川芎嗪洗脫支架預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的實驗研究

1/1川芎嗪洗脫支架預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的實驗研究川芎嗪洗脫支架預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的實驗研究【摘要】目的：

研究川芎嗪洗脫支架(TES)抑制內(nèi)膜增生防治再狹窄的效果及其機制。

方法:小型豬9只隨機分為3組,實驗組植入TES(TES組),對照組植入金屬裸支架(BMS組)或雷帕霉素洗脫支架(SES組)。

術(shù)后第28天處死動物，組織病理學(xué)檢測內(nèi)膜厚度，免疫組織化學(xué)法測定增殖細胞核抗原(PCNA)，TUNEL法測細胞凋亡，掃描電鏡觀察內(nèi)皮細胞的覆蓋情況。

結(jié)果:術(shù)后第28天病理學(xué)證實，TES組較BMS組管腔面積增加、支架內(nèi)新生內(nèi)膜面積和面積再狹窄百分比減?。≒lt;0.05）。

BMS組較TES組PCNA細胞陽性率明顯增加（Plt;0.05），TES組較SES組PCNA陽性率增加（Plt;0.05）。

TES組較BMS組單位面積內(nèi)平滑肌細胞(VSMC)凋亡數(shù)明顯增加（Plt;0.05）。

掃描電鏡顯示TES組和BMS組28d血管內(nèi)皮細胞完全覆蓋，SES組基本覆蓋，但內(nèi)膜不平整。

結(jié)論:TES可以顯著抑制VSMC增殖、遷移并促進VSMC凋亡,但不影響血管內(nèi)皮愈合，是防治血管再狹窄的新策略。

【關(guān)鍵詞】川芎嗪；藥物洗脫支架；再狹窄；免疫組織化學(xué)經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)是冠心病治療的一個重要手段，但PCI術(shù)后再狹窄一直是影響PCI療效的主要問題。

單純球囊擴張術(shù)由于早期血管彈性回縮及晚期內(nèi)膜過度增殖、血管再重塑,使得術(shù)后再狹窄率高達30％～50％。

冠狀動脈內(nèi)支架術(shù)能降低術(shù)后即刻殘余狹窄并有效限制血管彈性回縮和動脈再塑型，使得PCI術(shù)后的再狹窄率明顯下降。

但由于支架植入術(shù)后依然存在內(nèi)膜增殖，再狹窄發(fā)生率仍達20％～30％。

藥物洗脫支架(DES)通過抑制炎癥反應(yīng)和細胞增殖、延緩血管內(nèi)皮化，使PCI術(shù)后的再狹窄率降至10％以內(nèi)。

但近期公布的隨機試驗結(jié)果認為,DES有增加遠期非心性死亡和晚期血栓所致的心源性死亡和(或)心肌梗死的風(fēng)險［1］。

發(fā)掘新的抑制血管平滑肌細胞（VSMC）增殖和血管內(nèi)膜的增生而不影響血管內(nèi)皮愈合的洗脫藥物,是研制新型DES和防治支架內(nèi)再狹窄的新策略。

本研究旨在研究川芎嗪洗脫支架(TES)抑制內(nèi)膜增生、防治再狹窄的療效和可能的機制。

1材料與方法1.1動物的選擇和預(yù)處理選用4～6月齡，體重為25～35kg小型豬9只（均有檢疫合格證明），雌雄不限。

手術(shù)前1d給予阿司匹林300mg、氯吡格雷300mg頓服。

1.2支架和涂層實驗組(TES組)TES由金屬裸支架(BMS)經(jīng)噴涂川芎嗪單體(四甲基砒嗪，純度為99%,購于上海華美制藥廠)制成,含川芎嗪200g。

對照組(SES組)雷帕霉素洗脫支架(SES)是由BMS經(jīng)噴涂雷帕霉素（購自福建科瑞藥業(yè)有限公司，純度gt;98%）制成，含雷帕霉素130g。

另一對照組(BMS組)采用相同結(jié)構(gòu)BMS。

實驗組和對照組支架均為不銹鋼316L金屬管形網(wǎng)狀支架，兩組支架大小為2.5～3.0mm/16mm。

1.3冠脈內(nèi)支架植入豬術(shù)前予氯胺酮12mgkg-1肌肉注射基礎(chǔ)麻醉，3％戊巴比妥鈉20mgkg-1術(shù)前和術(shù)中間斷靜脈注射強化麻醉。

