Ghrelin對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)影響及機(jī)制探究

1/1Ghrelin對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)影響及機(jī)制探究1Ghrelin對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)影響及機(jī)制探究Ghrelin對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)影響及機(jī)制探究【摘要】目的觀察Ghrelin對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)的影響，同時(shí)探討其機(jī)制。

方法Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、Ghrelin治療組，測(cè)量腸轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)；全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄各組大鼠胃竇環(huán)形平滑肌細(xì)胞鈣敏感性鉀電流的數(shù)值變化。

結(jié)果模型組大鼠腸轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)明顯低于對(duì)照組（Plt;0.05），鈣敏感性鉀電流高于對(duì)照組（Plt;0.01）；治療組轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)高于模型組（Plt;0.05），而電流明顯降低（P=0.01）。

結(jié)論重癥急性胰腺炎大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，胃腸道平滑肌細(xì)胞膜鈣敏感性鉀電流增加是一個(gè)重要的電生理機(jī)制，Ghrelin可以通過降低該電流而促進(jìn)其胃腸運(yùn)動(dòng)。

【關(guān)鍵詞】Ghrelin重癥急性胰腺炎胃腸運(yùn)動(dòng)膜片鉗鈣敏感性鉀電流InfluenceofGhrelinongastrointestinalmotilityinsevereacutepancreatitisratsandresearchonmechanism［Abstract］ObjectiveToobservetheinfluenceofGhrelinongastrointestinalmotilityinsevereacute2pancreatitis(SAP)rats，andstudyonitsmechanism.MethodsWistarratswererandomlydividedintocontrolgroup，SAPmodelgroupandGhrelintreatmentgroup.Thechangesoftheirintestinaltransitindexweremeasured;Thewholecellpatchclamptechniquewasusedtorecordthecalciumactivatedpotassiumcurrentoftheirgastricantralcircularsmoothmusclecells.ResultsTheintestinaltransitindexofmodelgroupwaslowerthanthatofcontrolgroup（P＜0.05），anditscalciumactivatedpotassiumcurrentwashigherthancontrolgroup（P＜0.01）;TheindexofGhrelintreatmentgroupwashigherthanthatofcontrolgroup（P＜0.05），anditscurrentwaslowerthancontrolgroup（P=0.01）.ConclusionThegastrointestinalmotilityofsevereacutepancreatitisratwasattenuated，themechanismofwhichmightbethecalciumactivatedpotassiumcurrentofitsgastrointestinalsmoothmusclecellwasincreased.Ghrelincanpromotethegastrointestinalmotilityofsevereacutepancreatitisratwithcuttingdownthecurrents.［Keywords］ghrelin;severeacute3pancreatitis;gastrointestinalmotility;patchclamp;calciumactivatedpotassiumcurrent重癥急性胰腺炎（severeacutepancreatitis，SAP）是一種發(fā)病急、并發(fā)癥多且死亡率高的疾病，有效地控制后期感染和內(nèi)毒素血癥的發(fā)生是治療SAP的關(guān)鍵。

通過促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)排泄毒素，可以達(dá)到調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，減少內(nèi)毒素吸收的作用，Ghrelin是生長激素促分泌劑（GHSs）受體的內(nèi)源性配體，在胃腸道表現(xiàn)出和胃動(dòng)素類似的促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)作用，本研究以膽鹽誘導(dǎo)的重癥急性胰腺炎大鼠為模型探討Ghrelin對(duì)其胃腸運(yùn)動(dòng)的影響，并且通過觀察胃竇平滑肌細(xì)胞膜鈣敏感性鉀電流［calciumactivatedpotassiumcurrents，IK（Ca）］的變化進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探索。

1材料與方法1.1動(dòng)物分組與模型建立Wistar大鼠54只隨機(jī)分為對(duì)照組（假手術(shù)組）、急性胰腺炎組（模型組）、Ghrelin治療組，每組18只，各組又分3個(gè)時(shí)間亞組，每組6只，分別于術(shù)后6h、12h、24h時(shí)間處死。

