硫酸奈替米星的比旋度為+88

～+96

(水溶液)；硫酸慶大霉素的比旋度為+107

～+121

(水溶液)；硫酸巴龍霉素的比旋度為+50

～+55

(水溶液)。

3.苷的水解與穩(wěn)定性含有二糖胺結(jié)構(gòu)的抗生素(如鏈霉素、巴龍霉素、新霉素)，分子中氨基葡萄糖與鏈霉糖或D-核糖之間的苷鍵較強(qiáng)，而鏈霉胍與鏈霉雙糖胺(苷元與二糖胺)間的苷鍵結(jié)合較弱。一般的化學(xué)反應(yīng)只能將他們分解為一分子苷元和一分子雙糖。鏈霉素的硫酸鹽水溶液，一般以pH5~7.5最為穩(wěn)定，過酸或過堿條件下易水解失效。在酸性條件下，鏈霉素水解為鏈霉胍和鏈霉雙糖胺，進(jìn)一步水解則得N-甲基-L-葡萄糖胺；堿性也能使鏈霉素水解為鏈霉胍及鏈霉雙糖胺，并使鏈霉糖部分發(fā)生分子重排，生成麥芽酚(maltol)，這一性質(zhì)為鏈霉素所特有，可用于鑒別和定量。硫酸慶大霉素、硫酸奈替米星等對光、熱、空氣均較穩(wěn)定，水溶液亦穩(wěn)定，pH2～12時，100℃加熱30分鐘活性無明顯變化。4.紫外吸收光譜鏈霉素在230nm處有紫外吸收。慶大霉素、奈替米星等無紫外吸收。二、鑒別試驗

(一)茚三酮反應(yīng)(二)Molisch試驗(三)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)(Elson-Morgan反應(yīng))(四)麥芽酚(Maltol)反應(yīng)(五)坂口(Sakaguchi)反應(yīng)(六)硫酸鹽反應(yīng)(七)色譜法(八)光譜法(一)茚三酮反應(yīng)

本類抗生素為氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具有羥基胺類和

-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍(lán)紫色化合物。中國藥典采用本法鑒別硫酸小諾霉素及其制劑。硫酸小諾霉素的茚三酮反應(yīng)鑒別法：取本品約5mg，加水1ml溶解后，加0.1%茚三酮的水飽和正丁醇溶液1ml與吡啶0.5ml，在水浴中加熱5分鐘，即呈紫藍(lán)色。

(二)Molisch試驗具有五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)的氨基糖苷類抗生素經(jīng)酸水解后，在鹽酸(或硫酸)作用下脫水生成糠醛(五碳糖)或羥甲基糠醛(六碳糖)。這些產(chǎn)物遇

-萘酚或蒽酮呈色。

阿米卡星的蒽酮呈色鑒別：取本品約10mg，加水1ml溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即顯藍(lán)紫色。

(三)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)(Elson-Morgan反應(yīng))本類藥物經(jīng)水解，產(chǎn)生葡萄糖胺衍生物，如鏈霉素中的N-甲基葡萄糖胺，硫酸新霉素、硫酸巴龍霉素中的D-葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物(I)，與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液(Ehrlich試劑)反應(yīng)，生成櫻桃紅色縮合物(II)。

硫酸新霉素的N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)鑒別：取本品約10mg，加水1ml溶解后，加鹽酸溶液(9→100)2ml，在水浴中加熱10分鐘，加8%氫氧化鈉溶液2ml與2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加熱5分鐘，冷卻后，加對二甲氨基苯甲醛試液1ml，即呈櫻桃紅色。(四)麥芽酚(Maltol)反應(yīng)

此為鏈霉素的特征反應(yīng)。鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴(kuò)大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍生成麥芽酚(

-甲基-

-羥基-

-吡喃酮)，麥芽酚與高鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。

硫酸鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)鑒別：取本品約20mg，加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液0.3ml，置水浴上加熱5分鐘，加硫酸鐵銨溶液(取硫酸鐵銨0.1g，加0.5mol/L硫酸溶液5ml使溶解)0.5ml，即呈紫紅色。(五)坂口(Sakaguchi)反應(yīng)此為鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍的特有反應(yīng)。本品水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍。鏈霉胍和8-羥基喹啉(或

