《基因工程》(研究生)全冊配套完整課件

《基因工程》(研究生)全冊配套完整課件生物工程碩士課程基

因

工

程基因工程第一章概論第二章

基因工程的基本原理第三章

基因工程所需的基本條件第四章基因工程的操作過程第五章

目的基因的克隆與基因文庫的構建第六章

大腸桿菌基因工程第七章

酵母基因工程第八章疫苗的研究第九章

高等植物基因工程第十章哺乳動物基因工程基本要求：掌握基因克隆的基本工具。特別是不同的載體?？寺』虻幕痉椒āＴ鯓永没蛑亟M技術研究基因的結構、表達和調(diào)控。利用基因工程生產(chǎn)重組蛋白，基因工程在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上的應用。能夠設計一個基因克隆的程序。PCR技術基本原理和應用能夠根據(jù)酶切結果判讀酶切圖譜，以及判讀DNA序列的能力。參考書：Genecloning,T.A.Brown.Thirdedition.基因工程原理，吳乃虎編著，科學出版社基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學出版社。植物基因工程原理與技術，王關林，方宏筠主編，科學出版社。分子克隆實驗指南，J.Sambtook,EFFrish,TManiatis,金冬雁，黎孟楓等譯，科學出版社。分子生物技術－重組DNA的原理與應用（原著第三版），《美》B.R.格利克。J.J.帕斯捷爾納克，陳麗珊，任大明主譯（化學工業(yè)出版社）基因及其操作原理，齊義鵬編著，武漢大學出版社考核方式平時成績10分（考勤5、參與問卷調(diào)查5）模擬申請項目書40分(2011年12月4日之前交)期末考試50分（開卷）

模擬申請項目書要求：1、根據(jù)自己的知識背景和現(xiàn)在的工作，結合“基因工程”課所學的知識，設計一下自己的碩士研究生課題。2、具備前沿性、可行性、創(chuàng)新性。3、模板見下頁。一、課題基本信息：題目、摘要、關鍵詞二、報告正文：參照以下提綱撰寫，要求內(nèi)容翔實、清晰，層次分明，標題突出。（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）：項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析，需結合科學研究發(fā)展趨勢來論述科學意義；或結合國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中迫切需要解決的關鍵科技問題來論述其應用前景。附主要參考文獻目錄）項目的研究內(nèi)容、研究目標,以及擬解決的關鍵科學問題。（此部分為重點闡述內(nèi)容）擬采取的研究方案及可行性分析。（包括有關方法、技術路線、實驗手段、關鍵技術等說明）本項目的特色與創(chuàng)新之處。年度研究計劃及預期研究結果。（二）研究基礎與工作條件1、工作基礎（與本項目相關的研究工作積累和已取得的研究工作成績）2、工作條件（包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑，包括利用國家實驗室、國家重點實驗室和部門重點實驗室等研究基地的計劃與落實情況）3、申請人簡介（包括申請人和項目組主要參與者的學歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本項目有關的主要論著目錄和獲得學術獎勵情況及在本項目中承擔的任務。論著目錄要求詳細列出所有作者、論著題目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止頁碼等；獎勵情況也須詳細列出全部受獎人員、獎勵名稱等級、授獎年等）4、承擔科研項目情況（申請人和項目組主要參與者正在承擔的科研項目情況，包括自然科學基金的項目，要注明項目的名稱和編號、經(jīng)費來源、起止年月、與本項目的關系及負責的內(nèi)容等）5、完成科學項目情況（對申請人負責的前一個已結題科研項目（項目名稱及批準號）完成情況、后續(xù)研究進展及與本申請項目的關系加以詳細說明。另附該已結題項目研究工作總結摘要（限500字）和相關成果的詳細目錄）第一章概論一基因工程與生物工程的關系二基因工程的基本定義三基因工程的基本形式四生物（工程）技術的其他內(nèi)容五基因工程的發(fā)展史六基因工程的生物安全性七基因工程的意義生物工程：也叫生物技術，是生物科學與工程技術有機結合而興起的一門綜合性科學技術。一基因工程與生物工程等的關系特點：