大鼠以10％水合氯醛麻醉后，開腹尋找膽胰管十二指腸乳頭開口，使用一次性靜脈留置套管針于對(duì)系膜緣腸壁穿刺，將套管經(jīng)乳頭部逆行插入膽胰管約1cm，小動(dòng)脈夾于肝門部阻斷膽管后，套管末端接微量泵，以0.1ml/min的速度勻速注入3.5％?；悄懰徕c（1ml/kg體重）后關(guān)腹。

對(duì)照組大鼠開腹后僅翻動(dòng)十二指腸并4觸摸胰腺數(shù)次后關(guān)腹。

Ghrelin治療組于造模前30min、造模后3h給予Ghrelin（加拿大PhoenixPharmaceuticals公司）10nmol/kg腹腔注射，余處理同模型組。

1.2胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能測(cè)定各組大鼠于處死之前30min自口腔插入鼠胃管，注入50%Evanblue染料0.5ml，注完染料30min后，用木棒擊頭致昏，破心放血后開腹顯露全胃，測(cè)量幽門至藍(lán)染距離與整個(gè)小腸（幽門至回盲部）的長度比，用百分?jǐn)?shù)表示為轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，反映胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)功能情況。

1.3胃竇環(huán)形平滑肌細(xì)胞IK（Ca）的測(cè)定1.3.1試劑與儀器Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶抑制劑、牛血清白蛋白等均購自美國Sigma公司。

美國AxonInstrument公司Multiclamp700B膜片鉗放大器和Digdatal1322A模-數(shù)/數(shù)-模轉(zhuǎn)換器，日本Nikon公司TS100倒置顯微鏡，美國ALAScientificInstruments公司DADVC-8PP型8通道灌流系統(tǒng)。

1.3.2主要溶液［1］臺(tái)氏液（mmol/L）：

NaCl147，KCl4，CaCl22，NaH2PO40.42，Na2HPO42，MgCl21.05，葡萄糖5.5，以NaOH調(diào)pH7.4。

PSS（mmol/L）：

NaCl134.8，KCl4.5，HEPES10，MgCl21，葡萄糖10，CaCl22，以Tris調(diào)pH7.4。

電極內(nèi)液（mmol/L）：

天冬氨酸110，Mg-ATP5，HEPES5，MgCl21，KCl20，EGTA0.1，di-tris-creatinephosphate2.5，di-sodium-creatinephosphate2.5，以5KOH調(diào)pH7.3。

1.3.3單個(gè)胃竇環(huán)形平滑肌細(xì)胞的分離選取對(duì)照組和模型組大鼠各10只，模型制備方法同上，造模后12h處死動(dòng)物顯露全胃。

剪取角切跡右側(cè)至幽門的部分（胃竇部），放入氧飽和的臺(tái)氏液中，剪開胃竇部，剪除黏膜層后即可暴露出環(huán)行肌層，沿環(huán)行肌走行方向用剪刀剪取1mm5mm的環(huán)行肌條。

用含1％Ⅱ型膠原酶、1％胰蛋白酶抑制劑、2％牛血清白蛋白的消化液于37℃水浴振蕩消化15min，然后置于4℃冰箱中備用，實(shí)驗(yàn)前用吸管反復(fù)吹打后，取上清液可得單個(gè)胃竇環(huán)形平滑肌細(xì)胞。

1.3.4鈣敏感性鉀電流IK（Ca）的記錄取各組大鼠分離細(xì)胞懸液接種于灌流槽中，細(xì)胞貼壁后PSS灌流以清除懸浮的細(xì)胞碎片。

形成吉?dú)W封接后，高電壓脈沖擊破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式，進(jìn)行參數(shù)補(bǔ)償后開始實(shí)驗(yàn)參數(shù)記錄。