-萘酚)分別同次溴酸鈉反應(yīng)，其各自產(chǎn)物再相互作用生成橙紅色化合物。

反應(yīng)原理

硫酸鏈霉素的坂口反應(yīng)鑒別：取本品約0.5mg，加水4ml溶解后，加氫氧化鈉試液2.5ml與0.1%8-羥基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至約15℃，加次溴酸鈉試液3滴，即顯橙紅色。(六)硫酸鹽反應(yīng)本類藥物多為硫酸鹽，因此，各國藥典都將硫酸根的鑒定作為鑒別這類抗生素的一個方法。

(七)色譜法1.薄層色譜法ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用TLC法對本類抗生素進(jìn)行鑒別。多以硅膠為薄層板，三氯甲烷-甲醇-濃氨水為展開劑，茚三酮或碘蒸氣為顯色劑。2.高效液相色譜法本類藥物也可根據(jù)組分檢查或含量測定項下HPLC方法，通過比較供試品溶液和對照品溶液的色譜圖進(jìn)行鑒別。

ChP硫酸慶大霉素注射液的TLC鑒別：取本品與硫酸慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加水制成每1ml中含2.5mg的溶液，作為供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板(臨用前于105℃活化2小時)上；另取三氯甲烷-甲醇-氨溶液(1:1:1)混合振搖，放置1小時，分取下層混合液為展開劑，展開，取出于20～25℃晾干，置碘蒸氣中顯色，供試品溶液所顯主斑點數(shù)、位置和顏色應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品溶液斑點數(shù)、位置和顏色相同。BP(2010)對硫酸鏈霉素注射液的鑒別方法如下：

Carryoutthemethodforthin-layerchromatography,usingasilicagelprecoatedplate(Mercksilicagel60platesaresuitable)andasthemobilephasethelowerlayerobtainedbyshakingtogetherequalvolumesof13.5Mammonia,chloroformandmethanolandallowingtoseparate.Applyseparatelytotheplate(1)avolumeoftheinjectioncontainingtheequivalentof30μgofgentamicinand(2)0.1mgofgentamicinsulphateBritishPharmacopoeiaChemicalReferenceSubstancedissolvedinavolumeofwaterequaltothevolumeoftheinjectionused.Afterremovaloftheplate,allowittodryinair,spraywithninhydrinsolutionR1(Dissolve1.0gofninhydrinin50mlofethanol(96%)andadd10mlofglacialaceticacid.)andheatat105°for2minutes.Thethreeprincipalspotsinthechromatogramobtainedwithsolution(1)correspondtothethreeprincipalspotsinthechromatogramobtainedwithsolution(2).(八)光譜法1.紅外吸收光譜中國藥典和英國藥典均采用紅外光譜法鑒別本類藥物，如硫酸慶大霉素、硫酸巴龍霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿米卡星、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素等。2.紫外吸收光譜本類藥物多無紫外吸收，故其鑒別試驗中很少采用紫外法。但BP2010利用這一性質(zhì)，采用紫外法對慶大霉素進(jìn)行鑒別，

硫酸慶大霉素的UV鑒別：取硫酸慶大霉素10mg，加水1ml和40%硫酸溶液5ml；在水浴中加熱100分鐘，冷卻，用水稀釋至25ml。取該溶液進(jìn)行紫外掃描，在240nm～330nm范圍內(nèi)應(yīng)無最大吸收。三、有關(guān)物質(zhì)及組分分析(一)有關(guān)物質(zhì)檢查(二)組分測定(三)硫酸鹽檢查(一)有關(guān)物質(zhì)檢查現(xiàn)版各國藥典對本類抗生素的有關(guān)物質(zhì)檢查主要采用TLC和HPLC法。(二)組分測定本類抗生素多為同系物組成的混合物，同系物的效價、毒性各不相同，為保證藥品的質(zhì)量，必須控制各組分的相對含量，如ChP對硫酸慶大霉素、硫酸小諾霉素等規(guī)定了組分分析。