以生物科學為基礎，運用先進的科學原理和工程技術手段來加工或改造生物材料，如DNA、蛋白質、染色體、細胞等，從而生產(chǎn)出人類所需要的生物或生物制品?；蚬こ碳毎こ贪l(fā)酵工程酶工程蛋白質工程生物（工程）技術的內(nèi)容：重組DNA技術(recombinantDNAtechnique）基因工程（GeneEngineering）遺傳工程（GeneticEngineering）基因克?。╣enecloning）分子克?。∕olecularCloning）基因操作（genemanipulation）二基因工程的基本定義

重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。二基因工程的基本定義

基因工程是指重組DNA技術的產(chǎn)業(yè)化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是基因重組、克隆和表達的設計與構建（即重組DNA技術）；而下游技術則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。三基因工程的基本形式第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表達經(jīng)典基因工程第二代基因工程蛋白編碼基因的定向誘變蛋白質工程第三代基因工程代謝信息途徑的修飾重構途徑工程第四代基因工程基因組或染色體的轉移基因組工程四生物（工程）技術

的其他內(nèi)容：細胞工程發(fā)酵工程酶工程蛋白質工程細胞工程

(cellengineering)按人們的設計，有計劃地改變或創(chuàng)造細胞的遺傳性狀，在體外大量培養(yǎng)和繁殖細胞群體、生物個體或株系。內(nèi)容：細胞融合，細胞拆合，染色體轉移，基因轉移，細胞或組織培養(yǎng)，細胞移殖，細胞重組，細胞雜交瘤等。酶工程

(enzymeengineering)利用重組DNA技術,根據(jù)酶所特有的生化催化特性，在常溫常壓下生產(chǎn)酶反應產(chǎn)品或酶純化的工藝。。內(nèi)容：酶反應器，酶分子修飾，酶的全人工合成，酶的固定化。又稱生化工程微生物工程,又稱發(fā)酵工程(fermentationengineering)從自然界中篩選或誘變育種獲得菌種?；蚬こ碳夹g構建工程菌。內(nèi)容：菌種選育，代謝途徑，調(diào)控機制研究，高密度發(fā)酵，生產(chǎn)各種產(chǎn)品。蛋白質工程

（proteinengineering）

蛋白質工程就是根據(jù)蛋白質的精細結構與功能之間的關系，利用基因工程的手段(包括基因的定點突變和基因表達)，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質分子。我國的蛋白質工程具有國際先進水平，產(chǎn)品包括重組人胰島素和溶血栓藥物，重組人尿激酶等。

蛋白質工程的研究內(nèi)容

通過改變蛋白質的活性部位，提高其生物功效；通過改變蛋白質的組成和空間結構，提高其在極端條件下的穩(wěn)定性，如酸、堿、酶穩(wěn)定性；通過改變蛋白質的遺傳信息，提高其獨立工作能力，不再需要輔助因子；通過改變蛋白質的特性，使其便于分離純化，如融合蛋白?-半乳糖苷酶（抗體）；通過改變蛋白質的調(diào)控位點，使其與抑制劑脫離，解除反饋抑制作用等。研究中通常采用的方法

在蛋白質分子中引入二硫鍵以提高蛋白質的穩(wěn)定性；減少半胱氨酸殘基數(shù)目以避免錯誤折疊的可能性；置換天冬酰胺、谷氨酰胺或其他氨基酸，以修飾酶的催化特異性或增加酶的活性等。定向誘變：

在DNA水平上改變氨基酸的編碼序列的過程，稱作定向誘變。定向誘變的方法：

1.利用M13DNA進行的寡核苷酸定向誘變；2.利用質粒DNA進行的寡核苷酸定向誘變；3.PCR擴增進行寡核苷酸定向誘變；4.利用簡并寡核苷酸引物隨即誘變；5.DNA重排等等。蛋白質工程與基因工程的區(qū)別

基因工程是通過基因操作把外源基因轉入適當?shù)纳矬w內(nèi)，并在其中進行表達，它的產(chǎn)品還是該基因編碼的天然存在的蛋白質。蛋白質工程則更進一步根據(jù)分子設計的方案，通過對天然蛋白質的基因進行改造，來實現(xiàn)對其所編碼的蛋白質的改造，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質，而是經(jīng)過改造的，具有人類需要的優(yōu)點的蛋白質。蛋白質工程↑基因工程→工程菌構建、改造→微生物工程→生化工程→產(chǎn)品↓細胞工程→細胞株、組織、器官→生物新品種→酶工程

本課程的地位：現(xiàn)代科技革命高新技術生物技術(工程)基因工程基因克隆五基因工程的發(fā)展史1.

