熒光顯微鏡的基本使用方法

關(guān)于熒光顯微鏡的基本使用方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解熒光顯微鏡的基本原理；2.掌握熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和使用注意事項(xiàng)；第2頁,共22頁，星期六，2024年，5月自發(fā)性熒光物質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光。肝貯脂細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)的維生素A呈綠色熒光。某些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類物質(zhì)（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光。組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。嗜中性粒細(xì)胞中脫氫酶輔酶呈現(xiàn)一定的熒光。第3頁,共22頁，星期六，2024年，5月第4頁,共22頁，星期六，2024年，5月優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高對(duì)細(xì)胞的刺激小能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察熒光的有無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途第5頁,共22頁，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)原理光源激發(fā)濾色鏡分色鏡發(fā)射濾色鏡（阻擋濾片）第6頁,共22頁，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)原理熒光顯微鏡的光路及主要部件光源激發(fā)光擋片激發(fā)濾色鏡分色鏡發(fā)射濾色鏡第7頁,共22頁，星期六，2024年，5月第8頁,共22頁，星期六，2024年，5月Microscopeswithanupright-styleframearecapableofproducingfluorescenceilluminationeitherthroughepiscopicordiascopicopticalpathways,althoughthelatterisrarelyusedtoday.Epi-illuminatorsusuallyconsistofamercuryorxenonlamphousecoupledtoaverticalilluminatorthatispositionedabovethemainframeinaseparateassembly.Themicroscopenosepieceandtransmittedlightcomponents(diascopicilluminator,condenser,fielddiaphragm,filters,etc.)arebuiltintothemainframe,whilefluorescencecomponentsarehousedintheverticalilluminator.Theseilluminatorsoftencontainarevolvingorslidingturretthathousesfourtosix"cubes"thatcontainamixtureofinterferencefiltersincludingabarrierfilter,dichroicmirror,andanexcitationfilter.Asillustratedabove,lightemittedfromthelamppositionedintheepiscopiclamphousepassesthroughacollectorlensandthenthefieldandaperturediaphragmsbeforeenteringthefirstinterferencefilterinthecubeset,theemissionfilter.Thislightisthendirectedthroughtheobjectiveandontothespecimenbyaspecialdichroicmirrorthatreflectscertainwavelengthswhilepassingothers.Secondaryfluorescence,emittedbyfluorophoresresidinginthespecimen,travelsbackthroughtheobjectiveandthedichroicmirrorbeforepassingthroughabarrierfilterandintothemicroscopeeyepiecesorcamerasystem.第9頁,共22頁，星期六，2024年，5月激發(fā)光源高壓汞燈擁有313,337,365,405,436,546,and577

納米的峰值譜。高壓

Xenon燈有連續(xù)的可見光光譜范圍,光源強(qiáng)度比較平均。汞燈光譜第10頁,共22頁，星期六，2024年，5月激發(fā)濾色塊具有多套激發(fā)濾色塊：激發(fā)濾色鏡（ExcitationFilter），分光鏡（DichromaticMirror），發(fā)射濾色鏡（EmissionFilter）。激發(fā)濾色塊六孔激發(fā)塊轉(zhuǎn)盤第11頁,共22頁，星期六，2024年，5月多用途型BX-RFA(適合多種科研要求)及通用型BX-URA2?？赏瑫r(shí)使用6種熒光激發(fā)塊，“輕撥式”激發(fā)塊轉(zhuǎn)換功能，使不同熒光激發(fā)之間的迅速轉(zhuǎn)換非常方便，并可消除震動(dòng)，有利于復(fù)染樣品的熒光觀察。激發(fā)塊標(biāo)識(shí)在暗室環(huán)境中發(fā)光，在暗室中也能很容易地選擇需要的熒光激發(fā)塊。另外，根據(jù)需要還可以選擇6孔濾色片滑塊(U-RSL6/U-RSL6EM)安放激發(fā)濾色片和發(fā)射濾色片進(jìn)行熒光觀察。第12頁,共22頁，星期六，2024年，5月第13頁,共22頁，星期六，2024年，5月BX51在鏡基上裝有3個(gè)濾色片（ND6，ND25，LBD），另外，還可以選裝第四個(gè)。鏡基側(cè)面的拉桿可以很容易地插入/取出濾色鏡。SpecimencolorfadingcanbedelayedbyreducingtheexcitationlightintensitywithNDfilters.UsetheNDfiltersasfarastheydonothinderobservations.InserttheNDfilters(U-25ND6and/orU-25ND25)withthemarkedsidefacingtowardtheobserver.第14頁,共22頁，星期六，2024年，5月第15頁,共22頁，星期六，2024年，5月1、