慶大霉素C1、C2、C1a對微生物的活性無明顯差異，但其毒副作用和耐藥性有差異，導(dǎo)致各組分的多少影響產(chǎn)品的效價和臨床療效。因此中、英、美、日等國藥典均規(guī)定控制各組分的相對百分含量。ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用高效液相色譜法測定慶大霉素C各組分的含量。慶大霉素?zé)o紫外吸收，當(dāng)采用紫外檢測器檢測時，需進(jìn)行衍生化處理。由于其具有強(qiáng)極性和水溶性，為獲得理想的色譜結(jié)果，可采用蒸發(fā)光散射檢測器或利用慶大霉素C組分結(jié)構(gòu)中的氨基與鄰苯二醛(o-phthaldehyde，OPA)、巰基醋酸在pH10.4的硼酸鹽緩沖液中反應(yīng)，生成1-烷基-2-烷基硫代異吲哚衍生物，在330nm波長處有強(qiáng)吸收。ChP慶大霉素中慶大霉素C組分的HPLC檢測：ChP采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測慶大霉素中慶大霉素C組分：

USP慶大霉素中慶大霉素C組分的衍生化紫外檢測HPLC測定法：

BP慶大霉素中慶大霉素C組分的HPLC柱后衍生化法電化學(xué)檢測測定法：(三)硫酸鹽檢查

本類抗生素臨床應(yīng)用的主要為硫酸鹽，各國藥典規(guī)定EDTA絡(luò)合滴定法或HPLC法測定硫酸鹽含量，作為組分分析。硫酸卡那霉素中硫酸鹽測定方法(EDTA絡(luò)合滴定法)：取本品約0.18g，精密稱定，加水100ml使溶解，加濃氨溶液調(diào)節(jié)pH值至11后，精密加氯化鋇滴定液(0.1mol/L)10ml、酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mol/L)滴定，注意保持滴定過程中的pH值為11，滴定至紫色開始消褪，加乙醇50ml，繼續(xù)滴定至藍(lán)紫色消失，并將滴定結(jié)果用空白試驗進(jìn)行校正。每1ml氯化鋇滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于9.606mg，本品含硫酸鹽的量按無水物計算應(yīng)為23.0%～26.0%。硫酸依替米星中硫酸鹽測定方法(HPLC法)：精密量取硫酸滴定液適量，用水定量稀釋制成每1ml中約硫酸鹽(SO4)0.075mg、0.15mg和0.30mg的溶液作為對照溶液(1)、(2)、(3)。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(pH值范圍0.8～8.0)；以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇(84∶16)為流動相；流速為每分鐘0.5ml；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測(參考條件：漂移管溫度100

C，載氣流速為每分鐘2.6L)，取依替米星和奈替米星對照品各適量，加水溶解并稀釋制成每1ml中各0.2mg的混合溶液，取20

l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，依替米星峰和奈替米星峰的分離度應(yīng)大于1.2，連續(xù)5次進(jìn)樣，依替米星峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。精密量取對照溶液(1)、(2)、(3)各20

l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度的對數(shù)值與相應(yīng)的峰面積的對數(shù)值計算線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不小于0.99；另精密稱取本品適量，加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.5mg的溶液，作為供試品溶液，同法測定，用線性回歸方程計算供試品中硫酸鹽的含量。按無水物計算應(yīng)為23.0%～26.0%。四、含量測定

氨基糖苷類抗生素的效價測定主要有微生物檢定法和HPLC法。氨基糖苷類抗生素的HPLC測定法可分為離子交換(酸性條件下在陽離子交換柱上分離)、離子對(以烷基磺酸鹽為反離子)和反相HPLC法，由于本類抗生素多數(shù)無紫外吸收，不能直接用紫外或熒光檢測器，需進(jìn)行柱前或柱后衍生化，或采用電化學(xué)檢測器、蒸發(fā)光檢測器檢測。ChP2010采用HPLC-蒸發(fā)光散射法測定硫酸卡那霉素、硫酸依替米星等藥物的含量。第四節(jié)四環(huán)素類抗生素四環(huán)素類抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，都具有四個并苯或萘并萘環(huán)構(gòu)成，故統(tǒng)稱為四環(huán)素類(tetracyclines)抗生素。表