理論上的三大發(fā)現(xiàn)證明了生物的遺傳物質是DNA（基因工程的先導）DNA的雙螺旋結構和半保留復制機理遺傳信息的傳遞方式（中心法則）2.

技術上的三大發(fā)現(xiàn)60年代末－70年代初，限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)（標志著DNA重組時代的開始）載體的使用1970年，逆轉錄酶的發(fā)現(xiàn)。五基因工程的發(fā)展史3．基因工程誕生

72年P.Berg研究組（美國斯坦福大學）(與W.GilbertandF.Sange獲得1980年諾貝爾化學獎)完成世界上第一個體外重組DNA

對(SV40+λphage)DNA→EcoRI ↓T4ligaseSV40λ重組分子1973年S.Cohen（美國斯坦福大學）和N.Boyer完成第一個細菌克隆1974年異源真核生物基因在Ecoli中表達

S.Cohen,H.Boyer用非洲爪蟾的編碼核糖體基因

pSC101重組導入Ecoli

分析轉化子：在Ecoli細胞內(nèi)有外源的mRNA轉錄產(chǎn)物

五基因工程的發(fā)展史1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer，標志著基因工程的誕生。Tetracycline

pSC101EcoRIT4DNALigaseKanamycin

R6-5Kanr

andTetrpSC101完整，R6－5部分五基因工程的發(fā)展史五基因工程的發(fā)展史4.發(fā)展過程中的重大事件1977年，E.coli中合成了人生長激素基因。1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達。1982年，培育出了超級鼠。1985年Horsch發(fā)明了植物基因工程的基本方法：葉圓盤法，并獲得轉基因植株。4.發(fā)展過程中的重大事件1990年，患有遺傳免疫疾病的4歲女孩接受了基因療法。1990年，Perlak將B.T.基因導入棉花獲得抗蟲棉。1991年，美國開始人類基因組計劃。1997年，“多利”綿羊誕生。（體細胞核移植）

1998年胚胎干細胞2005年韓國科學家黃禹錫培育第一只克隆狗2009年12月2日美國首批胚胎干細胞獲得合法“許可證”五基因工程的發(fā)展史轉移大鼠生長素基因的小鼠1．基因工程問世后國際科學界的高度重視六基因工程的生物安全性科學界第一反應→禁止有關實驗進行1971年6月冷泉港生物學會議上，引起人們的注意1972年歐洲分子生物學實驗室（EMBO）：工作會議1973年Gordon會議1974年1月Berg籌備了一個小型討論會，4月份在麻省理工學院召開

2.

委員會提出如下四點建議：暫停兩類實驗：

1）涉及自然界中尚未出現(xiàn)的有病毒生產(chǎn)能力或帶有抗菌素抗性基因的質粒。

2）涉及將腫瘤病毒或其他動物病毒的DNA進行連接重組的實驗。對將動物DNA和質?；蚴删wDNA連接重組的實驗要慎重。呼吁美國衛(wèi)生研究院（NIH）成立重組DNA咨詢委員會（recombinantDNAadvisorycommittee，RAC）在1975年召開一次國際會議:研究如何對待重組DNA分子帶來的可能危害.六基因工程的生物安全性1975.2.24-27美國衛(wèi)生研究院（NIH），在美國召開會議，160名來自美國和其他16個國家的專家提出相應規(guī)定。1972－1976科學家們對

①載體－受體進行有效的安全性改造

②嚴格實驗的材料和范圍

③嚴格實驗室和操作人員的規(guī)范

3.

