KRAS基因在胰腺疾病中突變的檢測及其臨床意義

【摘要】目的：探討KRAS基因突變在胰腺疾病中的臨床意義和在胰腺癌診斷中的價值。方法：合酶鏈反應一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)方法分別檢測胰腺癌、癌旁組織、手術(shù)切緣正常組織、慢性胰腺炎石蠟包埋組織的KRAS突變并進行DNA測序確認。結(jié)果胰腺癌KRAS12密碼子突變率(79．2％)顯著高于慢性胰腺炎(33．3％，P<0．01)，且在切緣正常組織一癌周導管增生一癌周不典型增生一胰腺癌過程中，突變率有逐漸上升的趨勢。突變方式以12密碼子GGT-GAT、GTT、CGT為主，同一例患者突變方式一致。結(jié)論：KRAS基因突變在胰腺癌發(fā)生中起作用，但KRAS基因突變作為胰腺癌診斷的分子標志缺乏特異性?！娟P(guān)鍵詞】胰腺癌；慢性胰腺炎；KRAS基因；突變胰腺癌臨床確診時大多已屬晚期，其5年生存率僅為1％～5％。提高其早期發(fā)現(xiàn)率可使更多患者獲得手術(shù)切除的機會而提高其生存率。眾多研究表明，KRAS基因與胰腺癌高度相關(guān)，其第一外顯子12密碼子的點突變在胰腺導管腺癌組織中高達70％～100％，且是胰腺腫瘤發(fā)生的早期事件，可用于早期診斷胰腺癌。而近來研究卻表明，KRAS突變亦可見于良性胰腺疾病及正常胰腺，對它可作為胰腺癌早期診斷的分子標志提出了疑問。本研究旨在探討KRAS突變在胰腺疾病中的臨床意義和在胰腺癌診斷中的價值。材料和方法1．對象選擇：收集上海長海醫(yī)院1996年1月至2000年2月良惡性胰腺疾病術(shù)后石蠟包埋組織標本，診斷由手術(shù)及病理證實，所有病例均有完整的手術(shù)記錄資料及臨床資料。包括：胰腺導管腺癌患者的胰腺導管腺癌24例、癌旁胰腺導管增生58例、癌旁胰腺導管不典型增生19例和手術(shù)切緣正常胰腺16例；惡性胰腺黏液性囊腺瘤1例；慢性胰腺炎24例，選擇胰腺導管增生組織蠟塊，慢性胰腺炎患者經(jīng)1～5年隨訪全部健在，且無一例發(fā)展為胰腺癌。7例正常胰腺組織為非胰腺疾病患者尸檢標本。胰腺癌細胞株P(guān)atu一8988由德國Marbury市Philips大學分子生物學和分子病理學研究所Elsasserl~t士惠贈。2．標本處理：每份標本一部分切成5m薄片，HE染色光鏡下組織鑒定，另取10m薄片3～5片(表面積約1．0cm2)放入1．5ml消毒塑料離心管中，經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇漂洗，離心后干燥沉淀物。3．DNA的提?。翰捎弥x心式小量組織基因組DNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程公司)，按說明書操作。經(jīng)純度鑒定后一20℃?zhèn)溆谩?．半巢式聚合酶鏈反應(PCR)：引物合成：由上海生工生物工程公司合成，其序列為R1=5ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT3：R2=5TCAAAGAATGGTCCTGGACC3：R3=5TAATATGTCGACTAAAACAAGATTTACCTC3。配對方式為R1一R2，R1．R3。半巢式PCR需經(jīng)2次PCR，1次酶切。DNA擴增儀為Perkin-Elmer9600型，PCR試劑盒購于Promega公司的PCRCore系統(tǒng)。PCR反應總體積50l，含4種dNTP，濃度各0．2mmol／L，MgC121．5mmol／L，PCR緩沖液1×(不含MgC12)，引物濃度各為1~mol／L，Taq酶1．25U／50l。每次PCR均設置陰、陽性對照各1例，陽性對照所用模板及引物系Promega公司配給。R1和R2為引物，PCR參數(shù)為95℃、5min預變性，加入Taq酶，94121min，52℃1min，72℃I．5min，循環(huán)25次，最后72℃5min。擴增片段為157bp，酶切條件為50l反應體系中含0．25lBstN1(Bio-lab公司)、0．5lBSA、5l緩沖液，60℃酶切2h，煮沸滅活酶。取2l酶切產(chǎn)物用作第2次PCR模板，R1和R3為引物，PCR條件同前，惟循環(huán)次數(shù)為3O次。擴增片段為135bp，取8l產(chǎn)物作2％瓊脂糖凝膠電泳分析。5．單鏈多態(tài)構(gòu)象性分析(SSCP)：為尋找基因變異，每一被檢樣本均在12％非變性聚丙烯酰胺凝膠下進行電泳，觀察SSCP條帶情況。以正常人外周血白細胞DNA擴增產(chǎn)物為陰性對照、胰腺癌細胞株P(guān)am-8988DNA擴增產(chǎn)物為陽性對照，電泳前將PCR產(chǎn)物煮沸5min熱變性，立即置冰浴，然后經(jīng)4℃、35V電泳，電泳21h左右，至二甲苯青距膠底部約0．5C1TI，結(jié)束電泳，以銀染顯示條帶，照相分析。