四環(huán)素類抗生素原料藥的結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)藥物名稱RR’R”R”’物理性質(zhì)鹽酸土霉素OxytetracyclineHydrochlorideHOHCH3OH黃色結(jié)晶性粉末；無臭，有引濕性；在日光下顏色變暗，在堿溶液中易破壞失效。在水中易溶，在甲醇或乙醇中略溶，在三氯甲烷或乙醚中不溶。[

]D((9→1000)鹽酸水溶液)-188o～-200o。鹽酸四環(huán)素TetracyclineHydrochlorideHOHCH3H黃色結(jié)晶性粉末；無臭，味苦；略有引濕性；遇光色漸變深，在堿性溶液中易破壞失效。在水中溶解，在乙醇中略溶，在三氯甲烷或乙醚中不溶。[

]D(0.0mol/L鹽酸溶液)-240o～-258o。鹽酸多西環(huán)素DoxycyclineHydrochlorideHHCH3OH淡黃色至黃色結(jié)晶性粉末；無臭，味苦。在水或甲醇中易溶，在乙醇或丙酮中微溶，在三氯甲烷中幾乎不溶。[

]D(鹽酸溶液(9→1000)的甲醇溶液(1→100))-105o～-120o。鹽酸米諾環(huán)素MinocyclineHydrochlorideN(CH3)2HHH黃色結(jié)晶性粉末；無臭，味苦；有引濕性。在甲醇中溶解，在水中略溶，在乙醇微溶，在乙醚中幾乎不溶。鹽酸金霉素ChlortetracyclineHydrochlorideClOHCH3H金黃色或黃色結(jié)晶；無臭，味苦；遇光色漸變暗。在水或乙醇中微溶,在丙酮、乙醚或三氯甲烷中幾乎不溶[

]D(水溶液)-235o～-250o。鹽酸美他環(huán)素MetacyclineHydrochlorideH=CH2OH黃色結(jié)晶性粉末；無臭，味苦。在水或甲醇中略溶，在三氯甲烷中不溶。一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

表ChP2010收載的四環(huán)素類抗生素原料藥的分析方法藥物鑒別檢查含量測定鹽酸土霉素1.與硫酸反應(yīng)2.TLC或HPLC3.氯化物的鑒別1.雜質(zhì)吸光度2.有關(guān)物質(zhì)（HPLC）3.水分HPLC法鹽酸四環(huán)素1.與硫酸、三氯化鐵反應(yīng)2.HPLC3.IR4.氯化物的鑒別1.雜質(zhì)吸光度2.有關(guān)物質(zhì)（HPLC）3.熱原4.無菌HPLC法鹽酸多西環(huán)素1.HPLC2.UV3.IR4.氯化物的鑒別1.雜質(zhì)吸光度2.有關(guān)物質(zhì)(HPLC)3.乙醇（GC）4.水分HPLC法鹽酸米諾環(huán)素1.HPLC2.IR3.氯化物的鑒別1.結(jié)晶性2.有關(guān)物質(zhì)（HPLC）3.水分HPLC法鹽酸金霉素1.與硫酸反應(yīng)2.HPLC3.IR4.氯化物的鑒別1.雜質(zhì)吸光度2.有關(guān)物質(zhì)（HPLC）HPLC法鹽酸美他環(huán)素1.UV2.HPLC3.IR4.氯化物的鑒別1.雜質(zhì)吸光度2.有關(guān)物質(zhì)（HPLC）HPLC法