委員會繼續(xù)努力：六基因工程的生物安全性1976年美國NIH發(fā)布《重組DNA分子研究準則》國際經(jīng)濟發(fā)展合作組織頒布了《生物技術管理條例》歐美也頒布了《關于控制使用基因修飾微生物的指令》《關于基因修飾生物向環(huán)境釋放的指令》1986年6月，美國發(fā)布《生物技術法規(guī)協(xié)調(diào)大綱》1996年聯(lián)合國環(huán)境署和《生物多樣性公約》秘書處就《生物安全協(xié)議書》組織了9輪談判。

4.各國政府和國際社會對生物安全性的認識和行動

六基因工程的生物安全性2001年

布什政府頒布關于干細胞研究的限制令

2009年3月奧巴馬宣布取消布什政府所設的干細胞研究限制令

2009年12月2日，13株胚胎干細胞系通過美國NIH審核，成為首批合法干細胞系。

喬治.戴利在美國波士頓兒童醫(yī)院擁有一所自己的實驗室。12月2日，NIH公布的干細胞系，11/13株來自該室。地方法院推翻美國總統(tǒng)令宗教組織與科學界激烈爭論美國胚胎干細胞研究爭議再起

美國哥倫比亞特區(qū)地方法院法官羅伊斯·蘭伯思8月23日做出一項裁決，推翻了美國總統(tǒng)奧巴馬去年放寬人類胚胎干細胞研究的總統(tǒng)令。裁決認為，胚胎干細胞研究破壞胚胎，聯(lián)邦資金資助屬于違法

1996年美國國會通過的《迪基—威克修正案》，該修正案禁止聯(lián)邦資金資助制造或破壞人類胚胎的研究活動。

1999年克林頓政府創(chuàng)造性地繞開了修正案規(guī)定，提出資助胚胎干細胞、特別是由私人研究所提取出的胚胎干細胞研究，不屬于“資助破壞胚胎的活動”。2001年8月，布什簽署總統(tǒng)令，禁止聯(lián)邦資金用于提取胚胎干細胞及其研究，只能對當時已有的21種胚胎干細胞展開研究。奧巴馬則扭轉布什舊規(guī)，在去年3月9日簽署總統(tǒng)令，宣布擴大聯(lián)邦資金用于胚胎干細胞的研究。蘭伯思的裁決實際上否定了這三任政府的所有解釋。他在長達15頁的判決書中說，干細胞和胚胎密不可分，只要是胚胎干細胞研究，就一定存在破壞胚胎的情況。在《迪基—威克修正案》里，“國會行文的一致意向，是禁止聯(lián)邦資金用于制造或破壞胚胎的研究活動”。他說，如果國會有意認可某些胚胎干細胞研究，會在法案中明文指出?！暗ò笡]那么寫，法庭必須遵照成文法”。

“判決是對美國生物醫(yī)療研究一次令人目瞪口呆的重擊”

胚胎干細胞是具有最廣泛發(fā)展?jié)摿Φ母杉毎?，可以分化成所有種類的體細胞。雖然胚胎干細胞的效用還不能完全確定，但科學家們相信，有朝一日他們能培育出全新的細胞和組織，為治療糖尿病、心臟病、癌癥、帕金森氏綜合征等疾病提供新方法。由于胚胎干細胞研究會破壞胚胎，這項研究在美國引起道德和倫理方面的爭議。干細胞系：是指一群干細胞的集合。以一個胚胎干細胞為基礎，實驗室將這枚細胞分裂增殖，生長成大量、同質的胚胎干細胞，這群干細胞就是一株干細胞系。培育一株干細胞系很不容易，因為胚胎干細胞很容易發(fā)育成具有特殊功能的體細胞，失去干細胞特有的“全能”生長潛力。我國：1993年12月24日發(fā)布17號令《基因工程安全管理辦法》1996年7月農(nóng)業(yè)部發(fā)布《農(nóng)業(yè)生物基因工程安全管理實施辦法》1996年由國家環(huán)境組織代表團（外交部、科技部、外經(jīng)貿(mào)部、農(nóng)業(yè)部、中科院，）參加了《生物安全協(xié)議書》締約工作，我國為第70個簽署國。

5.我國政府對生物安全性的認識和行動

六基因工程的生物安全性6生物安全性評價：目的：從技術上分析生物技術和產(chǎn)品的潛在危險、確定安全等級、制定防范措施、防止?jié)撛谖：?。主要作用：提供科學決策依據(jù)保障人類健康與環(huán)境安全性回答公眾疑問促進國際貿(mào)易、維護國家權利促進生物技術的發(fā)展六基因工程的生物安全性7.生物安全性分級標準

基因工程工作安全等級的劃分標準

(中國國家科學技術委員會，1993)