備皮及皮膚消毒后穿刺股動脈,插入6F動脈鞘注入肝素150～200Ukg-1，常規(guī)行冠脈造影，為避免局部藥物釋放干擾,常規(guī)對同一頭豬左前降支及左回旋支冠狀動脈中段各植入相同類型的支架，支架球囊與血管直徑比值為(1.1～1.2)∶1，10～15atm（1atm=101.325kPa）擴張30s,形成冠狀動脈狹窄模型［2］。

術(shù)后每日喂阿司匹林100mg、氯吡格雷75mg，并予以普通飲食喂養(yǎng)。

1.4病理學(xué)觀察術(shù)后第28天行冠狀動脈造影后處死動物，剝離冠狀動脈，固定24h后切片、染色。

對內(nèi)膜、中膜和外膜進行組織學(xué)分析，運用計算機圖像分析系統(tǒng)測定血管狹窄程度。

用免疫組織化學(xué)法測定增殖細胞核抗原(PCNA),TUNEL法測VSMC凋亡,掃描電鏡下觀察內(nèi)皮細胞的覆蓋情況。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理3組數(shù)值均采用x-s表示,兩組間用獨立樣本t檢驗,使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析,Plt;0.05為差異有顯著意義。

2結(jié)果2.1小型豬支架植入情況9只豬均成功在左前降支及左回旋支冠狀動脈中段植入支架,支架植入術(shù)后即刻冠狀動脈造影證實管腔通暢,無充盈缺損、管壁夾層、栓塞、支架移位或遠端冠狀動脈痙攣,無急性血栓形成。

所有動物均順利完成術(shù)后第28天的復(fù)查。

2.2支架植入28d后的冠狀動脈內(nèi)膜增殖情況見表1。

TES組與BMS組相比,支架內(nèi)面積無顯著差異,但管腔面積、新生內(nèi)膜面積和平均面積狹窄百分比有顯著性差異（Plt;0.05）。

TES組與SES組相比支架內(nèi)面積、管腔面積、新生內(nèi)膜面積和平均面積狹窄百分比均無顯著差異。

見圖1。

表1支架植入28d后冠狀動脈內(nèi)膜增生情況的比較2.3PCNA陽性率及VSMC凋亡結(jié)果見表2。

TES組內(nèi)膜PCNA陽性率較BMS組明顯降低（Plt;0.01）,TES組較SES組PCNA陽性率增加（Plt;0.05）。

TES組較BMS組單位面積內(nèi)VSMC凋亡數(shù)明顯增加（Plt;0.01），TES組與SES組單位面積內(nèi)VSMC凋亡數(shù)差異無顯著意義。

2.4掃描電鏡結(jié)果見圖2。

表2支架植入28d后PCNA陽性率和單位面積VSMC凋亡數(shù)的比較TES和BMS組28d血管內(nèi)皮細胞完全覆蓋，SES組基本覆蓋，但內(nèi)膜不平整。

3討論川芎嗪是從中藥傘形科植物川芎(LigusticumChuanxiong)的根莖中提取的有效成分,化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪。

已有臨床試驗證實,口服川芎嗪具有防治PCI術(shù)后再狹窄作用［3］。

動物實驗顯示，TES與BMS相比，新生內(nèi)膜面積明顯減少,管腔面積明顯增大，TES能抑制內(nèi)膜增殖,無致栓性,具有良好的生物相容性［4］。

本實驗證實,與BMS相比，TES可顯著抑制支架植入術(shù)后血管內(nèi)膜增生和減少再狹窄的發(fā)生。

TES預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的作用機理為:(1)抑制VSMC增殖、遷移。

內(nèi)皮損傷后VSMC增殖并呈激活狀態(tài),細胞凋亡減少，PCNA、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、Bcl-2和c-myc的表達增高,Bax表達降低［5］。

而川芎嗪通過抑制VSMCⅠ型膠原、Ⅳ型膠原、FGF、PDGF和c-myc表達,達到抑制VSMC增殖的作用［6］。

同時川芎嗪能通過降低細胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白（CaM）、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）活性下調(diào)細胞內(nèi)c-mya、PCNA表達水平，從而顯著抑制血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的VSMCs增殖［7］。