(二)性質(zhì)1.酸堿性與溶解度本類抗生素的母核上C4位上的二甲氨基[-N(CH3)2]顯弱堿性；C10位上的酚羥基(-OH)和兩個含有酮基和烯醇基的共軛雙鍵系統(tǒng)(式中虛線內(nèi)所示部分)顯弱酸性，故四環(huán)素類抗生素是兩性化合物。遇酸及堿，均能生成相應(yīng)的鹽，臨床上多應(yīng)用鹽酸鹽。這類抗生素是結(jié)晶性物質(zhì)，具引濕性。其鹽酸鹽易溶于水，并溶于堿或酸性溶液中，而不溶于三氯甲烷、乙醚等有機(jī)溶劑。四環(huán)素類抗生素的游離堿在水中的溶解度很小，其溶解度與溶液的pH值有關(guān)，在pH4.5～7.2之間時難溶于水；當(dāng)pH值高于8或低于4時，水中溶解度增加。其鹽類在水中會水解，當(dāng)溶液濃度較大時，會析出游離堿。2.旋光性四環(huán)素類抗生素分子中具有不對稱碳原子，因此有旋光性，可用于定性、定量分析。各國藥典測定該類抗生素的比旋度，如中國藥典規(guī)定鹽酸土霉素在鹽酸(9→1000)溶液中的比旋度為-188

～-200

；鹽酸四環(huán)素的比旋度為-240

～-258

(0.01mol/L鹽酸溶液)。鹽酸多西環(huán)素的比旋度為-105

～-120

[鹽酸溶液(9→1000)的甲醇溶液(1→100)]。3.紫外吸收和熒光性質(zhì)本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光區(qū)有吸收，如中國藥典中鹽酸多西環(huán)素的甲醇溶液在269nm和353nm的波長處有最大吸收，在234nm和296nm的波長處有最小吸收。鹽酸美他環(huán)素的水溶液在345nm、282nm和353nm的波長處有最大吸收，在264nm和222nm的波長處有最小吸收。這些抗生素在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，它們的降解產(chǎn)物也具有熒光。如：鹽酸土霉素經(jīng)酸性降解后，在紫外光下呈綠色熒光；鹽酸金霉素經(jīng)堿降解后在紫外光下呈藍(lán)色熒光；鹽酸土霉素經(jīng)堿降解后呈綠色熒光，加熱，熒光轉(zhuǎn)為藍(lán)色；鹽酸四環(huán)素經(jīng)堿降解后呈黃色熒光，可用于區(qū)別不同的四環(huán)素類抗生素。利用這一性質(zhì)，在TLC鑒別法中常用于斑點檢出。4.穩(wěn)定性四環(huán)素類抗生素對各種氧化劑(包括空氣中氧在內(nèi))、酸、堿都是不穩(wěn)定的。干燥的四環(huán)素類游離堿和他們的鹽類避光條件下保存均較穩(wěn)定，但其水溶液隨pH的不同會發(fā)生差向異構(gòu)化、降解等反應(yīng)，尤其是堿性水溶液特別容易氧化，顏色很快變深，形成色素。(1)差向異構(gòu)化性質(zhì)：四環(huán)素類抗生素在弱酸性(pH2.0～6.0)溶液中會發(fā)生差向異構(gòu)化。這個反應(yīng)是由于A環(huán)上手性碳原子C4構(gòu)型的改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素類。反應(yīng)是可逆的，達(dá)到平衡時溶液中差向化合物的含量可達(dá)40%～60%。四環(huán)素、金霉素很容易差向異構(gòu)化，產(chǎn)生差向四環(huán)素(4-epitetracycline，ETC)和差向金霉素(具有藍(lán)色熒光)，其抗菌性能極弱或完全消失。而土霉素、多西環(huán)素、美他環(huán)素由于C5上的羥基和C4上的二甲氨基形成氫鍵，因而較穩(wěn)定，C4上不易發(fā)生差向異構(gòu)化。某些陰離子如磷酸根、枸櫞酸根、醋酸根離子的存在，可加速這種異構(gòu)化反應(yīng)的進(jìn)行。(2)降解性質(zhì)：

酸性降解在酸性條件下(pH﹤2)，特別是在加熱情況下，四環(huán)素類抗生素C6上的醇羥基和C5a上的氫發(fā)生反式消去反應(yīng)生成脫水四環(huán)素(anhydrotetracycline，ATC)。堿性降解在堿性溶液中，由于氫氧離子的作用，C6上的羥基形成氧負(fù)離子，向C11發(fā)生分子內(nèi)親核進(jìn)攻，經(jīng)電子轉(zhuǎn)移，C環(huán)破裂，生成無活性的具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體。脫水四環(huán)素亦可形成差向異構(gòu)體，稱差向脫水四環(huán)素(4-epianhydro-tetracycline，EATC)。二、鑒別試驗1.高效液相色譜法2.薄層色譜法3.IR光譜法4.UV光譜法5.顯色法1.高效液相色譜法ChP和USP等，均采用高效液相色譜法鑒別鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸金霉素等。在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致。