對每個樣本均經(jīng)2～3次電泳以保證實驗的準確性。6．DNA測序：所有經(jīng)PCR-SSCP篩選分析、顯示條帶異常的胰腺癌和慢性胰腺炎患者的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收式純化、克隆入pUCm-T載體中，并進行插入片段的序列分析。測序用PE公司測序試劑盒，在PE公司ABIPRISM377DNA測序儀上進行。7．統(tǒng)計學分析：應用SAS統(tǒng)計軟件，采用Y檢驗、Fisher精確檢驗和t檢驗。結(jié)果1．KRAS12密碼子突變檢測結(jié)果：由表1可知，由切緣正常組織一癌周導管增生組織一癌周不典型增生組織一胰腺癌組織的過程中，KRAS12密碼子突變率有逐漸上升的趨勢，且胰腺癌組突變率明顯高于正常胰腺、慢性胰腺炎、切緣正常組織及癌周導管增生組(P<0．01)。突變方式以12密碼子GGT-GAT、GTT、CGT為主，未見13密碼子突變(表2)。2．胰腺癌組織KRAS12密碼子突變與臨床病理指標的關(guān)系：由表3可知，胰腺癌組織KRAS12密碼子突變與各臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性。3．K．RAS12密碼子突變與慢性胰腺炎臨床狀況的關(guān)系：由表4可知，KRAS12密碼子突變與慢性胰腺炎各項臨床參數(shù)無明顯相關(guān)性。轉(zhuǎn)導了RAS基因的NIH／3T3細胞能發(fā)生轉(zhuǎn)化，從而確定了其癌基因的地位。RAS突變能導致保守區(qū)氨基酸序列改變，產(chǎn)生持續(xù)性刺激信號，導致細胞持續(xù)生長。RAS為一基因家族，文獻報道胰腺癌KRAS突變率高達70％～100％，且?guī)缀醵技杏诘?外顯子的12密碼子。KRAS12密碼子的野生型為GGT，突變型常見為GAT、GTT、CGT，此三種類型占所有突變類型的60％～100％。Cerny等…在亞硝胺誘發(fā)敘利亞倉鼠胰腺癌的模型中發(fā)現(xiàn)，在誘變劑作用下，胰腺導管腺癌發(fā)生之前存在小灶性增生、乳頭狀增生和原位癌的序列性導管損傷，其中均可檢測到KRAS基因異常，因而認為KRAS突變是胰腺導管腺癌發(fā)生的早期事件。因此，KRAS突變可能預示著潛在的早期胰腺癌，這也就是KRAS基因突變的早期診斷價值之所在。而最近Rivera等在42例慢性胰腺炎患者中篩選出11例存在導管增生者為實驗組，4例無導管增生者為對照組檢測KRAS突變，應用顯微切割法(microdissection)在組織切片上精確地切割胰腺導管上皮，經(jīng)抽提DNA、PCR擴增、探針雜交、DNA直接測序，結(jié)果示實驗組18％(2／11)患者存在KRAS突變，對照組均為陰性，因而得出：慢性胰腺炎有胰腺導管增生且存在KRAS突變是慢性胰腺炎向胰腺癌發(fā)展的潛在原因。對774例慢性胰腺炎患者(1991～1999年)的回顧性分析表明，KRAS12密碼子平均突變率為13％J。而最近對2015例慢性胰腺炎患者的流行病學研究發(fā)現(xiàn)，慢性胰腺炎患者發(fā)生胰腺癌的危險性較正常人群顯著為高，而且胰腺癌的發(fā)生與慢性胰腺炎病程呈正相關(guān)，經(jīng)10、20年的隨訪，分別有2％和4％的慢性胰腺炎發(fā)展為胰腺癌，從而提出，慢性胰腺炎傾向于向胰腺癌發(fā)展HJ。一個正常細胞轉(zhuǎn)化為惡性表型之前必須經(jīng)歷多種變化，有研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌周組織發(fā)生胰腺導管增生顯著高于非惡性對照組，與癌變模型極相似，提出可能由胰腺導管增生向胰腺癌發(fā)展。Luttges等J發(fā)現(xiàn)，KRAS突變陽性的胰腺導管腺癌，其癌旁組織胰腺導管增生亦存在KRAS突變。因此，目前認為，慢性胰腺炎與胰腺導管腺癌的相關(guān)性本質(zhì)上是由于慢性胰腺炎中存在胰腺導管增生，其被認為是胰腺導管腺癌發(fā)生中的一個環(huán)節(jié)，KRAS突變是此種細胞演進過程中的分子事件。目前KRAS突變存在在研新藥安卓健，司美替尼。本研究中胰腺癌KRAS基因突變率(79％)顯著高于慢性胰腺炎(33．3％)，表明以KRAS基因為分子標志診斷胰腺癌敏感性較高，但缺乏特異性。進一步發(fā)現(xiàn)，在切緣正常組織一癌周導管增生組織一癌周不典型增生組織一胰腺癌組織的過程中，KRAS突變率有逐漸升高的趨勢，且發(fā)現(xiàn)無KRAS突變的胰腺癌，其癌旁和手術(shù)切緣各種組織均無KRAS突變。對突變者的PCR產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)，胰腺癌與慢性胰腺炎KRAS12密碼子突變方式均表現(xiàn)為GGpGAT、GTT、CGT，且同一例患者突變方式一致。此雖與倉鼠胰腺癌模型中的結(jié)果相似，表明KRAS突變在胰腺癌發(fā)生中起作用，但K