蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

關(guān)于蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第二章蛋白質(zhì)protein第2頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月第五節(jié)

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（TheRelationofStructureandFunctionofProtein）第3頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)

一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

牛胰核糖核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)二硫鍵第4頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無(wú)活性第5頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月多肽鏈中氨基酸的排列順序決定了肽鏈的折疊和卷曲方式部分氨基酸殘基在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中處于關(guān)鍵位置

第6頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月1、種屬差異同源蛋白（homologousprotein)

在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序具有明顯的相似性即為序列同源。

（二）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第7頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月如不同哺乳動(dòng)物的胰島素分子結(jié)構(gòu)都由A和B兩條鏈組成，且二硫鍵的配對(duì)和空間構(gòu)象極其相似。一級(jí)結(jié)構(gòu)也相似，僅有個(gè)別氨基酸有差異，因此它們都執(zhí)行著相同的調(diào)節(jié)糖代謝的生理功能。同源蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱為不變殘基（invariantresidue）

。其他位置的氨基酸差異較大，稱為可變殘基（variableresidue）

。第8頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月哺乳動(dòng)物胰島素氨基酸序列差異胰島素人豬狗兔牛羊馬

氨基酸殘基序列號(hào)A5ThrThrThrThrAlaAlaThrA6SerSerSerGlyGlySerSerA10IleIleIleIleValValIleB30ThrAlaAlaSerAlaAlaAla第9頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月

是一種與血紅素輔基共價(jià)結(jié)合的單鏈蛋白，存在于真核生物線粒體中。相對(duì)分子量約為13,000，含有104個(gè)氨基酸殘基。近100個(gè)種屬的細(xì)胞色素c氨基酸順序已被測(cè)定。肽鏈中28個(gè)位置的氨基酸對(duì)所有已測(cè)試的種屬都相同的，表明，這些殘基是規(guī)定細(xì)胞色素c功能所必需的。細(xì)胞色素c（cytochromec,Cyt.c）第10頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月生物名稱與人不同的氨基酸參加數(shù)目生物名稱與人不同的氨基酸參加數(shù)目黑猩猩0響尾蛇14恒河猴1海龜15兔9金槍魚21袋鼠10角鮫23牛、豬、羊10小蠅25狗11蛾31驢11小麥35馬12粗糙鏈孢菌43雞、火雞13酵母菌44不同生物與人細(xì)胞色素c的氨基酸數(shù)目比較第11頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月

狗人猴

馬騾

鯨兔豬袋鼠企鵝雞鴨響尾蛇龜蒼蠅蛾脈孢菌屬念珠菌屬面包酵母菌小麥牛蛙金槍魚動(dòng)物爬行動(dòng)物兩棲動(dòng)物魚哺乳動(dòng)物鳥昆蟲植物脊椎動(dòng)物從細(xì)胞色素C的一級(jí)結(jié)構(gòu)看生物進(jìn)化生物進(jìn)化第12頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月2、一級(jí)結(jié)構(gòu)改變引起分子病

例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物功能的下降或喪失，這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子?。╩oleculardisease）”。第13頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月

最早從分子水平證明的先天性遺傳病——鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥(sickle-cellanemia)。鐮刀形紅細(xì)胞正常血細(xì)胞hemoglobin

6:GAA(Glu) ->GTA(Val)第14頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月血紅蛋白

-鏈上谷氨酸變成纈氨酸鐮刀狀貧血病的分子機(jī)理第15頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月3、蛋白質(zhì)前體的激活

一些蛋白質(zhì)或酶在細(xì)胞中首先合成的是其前體,在成為有功能的蛋白質(zhì)或酶之前需要激活.

例如,胰島素(insulin).的前體是胰島素原(proinsulin),要在切除C肽之后才轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘囊葝u素胰島素原的一級(jí)結(jié)構(gòu)第16頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月一級(jí)結(jié)構(gòu)差異越小，功能相關(guān)性越大。一級(jí)結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化可直接影響其功能第17頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（一）血紅蛋白與肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)

二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

第18頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月1、血紅素

肌紅蛋白(myoglobin,Mb)與血紅蛋白都是含有血紅素輔基的蛋白質(zhì)。血紅素是鐵卟啉化合物，由4個(gè)甲炔基相連成為一個(gè)環(huán)形，F(xiàn)e2+居于環(huán)中。鐵離子有6個(gè)配位鍵，其中4個(gè)與吡咯環(huán)的N配位結(jié)合，1個(gè)配位鍵和肌紅蛋白的93位組氨酸殘基結(jié)合，氧則與Fe2+

形成第6個(gè)配位鍵，接近第64位（E7)組氨酸。第19頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月肌紅蛋白（myoglobin,Mb）

