(高清版)GB∕T 37746-2019 草魚(yú)呼腸孤病毒三重RT-PCR檢測(cè)方法

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T37746—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC156)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所。GB/T37746—2019相關(guān)專(zhuān)利的使用。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對(duì)于該專(zhuān)利的真實(shí)性、有效性和范圍無(wú)任何立場(chǎng)。該專(zhuān)利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)保證，他愿意同任何申請(qǐng)人在合理且無(wú)歧視的條款和條件下，就專(zhuān)利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專(zhuān)利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過(guò)以下聯(lián)系方式獲得：專(zhuān)利持有人：中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所地址：廣州市荔灣區(qū)西望興漁路1號(hào)珠江水產(chǎn)研究所請(qǐng)注意除上述專(zhuān)利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。1GB/T37746—2019草魚(yú)呼腸孤病毒三重RT-PCR檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了3種不同基因型草魚(yú)呼腸孤病毒的三重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于對(duì)草魚(yú)的3種基因型呼腸孤病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè)與分離株的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SC/T7103水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DEPC:焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate)dNTP:脫氧核苷酸三磷酸(deoxy-riboncleosidetriphosphate)GCRV:草魚(yú)呼腸孤病毒(grasscarpreovirus)M-MLVRT:莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(moloneymurineleukemiavirusreversetran-scriptase)PBS:磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersolution)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse-transcriptionpolymerasechainaction)TaqDNApolymerase:TaqDNA聚合酶三重RT-PCR:三重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(triplexreversetranscriptasepolymerasechainreac-4技術(shù)原理草魚(yú)呼腸孤病毒(GCRV)現(xiàn)有I、Ⅱ和Ⅲ型3個(gè)基因型，根據(jù)同一基因型不同毒株之間共有的保守型分離株的核酸。在同一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)體系里加入針對(duì)3個(gè)基因型的3對(duì)保守引物，便可同時(shí)擴(kuò)增出3個(gè)大小有差異的核酸片段，可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的電泳條帶分子量大小來(lái)區(qū)分而達(dá)到特異性檢測(cè)和鑒別不同基因型GCRV的目的。2GB/T37746—20195試劑和材料5.1水：符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格，核酸抽提和RT-PCR須使用無(wú)RNA酶的去離子水。5.2TRIzolRNA提取試劑或其他商品化的基因組RNA提取試劑盒。5.3氯仿。5.5無(wú)水乙醇。5.675%乙醇：用新開(kāi)啟的無(wú)水乙醇和DEPC水配制，—20℃預(yù)冷。5.7M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/μL):—20℃保存。5.8dNTPs:含dCTP、dATP、dGTP、dTTP各10mmol/μL。5.9RNA酶抑制劑(RNasin,40U/μL):—20℃保存。5.10TaqDNA聚合酶(5U/μL):—20℃保存。5.11DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL1000,100bp。5.121.5%瓊脂糖凝膠：按附錄A中A.1配制。5.14溴化乙錠(EB,10μg/μL):按A.3配制。