將細(xì)胞膜電位鉗制在-60mV，以每10s給予20mV的階躍刺激使細(xì)胞膜電位從-60mV去極化至100mV，時(shí)間持續(xù)400ms，分別觀察PSS和含10nmol/LGhrelin的PSS灌流下IK（Ca）的數(shù)值變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用膜片鉗數(shù)據(jù)軟件Clampit9.2和統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在每一細(xì)胞上所取得原始電流值進(jìn)行歸一化處理，除以對(duì)照組中的最大電流值得出其相對(duì)值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以（xs）表示，多個(gè)樣本均數(shù)間比較6用單因素方差分析（onewayANOVA），均數(shù)間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。

2結(jié)果2.1一般情況對(duì)照組各亞組均無死亡；模型組造模后6h組無死亡，12h組死亡1只，24h組死亡3只；治療組造模后6h組無死亡，12h組死亡1只，24h組死亡2只。

2.2腸道轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)模型組腸轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)明顯低于對(duì)照組（Plt;0.05），治療組轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均高于模型組（Plt;0.05），并且各組轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均隨時(shí)間有所增加，見表1。

表1腸轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的比較注：

與模型組比較，#Plt;0.05；與前一時(shí)間亞組比較，*Plt;0.052.3鈣敏感性鉀電流IK（Ca）的變化在PSS灌流下，模型組大鼠與對(duì)照組相比，胃竇環(huán)形平滑肌細(xì)胞IK（Ca）增加，當(dāng)細(xì)胞膜電位去極化至+60mV時(shí)，模型組IK（Ca）的平均幅度為（2.030.20）nA，對(duì)照組為（1.630.17）nA，電流增加差異具有顯著性（Plt;0.01）；在含10nmol/LGhrelin的PSS灌流下，模型組大鼠與PSS灌流時(shí)相比，IK（Ca）明顯降低，當(dāng)細(xì)胞膜電位去極化至+60mV時(shí)，模型組IK（Ca）的平均幅度為（1.830.13）nA，與PSS灌流下相比，電流降低差異具有顯著性（P=0.01），見表2，圖1。

表2細(xì)胞膜電位去極化至+60mV時(shí)IK（Ca）的變化注：

與對(duì)照7組比較，#Plt;0.01；與PSS灌流比較，*Plt;0.053討論急性胰腺炎早期，胰酶的活化，炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子和氧自由基的誘生引發(fā)的機(jī)體超強(qiáng)的炎癥反應(yīng)是造成早期病理損害的主要原因，但隨后的腸源性細(xì)菌移位導(dǎo)致的嚴(yán)重感染和內(nèi)毒素血癥造成了后期病理生理的惡性循環(huán)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生第二次打擊，引發(fā)嚴(yán)重的多臟器衰竭。

目前研究認(rèn)為，SAP時(shí)促進(jìn)細(xì)菌移位的機(jī)制主要包括：

（1）SAP時(shí)胃腸運(yùn)動(dòng)功能的改變，如胃腸動(dòng)力減弱，腸腔積液積氣，腸管擴(kuò)張等，為腸道內(nèi)細(xì)菌的滯留和過度繁殖創(chuàng)造了條件，引起以革蘭陰性菌為主的腸道需氧菌過度增殖，而雙歧桿菌和乳酸桿菌明顯減少，破壞了腸道微生物的平衡［2～4］；（2）腸道黏膜屏障的通透性增加。

SAP時(shí)，腸道作為機(jī)體應(yīng)激的中心器官之一，早期即可出現(xiàn)腸道屏障功能損傷，其機(jī)制復(fù)雜，可能與多方面因素有關(guān)［5～6］；（3）宿主免疫功能下降。

這些因素相互協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)菌向腸腔外其他部位移位。

本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠腸轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)明顯低于對(duì)照組（Plt;0.05），證實(shí)了SAP下大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，是促進(jìn)腸源性細(xì)菌移位，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重感染和內(nèi)毒素血癥的一個(gè)重要因素；通過促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)排泄毒素，可以達(dá)到調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，減少內(nèi)毒素吸收的作用。