2.薄層色譜法由于薄層色譜法設(shè)備簡單，操作容易，分離效果亦佳，ChP2010、BP2010都采用本法鑒別四環(huán)素類抗生素。四環(huán)素類抗生素的薄層色譜法多采用硅藻土作載體，為了獲得較好的分離，在粘合劑中加有甘油以及中性的EDTA緩沖液。EDTA可以克服因痕量金屬離子存在而引起的斑點拖尾現(xiàn)象。

3.IR光譜法中國藥典收載的四環(huán)素類抗生素中，除土霉素外均采用了紅外光譜法鑒別。

4.UV光譜法本類藥物的紫外鑒別法多以甲醇或水溶液為溶劑，中國藥典規(guī)定最大吸收波長和最小吸收波長。ChP2010鹽酸美他環(huán)素和鹽酸多西環(huán)素的UV鑒別：鹽酸美他環(huán)素10

g/ml的水溶液在345nm、282nm和353nm的波長處有最大吸收，在264nm和222nm的波長處有最小吸收。鹽酸多西環(huán)素20

g/ml的甲醇溶液在269nm和353nm的波長處有最大吸收，在234nm和296nm的波長處有最小吸收。

5.顯色法

四環(huán)素類抗生素遇硫酸立即產(chǎn)生顏色，不同的四環(huán)素類抗生素具有不同的顏色，有的有顏色變化，據(jù)此可區(qū)別各種四環(huán)素類抗生素。本類抗生素分子結(jié)構(gòu)中具有酚羥基，遇三氯化鐵試液即呈色。

表

四環(huán)素類抗生素的呈色反應(yīng)名稱濃硫酸呈色三氯化鐵呈色鹽酸四環(huán)素紫紅色→黃色紅棕色鹽酸金霉素蘭色，橄欖綠色→金黃色或棕黃色深褐色鹽酸土霉素深朱紅色→黃色橙褐色鹽酸多西環(huán)素黃色褐色鹽酸美他環(huán)素橙紅色鹽酸米諾環(huán)素亮黃色→淡黃色鹽酸地美環(huán)素紫色→黃色(一)有關(guān)物質(zhì)四環(huán)素類抗生素中的有關(guān)物質(zhì)主要是指在生產(chǎn)和貯存過程中易形成的異構(gòu)雜質(zhì)、降解雜質(zhì)(ETC、ATC、EATC)等。ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用HPLC法控制四環(huán)素類抗生素中的有關(guān)物質(zhì)。

三、雜質(zhì)檢查

(二)雜質(zhì)吸光度四環(huán)類抗生素多為黃色結(jié)晶性粉末；而異構(gòu)體、降解產(chǎn)物顏色較深，如差向四環(huán)素為淡黃色，因其不穩(wěn)定又易變成黑色；脫水四環(huán)素為橙紅色；差向脫水四環(huán)素為磚紅色。此類雜質(zhì)的存在均可使四環(huán)素類抗生素的外觀色澤變深。因此和BP2010均規(guī)定了一定溶劑、一定濃度、一定波長下雜質(zhì)吸光度的限量。ChP2010規(guī)定的鹽酸四環(huán)素的雜質(zhì)吸光度測定方法：取本品，在20～25℃時加0.8%氫氧化鈉溶液制成每1ml中含10mg的溶液，置4cm的吸收池中，自加0.8%氫氧化鈉溶液起5分鐘時，在530nm的波長處測定，其吸光度不得過0.12(供注射用)。(三)殘留有機(jī)溶劑一些四環(huán)素類藥物需要控制殘留有機(jī)溶劑，如ChP和BP規(guī)定鹽酸多西環(huán)素檢查乙醇，限量均為4.3%～6.0%。

四、含量測定四環(huán)素類抗生素的含量測定，目前各國藥典多采用高效液相色譜法。鹽酸四環(huán)素的HPLC