5.15焦炭酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌雙蒸水：按A.4配制。5.16PBS(磷酸鹽緩沖溶液):按A.5配制。5.17引物：逆轉(zhuǎn)錄引物按附錄B中的B.1,引物濃度為25pmol/μL;PCR引物按B.2,引物濃度為25pmol/μL。5.18陽(yáng)性對(duì)照：將3種基因型的GCRV分別接種草魚(yú)性腺細(xì)胞(CO)或草魚(yú)吻端成纖維細(xì)胞(PSF),將獲得的病毒液等量混合作為陽(yáng)性對(duì)照。5.19陰性對(duì)照：以CO或PSF細(xì)胞液作為陰性對(duì)照。6器材和設(shè)備6.1PCR擴(kuò)增儀。6.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)。6.4混勻器。6.5冰箱(2℃~8℃、—20℃和一70℃的三種)。6.6水浴鍋。6.7電泳儀。6.8電泳槽。6.9紫外觀(guān)察燈或(和)凝膠成像系統(tǒng)。6.120.2mLPCR管，1.5mL和0.5mL無(wú)RNA酶的Eppendorf管。3GB/T37746—20197操作步驟樣品采集按SC/T7103的規(guī)定進(jìn)行。用無(wú)菌鑷子和剪刀采集待檢魚(yú)脾臟和腎臟組織，每種組織采集的量為100mg～300mg,如臟器不足100mg則采集整個(gè)臟器，將采集的組織分別放入1.5mL無(wú)RNA酶的Eppendorf管中，編號(hào)。將樣品置于研磨器中，按質(zhì)量體積比1:1加入滅菌PBS,然后加入液氮或石英砂進(jìn)行充分研磨；4℃,3000r/min離心15min,取上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的1.5mL無(wú)RNA酶的Eppendorf管中，編號(hào)備用。7.2RNA提取7.2.2用TRIzol試7.2.3100μL7.1.3中的上清液，900μLTRIzol置入1.5mL無(wú)RNA酶的Eppendo7.2.5吸取上層水相至一新的1.5mL無(wú)RNA酶的Eppendorf管中，加入等體積異丙醇(-20℃預(yù)7.2.8提取的RNA應(yīng)盡快進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增。若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃7.2.9也可以采用質(zhì)量相當(dāng)?shù)纳唐坊蚪MRNA提取試劑盒進(jìn)行待檢樣品、陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品在0.2mLPCR管或0.5mL或1.5mL無(wú)RNA酶的Eppendorf管(根據(jù)樣品數(shù)量來(lái)選擇配制混4GB/T37746—2019表1一步法反應(yīng)中配制RT-PCR擴(kuò)增體系的組分和用量組分每管用量n管總用量一步法RT-PCR擴(kuò)增緩沖液(10×)n×5.0M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/μL)n×1.0dNTPs(10mmol/L)n×2.0RNA酶抑制劑(40U/μL)n×0.5TaqDNA聚合酶(5U/μL)n×1.0逆轉(zhuǎn)錄引物(25pmol/μL)n×1.0引物PO1-F(25pmol/μL)n×0.5引物PO1-R(25pmol/μL)n×0.5引物P02-F(25pmol/μL)n×0.3引物P02-R(25pmol/μL)n×0.3引物PO3-F(25pmol/pL)引物P03-R(25pmol/μL)n×32.1總體積45.0n×45.0將7.3.1.1配制好的混合液按每個(gè)PCR管45.0μL分裝至新的0.2mLPCR管中，在各設(shè)定的PCR管中分別加入7.2中制備的RNA溶液5.0μL,蓋緊管蓋，掌上離心機(jī)瞬時(shí)離心或6000r/min離心7.3.1.3RT-PCR擴(kuò)增72℃延伸10min;4℃保存。7.3.2兩步法反應(yīng)操作步驟7.3.2.1逆轉(zhuǎn)錄時(shí)取5.0μL7.2中制備的RNA,加入濃度為25pmol/μL逆轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物1.0μL,7.3.2.2冰浴2min,繼續(xù)加入表2所示的組分和用量。5GB/T37746—2019表2兩步法反應(yīng)中配制逆轉(zhuǎn)錄體系的組分和用量組分每管用量n管總用量5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4.0n×4.0DTT(0.1mol/L)n×2.0dNTPs(10mmol/L)n×1.0M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/μL)n×0.5RNA酶抑制劑(40U/μL)n×0.5總體積n×14.07.3.2.337℃反應(yīng)30min合成cDNA,85℃滅活5min后進(jìn)行PCR或置-20℃保存。