該鏡可作為明視場(chǎng)顯微鏡使用，也可作為熒光顯微鏡使用，根據(jù)需要，做相應(yīng)的附件連接，開啟相應(yīng)的電源。禁止亂調(diào)設(shè)置，以免影響他人正常使用。

2、

作為明視場(chǎng)顯微鏡使用；A、接通電源后，打開顯微鏡底座前的電源開關(guān)，按光亮需要調(diào)節(jié)底座右側(cè)的滑竿。B、根據(jù)需要，調(diào)節(jié)底座光柵和聚光器光柵及其高度，可獲得最佳的圖象效果。C、需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上的照相按扭。

3、

作為熒光顯微鏡使用；A、先關(guān)閉熒光通道，再打開熒光激發(fā)器電源，等待15分鐘。B、等待期間，打開顯微鏡光源，找到需要觀察的樣品，選用合適的物鏡，調(diào)整焦距。C、關(guān)閉顯微鏡光源，打開熒光通道。D、需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上的照相按扭。第16頁,共22頁，星期六，2024年，5月細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)DNA的直接熒光染色第17頁,共22頁，星期六，2024年，5月線粒體GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥根（顯示葉綠體）葉片第18頁,共22頁，星期六，2024年，5月注意事項(xiàng)激發(fā)光擋片的使用----減少淬滅第19頁,共22頁，星期六，2024年，5月注意事項(xiàng)熒光的淬滅與激發(fā)光的照射時(shí)間成正比，因此應(yīng)盡量減少觀察時(shí)間外激發(fā)光對(duì)樣品的照射。激發(fā)光擋片可以部分或完全阻斷激發(fā)光光路。在正式觀察樣品之前，激發(fā)光光路應(yīng)該處于完全阻斷狀態(tài)。否則，在我們將樣品放到載物臺(tái)上，移動(dòng)樣品臺(tái)將樣品調(diào)整到物鏡位置，找到要觀察的細(xì)胞并進(jìn)行調(diào)焦的過程中，樣品上的熒光可能已經(jīng)發(fā)生了相當(dāng)程度的淬滅。為了避免觀察前不必要的淬滅，上述一系列操作需要在透射光源下進(jìn)行。當(dāng)眼睛離開物鏡進(jìn)行記錄或?qū)@微鏡交給合作實(shí)驗(yàn)者觀察時(shí)，要隨手阻斷激發(fā)光光路。實(shí)踐結(jié)果表明，熟練、規(guī)范和合理的觀察操作可以將樣品淬滅對(duì)觀察和記錄造成的影響降低到最小限度。熒光信號(hào)的淬滅還與激發(fā)光的強(qiáng)度成正比。因此，在可以觀察到熒光信號(hào)的情況下，應(yīng)該盡量降低激發(fā)光的強(qiáng)度。這樣做還有利于降低背景。第20頁,共22頁，星期六，2024年，5月NOTESTheinsideoftheultrahigh-pressuremercuryburnerisveryhotandhazardousduringlightingandforabout10minutesafterturningoff.Donotopenthelamphousinginthisperiod.Themercuryburnerhasaservicelifeperiodof200hours(USH102D)or300hours(HBD103W/2).Whenthehourcounteronthepowersupplyunitindicatesthisvalue,setthemainswitchto“O”(OFF)andwaitformorethan10minutesbeforereplacingthemercuryburner.Unlikeelectricbulbs,themercuryburnerse