RNA干擾Nucleostemin基因對人食管癌Eca109細胞株增殖影響的實驗研究-2

1/1RNA干擾Nucleostemin基因對人食管癌Eca109細胞株增殖影響的實驗研究RNA干擾Nucleostemin基因對人食管癌Eca109細胞株增殖影響的實驗研究作者：

鄭學芝，劉桂蓮，李麗，孫衛(wèi)，念紅，胡靜,蔡子微【摘要】目的篩選NS基因特異性siRNA陽性細胞克隆，研究NS基因特異性RNA干擾對Eca109細胞株體外增殖能力的影響。

方法用脂質體法將NS特異性siRNA表達載體轉染Eca109細胞，Zeocin抗生素壓力篩選后用PCR方法鑒定陽性克隆；MTT法檢測各組細胞的生長增殖情況，RTPCR方法檢測NS基因表達量的變化情況。

結果與對照組比較，silencer組腫瘤細胞趨于分化，細胞增殖抑制率超過80%(P0.01)，差異具有顯著性；NS基因表達量下降。

結論NS基因特異性RNA干擾抑制人食管癌Eca109細胞株體外增殖，使NS基因表達量下降。

【關鍵詞】Nucleostemin（NS）;RNA干擾；食管癌；基因表達；細胞增殖Abstract：

ObjectiveToscreenNSgenespecificpositivecellclones,andinvestigatetheeffectofhumanesophaguscancerEca109cellsproliferationinvitrobyNSgenespecificRNAinterference.MethodsTheNSsiRNAexpressionvectorwastransfectedintohumanesophaguscancerEca109cellsusingLIPOFECTAMINETMXXXX年新發(fā)現的一種蛋白質核因子［1］，該基因在干細胞及人類的數種腫瘤細胞中表達豐度很高，但在分化的成體組織中，該基因卻不表達。

二位學者提出干細胞與癌細胞均由相同的蛋白質－NS來決定其細胞自我復制的能力，NS可能是干細胞和腫瘤細胞通過G2/S檢驗點的特異性調控因子。

本文將以人食管癌Eca109細胞株為實驗材料探討NS基因特異性RNA干擾對食管癌Eca109細胞株體外增殖能力的影響。

1材料和方法1.1材料人食管癌Eca109細胞購于上海細胞所；1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶為Gibco公司；PCDNA4/CNSsilencer質粒[2]；MTT、DMSO、Zeocin、LipofectamineTM2000Reagent：

Invitrogen公司;RNA、DNA試劑盒;RTPCR試劑盒：

TaKaRa公司;引物合成：

上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)及NS基因轉染人食管癌Eca109細胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2潮濕空氣的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

脂質體法將PCDNA4/CNSsilencer質粒及空載體PCDNA4/Cvector質粒轉染Eca109細胞，分別命名為silencer組、vector組，未轉染的Eca109細胞記為normal組。

轉染細胞進行Zeocin抗生素篩選；陽性細胞克隆繼續(xù)在含Zeocin抗生素的培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)。

1.2.2陽性細胞克隆的鑒定提取克隆細胞基因組DNA，以Zeocin基因為目的基因，通過PCR方法進行細胞克隆外源基因整合陽性鑒定，同時以normal組腫瘤細胞作對照。

其引物序列為：

上游引物5atggccaagttgaccagtgc；下游引物為5tcagtcctgctcctcggcca。

PCR反應條件為：

94℃預變性5min，然后94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循環(huán)，最后72℃延伸10min；PCR產物大小約370bp。

1.2.3生長曲線的繪制[3]將三組細胞傳到24孔板上（1104細胞/孔），每組18復孔，分別于24h、48h、72h、96h、120h、144h用計數板進行活細胞計數，繪出各組細胞的生長曲線。

1.2.4細胞的形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化情況。

1.2.5MTT比色法測定細胞增殖抑制率[3]在96孔培養(yǎng)板上接種三組細胞，每組24復孔（1103細胞/孔），分別于24h、48h、72h三個時間段進行MTT測定，以培養(yǎng)液做空白對照并調零，用酶標儀測定490nm處的吸光度值（OD值），每次每組測定8復孔。

細胞增殖抑制率＝1-細胞存活率即細胞增殖抑制率＝（1-silencer組OD值/Normal組OD值）100%1.2.6各組腫瘤細胞NS基因表達水平檢測提取腫瘤細胞總RNA，用RTPCR方法驗證各組腫瘤細胞NS基因表達情況。