Ghrelin是生長激素促分泌劑（GHSs）受體的內(nèi)源性配體，在胃、小腸的神經(jīng)和肌肉組織中均有其受8體的表達(dá)，Ghrelin可以通過膽堿能神經(jīng)元刺激消化間期胃及小腸的運(yùn)動(dòng)［7］，有實(shí)驗(yàn)顯示大鼠靜脈注射Ghrelin后，胃排空和小腸對(duì)流質(zhì)飲食的傳送加快，并可逆轉(zhuǎn)手術(shù)后腸梗阻［8］。

此外Ghrelin作為一個(gè)胃腸激素，與胃動(dòng)素（motilin）的分子結(jié)構(gòu)相似，在胃腸道表現(xiàn)出和胃動(dòng)素類似的促進(jìn)胃排空作用，可能是由于Ghrelin和胃動(dòng)素受體之間存在相互作用有關(guān)［9］。

本實(shí)驗(yàn)中Ghrelin治療組大鼠腸轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著高于模型組（Plt;0.05），這與以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說明Ghrelin可以通過促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，減輕內(nèi)毒素吸收，實(shí)現(xiàn)對(duì)SAP的治療作用。

大多數(shù)胃腸道運(yùn)動(dòng)的抑制性反應(yīng)都與胃腸道平滑肌細(xì)胞膜的超極化有關(guān)，胃腸道平滑肌超級(jí)化的離子機(jī)制尚不清楚，很多實(shí)驗(yàn)表明這種超極化可能是由于各種原因使鈣敏感性鉀電流IK（Ca）增加引起的，如生理性舒張，包括吞咽后食管下括約肌舒張、進(jìn)食后胃的容受性舒張和胃腸道擴(kuò)張后的下行性抑制性蠕動(dòng)反射等；病理性舒張，包括功能性消化不良、反流性食管炎、巨結(jié)腸癥。

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度因各種原因少量增加時(shí)可激活I(lǐng)K（Ca），引起鉀離子外流增加，使細(xì)胞膜發(fā)生超極化，細(xì)胞興奮性下降，出現(xiàn)胃腸道運(yùn)動(dòng)的抑制性反應(yīng)。

胃竇在形態(tài)結(jié)構(gòu)上肌層最發(fā)達(dá)，在胃排空中起泵的作用，在本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠與對(duì)照組比較，腸轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著降低，胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，而胃竇環(huán)形平滑肌細(xì)胞IK（Ca）9顯著增加（Plt;0.01），表明胃腸道平滑肌細(xì)胞膜IK（Ca）增加是SAP下大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)減弱的一個(gè)重要電生理機(jī)制；在Ghrelin灌流下，模型大鼠的胃竇環(huán)形平滑肌細(xì)胞IK（Ca）顯著降低（P=0.01），說明Ghrelin可能是通過降低IK（Ca）電流而促進(jìn)SAP大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)的。

在以前的實(shí)驗(yàn)中我們已經(jīng)證實(shí)Ghrelin對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠具有明確的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過影響炎癥傳導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明Ghrelin對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的促進(jìn)作用，減少了內(nèi)毒素吸收，減輕了SAP對(duì)機(jī)體的第二次打擊，也是其保護(hù)作用的一個(gè)重要機(jī)制。

【參考文獻(xiàn)】1陳明鍇，羅和生，余保平.小檗堿對(duì)豚鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜離子通道的影響.中華消化雜志，2003，23（11）:689-690.2FoitzikT.Theenteralfactorinpancreaticinfection.Pancreatology，2001，1（3）:217-223.3WuCT，LiZL，XiongDX.Relationshipbetweenentericmicroecologicdysbiosisandbacterialtranslocationinacutenecrotizingpancreatitis.WorldJGastroenterol，1998，4（3）:242-245.104BergRD.Bacterialtranslocationfromthegastrointestinaltract.AdvExpMedBiol，1999，473（1）:11-30.5RahmanSH，JamesAM，AmmoriBJ，etal.Ischaemia-reperfusioninjury，gutmacromolecularpermeabilityandsevereacutepancreatitis.BrJSurg，2002，89（1）:34.6RahmanSH，AmmoriBJ，Holmfield