肌紅蛋白是一個(gè)只有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，有8段α-螺旋結(jié)構(gòu)，分別成為ABCDEFGH肽段。整條多肽鏈折疊成緊密球狀分子，氨基酸殘基上的疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部，富極性及電荷的則在分子表面，因此水溶性較好。Mb分子內(nèi)部有個(gè)袋形空穴，血紅素居于其中。第20頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月血紅蛋白（hemoglobin,Hb）

血紅蛋白具有四個(gè)亞基組成的四級(jí)結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基中間有一個(gè)疏水局部，可攜帶一個(gè)血紅素并攜帶一分子氧，因此1分子Hb共結(jié)合四分子氧。Hb各亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)與Mb極為相似。Hb亞基之間通過(guò)八對(duì)鹽鍵，使四個(gè)亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。第21頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分?jǐn)?shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。2、血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧

第22頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月*協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)

一個(gè)寡聚體蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個(gè)亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)

(negativecooperativity)第23頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月抗體——生物體內(nèi)最奇妙的分子無(wú)限的多樣性（diversity)功能與結(jié)構(gòu)的雙重性

可變區(qū)——抗原結(jié)合恒定區(qū)——生物學(xué)效應(yīng)功能（二）免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能第24頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（1）抗體的基本結(jié)構(gòu)Ig分子基本結(jié)構(gòu)是由四個(gè)肽鏈組成的。包括二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈。輕鏈與重鏈之間是由二硫鍵連接形成Ig分子單體。

第25頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（1）抗體的基本結(jié)構(gòu)第26頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（2）可變區(qū)和恒定區(qū)可變區(qū)和抗原識(shí)別有關(guān)，決定抗體識(shí)別的特異性，而恒定區(qū)和效應(yīng)功能相關(guān)。此外在Y形分子伸出的兩臂和主干之間還有個(gè)可彎曲的鉸鏈區(qū)(hingeR)，能改變兩個(gè)結(jié)合抗原的Y形臂之間的距離。兩臂之間的角度可有自0°到90°的變化，這樣有利于兩臂同時(shí)結(jié)合位于抗原上分布于不同位置的表位。第27頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月鉸鏈區(qū)第28頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月Ig的鉸鏈區(qū)及其功能第29頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病

蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。第30頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。第31頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第32頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月第六節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)第33頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量很大，一般介于10000-1000000道爾頓之間，也有更大的。測(cè)定分子量的方法很多：滲透壓法、超離心法、凝膠過(guò)濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（一）蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量第34頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（二）蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。第35頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月

各種蛋白質(zhì)有特定的等電點(diǎn)，和它所含的氨基酸種類和數(shù)量有關(guān)。例：含有堿性氨基酸較多，則pI偏堿（偏大）含有酸性氨基酸較多，則pI偏酸（偏?。缓兴?、堿氨基酸數(shù)目相近時(shí)，pI為中性偏酸，約為5.0左右。

pH>pI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，體內(nèi)蛋白質(zhì)的pI大多為5.0左右，故生理?xiàng)l件下一般以負(fù)離子形式存在。

第36頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)酸性氨基酸數(shù)堿性氨基酸數(shù)pI胃蛋白酶3761.0胰島素445.35RNA酶10187.8細(xì)胞色素c12259.8～10.8等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以兩性離子存在，最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出（用于蛋白質(zhì)的分離提純）；蛋白質(zhì)的粘度、滲透壓、膨脹性以及導(dǎo)電能力均最小。第37頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（三）蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性*蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞（即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)），從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。第38頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月造成變性的因素物理因素：加熱、紫外線、X線、超聲波化學(xué)因素：乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質(zhì)——

破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。第39頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月變性特征：

生物活性喪失；

理化性質(zhì)改變：溶解度降低、球狀蛋白質(zhì)的不對(duì)稱性增加、粘度增加、擴(kuò)散系數(shù)降低，某些蛋白質(zhì)不能夠再形成結(jié)晶,變性后分子結(jié)構(gòu)松散、易被水解，變性蛋白易被酶消化。組成和相對(duì)分子質(zhì)量不變第40頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性。蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation)

第41頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月Anfinsen實(shí)驗(yàn)

-牛胰核糖核酸酶的變性和復(fù)性結(jié)論：蛋白質(zhì)的變性是可逆的；一級(jí)結(jié)構(gòu)決定三維結(jié)構(gòu)；形成三維結(jié)構(gòu)所需要的所有信息都包含在一級(jí)結(jié)構(gòu)中。第42頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（四）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬(wàn)至100萬(wàn)之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜第43頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉第44頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中能成為穩(wěn)定的膠體。如果在蛋白質(zhì)溶液中加入某種電解質(zhì)或調(diào)節(jié)溶液pH，破壞了蛋白質(zhì)的水化膜及中和了蛋白質(zhì)的電荷，則蛋白質(zhì)從溶液中析出的作用，稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。根據(jù)反應(yīng)的可逆性分為可逆沉淀和不可逆沉淀兩種。（五）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)第45頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月1、可逆的沉淀作用定義：蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后，用透析等方法除去沉淀劑，可使蛋白質(zhì)重新溶于原來(lái)的溶液中。在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。第46頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月反應(yīng)類型：（1）加高濃度鹽類