參照genebank中NS和GAPDH的基因序列及參考文獻[4]設計引物如下:NS基因上游P1：

5atgaaaaggcctaagttaaagaaagc，下游P2：

5gctctccaaattctcctttggta；GAPDH上游為P3：

5ggtggacctgacctgccgtctaga，下游P4：

5ttactccttggaggccatgtggg；擴增產物長度分別為570bp和280bp，在同一體系內反應，PCR反應條件為94℃預變性5min，94℃變性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.2.7統(tǒng)計學分析實驗數據以s表示，統(tǒng)計學處理采用SPSS11.5軟件，進行t檢驗。

2結果2.1PCR法鑒定陽性細胞克隆抗Zeocin的細胞克隆部分PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1；silencer組與vector組皆檢測到Zeocin基因條帶，而normal組無，即細胞克隆外源基因整合陽性。

2.2細胞生長曲線的繪制各時間段silencer組細胞數目低于對照vector組（P0.01）和normal組（P0.01），差異具有顯著性；細胞生長曲線見圖2。

2.3各組細胞的形態(tài)學變化silencer組細胞與對照vector組和normal組相比體積變小并趨向于均一，多數細胞由梭形趨向變圓，核質比變小，瘤巨細胞減少，細胞趨于分化。

2.4MTT比色法測定細胞增殖能力細胞培養(yǎng)24h后，silencer組細胞增殖抑制率分別為normal組（P0.01）的94%和vector組（P0.01）的93%；細胞培養(yǎng)48h后，silencer組細胞增殖抑制率分別為normal組（P0.01）的80%和vector組（P0.01）的78%；細胞培養(yǎng)72h后，silencer組細胞增殖抑制率分別為normal組（P0.01）的88%和vector組（P0.01）的87%；細胞增殖曲線見圖3。

2.5各組腫瘤細胞NS基因表達水平silencer組腫瘤細胞NS基因表達水平明顯低于對照vector組和normal組，見圖4。

3討論NS基因是一種p53結合蛋白，主要存在于核仁中，在核質中也有低量表達；在干細胞處于早期多潛能狀態(tài)時該基因的表達豐度很高，而在分化開始時，這個基因的表達卻突然幾乎完全消失[1]。

本室與中科院遺傳發(fā)育研究所合作證實了多種腫瘤組織中都有NS基因的表達[5，6]，運用siRNA真核表達載體，使宮頸癌Hella細胞的增殖被抑制，細胞內NS基因的表達量下降[7，8]。

本實驗將PCDNA4/CNSsilence載體轉染人食管癌Eca109細胞，同步轉染PCDNA4/Cvector空載體作對照。

經過Zeocin抗生素壓力篩選獲得陽性細胞克隆，并通過PCR方法驗證克隆細胞外源基因整合陽性。

與對照組vector和normal組比較，silencer組細胞的腫瘤生物學行為發(fā)生了顯著的變化，細胞增殖明顯變慢，趨向于分化；MTT法進行細胞增殖抑制率測定顯示silencer組細胞的增殖速率明顯低于兩對照組；細胞增殖抑制率大于80%；各組細胞RTPCR產物電泳結果顯示silencer組腫瘤細胞中NS基因表達量明顯下降。

實驗結果表明，我們構建的針對NS基因的特異性siRNA的表達載體PCDNA4/CNSsilencer是成功并有效用的，將其轉染入人食管癌細胞后，通過RNA干擾機制使部分NS基因沉默，從而產生了抑制Eca109細胞分裂、增殖的效應。

同時提示調節(jié)NS基因活性可能對腫瘤有防治作用，NS基因能夠預測腫瘤的發(fā)展趨勢，有可能成為一種新的腫瘤標記物。

但是NS蛋白活動的精確分子機制尚不完全清楚，這仍然需要大量的實驗工作去證實。

運用RNA干擾技術對NS基因進行深入研究可能會揭示或部分揭示干細胞和腫瘤細胞增殖之迷，為腫瘤的早期診斷、基因治療和預后及以干細胞為基礎的組織工程等提供理論依據和工作基礎。

【參考文獻】［1］TsaiRY，MckayRD.Anucleolarmechanismcontrollingcellproliferationinstemcellsandcancercells[J].GenesDev,2002,16(23):29913003.[2]蔡子微，劉思金，勞為德，等.NS特異性siRNA真核表達載體的構建[J].牡丹江醫(yī)學院學報，2003，24（3）:14.[3]薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術[M].北京：

科學技術出版社，2001.340343.[4]劉思金，薛延，勞為德，等.人類骨橋蛋白（hOPN）在細胞增殖中的功能研究[J].高技術通訊，2003，3（2）：

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