7.3.2.4PCR擴(kuò)增體系配制如表3所示，全部加完后，混勻，掌上離心機(jī)瞬時(shí)離心或6000r/min離心表3兩步法反應(yīng)中配制PCR擴(kuò)增體系的組分和用量組分每管用量n管總用量10×PCRbuffern×5.0dNTPs(10mmol/L)n×1.0引物P01-F(25pmol/μL)n×0.5引物P01-R(25pmol/μL)n×0.5引物P02-F(25pmol/μL)n×0.3引物P02-R(25pmol/μL)n×0.3引物P03-F(25pmol/μL)引物P03-R(25pmol/μL)DNA聚合酶(5U/μL)n×0.5n×36.1總體積45.0n×45.0加入7.3.2.3中制備的cDNA5.0μL,蓋緊管蓋，掌上離心機(jī)瞬時(shí)離心或6000r/min離心15s。7.3.2.6PCR擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5min;94℃變性35s,56℃退火35s,72℃延伸45s,循環(huán)35次；72℃延伸10min,4℃保存。7.4擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)制備1.5%的瓊脂糖凝膠板(參見(jiàn)A.1),取5.0μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和1μL商品化的上樣緩沖液混合后，分別加樣到凝膠孔中。110V恒壓下電泳30min～45min,在紫外投射儀或凝膠成像系統(tǒng)上觀(guān)察并拍照記錄。6GB/T37746—20198結(jié)果判斷a)若樣品中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后僅在501bp的位置上出現(xiàn)特異性條帶，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，同參考序列進(jìn)行比較(參見(jiàn)附錄C中C.1),序列相似性在85%或以上，判定為GCRVI型b)若僅在195bp的位置上出現(xiàn)特異性條帶，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，同參考序列進(jìn)行比較(參見(jiàn)C.2),序列相似性在85%或以上判定為GCRVⅡ型檢測(cè)陽(yáng)性；c)若僅在296bp的位置上出現(xiàn)特異性條帶，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，同參考序列進(jìn)行比較(參見(jiàn)C.3),序列相似性在85%或以上判定為GCRVⅢ型檢測(cè)陽(yáng)性；d)若在195bp、296bp和501bp中的兩個(gè)或三個(gè)位置上出現(xiàn)特異性條帶，分別切取特異性條帶并回收和純化目的片段后測(cè)序，同參考序列進(jìn)行比較(參見(jiàn)附錄C),序列相似性都在85%或以上，則判定為GCRV3個(gè)基因型中的兩個(gè)或三個(gè)基因型a)若在195bp、296bp和501bp的位置上均未出現(xiàn)特異性條帶，則判定為GCRVI、Ⅱ、Ⅲ型檢b)若擴(kuò)增出特異性條帶但測(cè)序結(jié)果和已知GCRV分離株的參考序列同源性在85%以下(參見(jiàn)附錄C),則判定為GCRVI、Ⅱ、Ⅲ型檢測(cè)陰性。7GB/T37746—2019(規(guī)范性附錄)相關(guān)試劑配制A.11.5%瓊脂糖凝膠瓊脂糖粉1.5g1×TAE電泳緩沖液加至100mL將瓊脂糖粉加入100mLTAE電泳緩沖液(1×)中，加熱融化。溫度降至60℃左右時(shí)，加入5μL核酸染料，均勻鋪板，厚度為3mm～5mA.250×TAE電泳緩沖液A.2.10.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)乙二胺四乙酸二鈉18.6g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.2.2TAE電泳緩沖液(50×)羥基甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0)100mL滅菌雙蒸水加至1000mL用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋使用。A.3溴化乙錠(EB)溶液溴化乙錠20mg滅菌雙蒸水加至20mLA.4DEPC水(亦購(gòu)買(mǎi)可商品化的DEPC水)滅菌雙蒸水1000mL焦碳酸二乙酯(DEPC)500μL室溫過(guò)夜，121℃高壓滅菌15min。A.5PBS緩沖液滅菌雙蒸水800mL8GB/T37746—2019NaClNa?HPO?KH?PO?g用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加滅菌雙蒸水定容至1L,在121℃高壓下蒸氣滅菌20min。保存于室溫。9GB/T37746—2019(規(guī)范性附錄)B.1逆轉(zhuǎn)錄引物(隨機(jī)引物)5'-NNNNNNNNN-3′(N=A/T/C/G)B.2PCR引物引物信息見(jiàn)表B.1。表B.1PCR引物信息基因型引物名稱(chēng)引物序列(5'-3′)片段長(zhǎng)度/bpGB/T37746—2019(資料性附錄)擴(kuò)增片段參考序列C.1I型GCRV擴(kuò)增的序列GGTTCTCAATCCTACCGGTAAGCTATGGCGACCCGTCGGTACCTCTGTTGCTACCATCGACTCACTTGCCATCGTTAGCGATCGTTTTGGTCAGTATTCATTTGTCAATGAAGGCATGCGAGAGACCTTTTCAAAAGCGCTCTTCGACATCAACATGTGGCAACCTTTATTCCAAGCGACAAAGACTGGCTGCGGACCGATTGTACTCTCCTCCTTCACAACCACCACCTCC