:如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等

鹽析：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象不同的蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度不同，調(diào)節(jié)鹽濃度可將混合蛋白質(zhì)分段析出（分段鹽析）。例：

半飽和的(NH4)2SO4可使球蛋白沉淀；飽和的(NH4)2SO4可使清蛋白析出。

應(yīng)用：利用此性質(zhì)可分離和制備各種蛋白質(zhì)和酶制品第47頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（2）加有機(jī)溶劑：如酒精、丙酮等 機(jī)理：有機(jī)溶劑和水有較強(qiáng)的作用，破壞了蛋白質(zhì)分子周圍的水膜，因此發(fā)生沉淀反應(yīng)。（3）等電點(diǎn)沉淀

利用蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小的特點(diǎn)。在pI時(shí)，加入這些有機(jī)溶劑可加速蛋白質(zhì)的沉淀，可用于蛋白質(zhì)的分離純化。第48頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月定義：蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后，不能用透析等方法除去沉淀劑而使蛋白質(zhì)重新溶解的現(xiàn)象在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。2、不可逆沉淀第49頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（六）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1、雙縮脲反應(yīng)(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。2、米倫氏反應(yīng)（酚基）

米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合物，蛋白質(zhì)溶液加入此試劑后即產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變?yōu)榧t色。酪氨酸含有酚基，故含酪氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)。第50頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月3、乙醛酸反應(yīng)（吲哚基）

在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩層之間就會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán)。色氨酸及含有色氨酸的蛋白質(zhì)有此反應(yīng)。4、坂口反應(yīng)精氨酸分子含有胍基，能與次氯酸鈉及α-萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色產(chǎn)物。5、酚試劑（福林試劑）反應(yīng)酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物。

該反應(yīng)常用蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。第51頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（五）蛋白質(zhì)的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。第52頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月前處理及抽提：選材、破碎、勻漿、溶解、離心或差速離心、（pH、溫度、酶的抑制劑等保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定）。粗制品獲得（粗分級(jí)分離）：鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)分離，離心。純化（細(xì)分級(jí)分離）：層折法。鑒定和測(cè)定：純度和含量。二、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)（一）蛋白質(zhì)分離純化的一般原則第53頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月1、透析及超濾*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)（二）常見分離純化技術(shù)第54頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月透析(dialysis):磁力攪拌器透析前透析后透析袋通過(guò)透析，小分子通過(guò)透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白質(zhì)不能通過(guò)透析袋，留在透析袋內(nèi)。從而，蛋白質(zhì)溶液中的小分子物質(zhì)通過(guò)透析被分離除去。第55頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月超過(guò)濾（ultrafiltration）加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液原理:是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在半透膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的第56頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月2、鹽析和鹽溶*鹽析(saltprecipitation)：將高濃度的中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。鹽溶（saltsolution）：低濃度的中性鹽可以使蛋白質(zhì)溶解度增加。第57頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月等電點(diǎn)沉淀法：不同蛋白質(zhì)、氨基酸組成不同，等電點(diǎn)不同，可利用等電點(diǎn)沉淀方法進(jìn)行分離。等電點(diǎn)特點(diǎn)：蛋白溶解度最低3、等電點(diǎn)沉淀法第58頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月4、低溫有機(jī)溶劑沉淀法*常用有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮*丙酮沉淀：使用丙酮沉淀時(shí)，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白易變性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。以上幾種方法只能分離得到蛋白質(zhì)的粗制品，還無(wú)法得到具有一定純度的蛋白質(zhì)。第59頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月5、電泳—根據(jù)電荷不同進(jìn)行純化的方法蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。

第60頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月原點(diǎn)帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)的泳動(dòng)方向?yàn)V紙、醋酸纖維素薄膜或其他支持物陽(yáng)極陰極電極緩沖液電極緩沖液電泳示意圖薄膜電泳第61頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。*等電聚焦電泳，通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳，以上兩種方法相結(jié)合，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。第62頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月凝膠電泳第63頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月（四）層析（色譜）層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理當(dāng)流動(dòng)相帶著待分離蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過(guò)一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。第64頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。凝膠過(guò)濾(gelfiltration)又稱分子篩層析、分子排阻色譜等，是利用各蛋白質(zhì)分子大小的不同進(jìn)行分離的。親和層析：是吸附層析，依賴于蛋白質(zhì)和其配體（ligand）之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。第65頁(yè),共76頁(yè)，星期六，2024年，5月陽(yáng)離子交換層析過(guò)程離子交換樹脂蛋白質(zhì)高離子強(qiáng)度洗脫液洗高離子強(qiáng)度洗脫液洗加樣平衡液