并且通過下調(diào)PDGF-BB刺激的骨橋蛋白mRNA的表達,削弱了VSMC的遷移能力［8］。

本實驗亦證實，內(nèi)膜PCNA陽性率TES組較BMS組明顯降低,提示TES可以抑制新生內(nèi)膜VSMC的增殖,但較SES抑制新生內(nèi)膜VSMC的增殖作用要弱。

(2)促進VSMC調(diào)亡。

川芎嗪通過抑制bcl-2的表達、促進Bax的表達,從而促進VSMC的凋亡,TUNEL染色陽性細胞數(shù)增多［6］。

本實驗證實,TES組較BMS組單位面積內(nèi)VSMC凋亡數(shù)明顯增加，提示TES能夠誘導(dǎo)VSMC調(diào)亡。

由此可見，抑制VSMC增殖、遷移并促進VSMC凋亡可能是TES預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的主要機制。

第1代DES導(dǎo)致支架內(nèi)血栓的確切機制并未明確，目前考慮與手術(shù)操作本身、病人和病變的特性、支架的設(shè)計、過早的停用抗血小板藥物等幾個因素有關(guān)。

雖然DES的最初目的是防止VSMC的增殖和遷移，但同時也導(dǎo)致了內(nèi)皮化延遲或內(nèi)皮功能異常，誘導(dǎo)了凝血激酶的表達，最終形成了前凝血激酶的環(huán)境［9］。

TES相對于第1代DES具有其獨特的優(yōu)勢：

(1)血管內(nèi)皮細胞的保護作用。

川芎嗪作用于正常人胎兒臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）后,通過上調(diào)一氧化氮合酶(NOS)、彈力蛋白、5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶、谷光甘肽s-轉(zhuǎn)移酶基因的表達，下調(diào)脂蛋白(a)、熱休克蛋白60、細胞趨化因子和細胞色素P450系列等基因的表達,從而在基因水平通過多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能［10］。

并且通過增加前列環(huán)素(PGI2)釋放,減少內(nèi)皮素（ET）基礎(chǔ)釋放量而對HUVECs具有促進增殖作用，并部分拮抗H2O2損傷HUVECs所致LDH、ET釋放增加，PGI2釋放減少和細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛生成增加的作用。

其機理可能與其抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)［11］。

動物實驗證實,川芎嗪可有效抑制結(jié)扎LAD后缺血再灌注對冠脈內(nèi)皮細胞及心肌的損傷,減輕冠狀動脈狹窄和心肌梗死的程度［12］。

(2)抗血小板聚集和血栓形成。

低濃度的川芎嗪通過抑制磷酸肌醇和TXA2的合成而發(fā)揮抗血小板作用;較高濃度的川芎嗪則通過結(jié)合血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物而抑制血小板的聚集［13］，并且通過增強NOS活性、刺激血小板中NO的生成［14］以及發(fā)揮鈣拮抗劑作用而使血小板內(nèi)鈣離子濃度降低,阻斷鈣離子對血小板激活和前列腺素的代謝［15］。

以上實驗結(jié)果均提示，川芎嗪在保護血管內(nèi)皮,保持血管壁的平滑、完整,預(yù)防血栓的形成等方面具有重要價值。

本實驗進一步證實,BMS組28d掃描電鏡觀察顯示支架表面有完整的內(nèi)膜組織覆蓋，TES組28d掃描電鏡觀察顯示有完整的內(nèi)膜組織覆蓋，但有較多的白細胞浸潤，考慮為多聚物引起的局部炎癥反應(yīng)。

SES表面血管內(nèi)皮基本覆蓋，但有較多纖維素、白細胞等積聚。

提示TES不影響血管內(nèi)皮的愈合，而SES組血管內(nèi)皮基本覆蓋，但纖維素等的積聚可能增加支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險。

由本實驗可知,TES通過抑制VSMC增殖、遷移并促進VSMC凋亡的作用，降低了支架植入術(shù)后再狹窄的發(fā)生。

同時由于其特有的血管內(nèi)皮細胞的保護作用和抗血小板聚集和血栓形成的作用，不影響血管內(nèi)皮的愈合，有降低支架內(nèi)血栓形成風(fēng)險的作用，是一種防治再狹窄的新策略。

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