安全等級潛在危險程度

I對人類健康和生態(tài)環(huán)境尚不存在危險

II對人類健康和生態(tài)環(huán)境具有低度危險

III對人類健康和生態(tài)環(huán)境具有中度危險

IV對人類健康和生態(tài)環(huán)境具有高度危險六基因工程的生物安全性

8.生物安全性分級劃分程序

安全性評價的程序和結果

程序目的結果

第一步確定受體生物的安全等級安全等級I、II、III或IV級第二步確定基因操作對安全性的影響類型安全類型I、II或III級第三步確定遺傳工程體的安全等級安全等級I、II、III或IV級第四步確定遺傳工程產(chǎn)品的安全等級安全等級I、II、III或IV級第五步確定接受環(huán)境對安全性的影響第六步確定監(jiān)控措施的有效性第七步提出綜合評價的結論和建議六基因工程的生物安全性

安全等級受體生物符合的條件

I對人類健康和生態(tài)環(huán)境未曾發(fā)生過不利影響；或演化成有害生物的

可能性極小；或僅用于特殊研究，存活期短，實驗結束后在自然

環(huán)境中存活的可能性極小等。

II可能對人類健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生低度危險，但通過采取安全控制措施

完全可以避免其危害。

III可能對人類健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生中度危險，但通過采取安全控制措施

仍基本上可以避免其危害。

IV可能對人類健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生高度危險，而且尚無適當?shù)陌踩刂?/p>

措施來避免其在封閉設施之外發(fā)生危害。如，可能與其他生物發(fā)生

高頻率遺傳物質交換的、或者尚無有效技術防止其本身或其產(chǎn)物逃逸、

擴散的有害生物；有害生物逃逸后，尚無有效技術保證在其對人類

健康或生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響之前將其捕獲或消滅等

9.

受體生物的安全等級及劃分標準六基因工程的生物安全性10.基因操作對宿主生物的安全類型及劃分標準

安全類型劃分標準

l增加受體生物的安全性。如，去除致病性、可育性、適應性基因或抑制這些基因的表達等。2對受體生物的安全性沒有影響。如，提高營養(yǎng)價值的貯藏蛋白基因，不帶有危險性的標記基因等的操作.3降低受體生物的安全性。如，導入產(chǎn)生有害毒素的基因，引起受體生物的遺傳性發(fā)生改變，會對人類健康或生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生額外的不利影響；或對基因操作的后果缺乏足夠了解，不能肯定所形成的遺傳工程體其危險性是否比受體生物大。六基因工程的生物安全性受體生物基因操作的安全類型

安全等級123

III

I，II，III，IV

III，IIIIII，III，IV

IIII，II，IIIIIIIII，IV

IVI

，II,

III

，IVlVIV11.遺傳工程體的安全等級與受體生物安全級和基因操作安全類型的關系六基因工程的生物安全性12.遺傳工程體產(chǎn)品的安全等級基因工程工作安全性綜合評價與建議?六基因工程的生物安全性13．影響生物安全性評價的因素

熟悉程度和分析能力的影響預期用途和潛在接受環(huán)境影響

安全控制措施的影響風險評價利弊平衡的影響六基因工程的生物安全性14．生物安全控制措施(按性質分)：類別方法含義舉例

物理控制措施系指利用物理方法限制基因工程體如設置柵欄、網(wǎng)罩、屏障等。

及其產(chǎn)物在控制區(qū)外的存活和擴散。

化學控制措施系指利用化學方法限制基因工程體對生物材料、工具和有關設施

及其產(chǎn)物在控制區(qū)外的存活和擴散。進行化學藥品消毒處理等。

生物控制措施系指利用生物措施限制基因工程體設置有效的隔離區(qū)及監(jiān)控區(qū)，消除

及其產(chǎn)物在控制區(qū)外的生存、擴散試驗區(qū)或控制區(qū)附近可與基因工

或殘留，并限制向其他生物轉移。程體雜交的物種以阻止基因工程體

開花授粉或去除其繁殖器官。

環(huán)境控制措施系指利用環(huán)境條件限制基因工程體如控制溫度、水分、光周期等。

及其產(chǎn)物在控制區(qū)外的繁殖。

規(guī)模控制措施系指盡可能地減少用于實驗的基因如控制其試驗的個體數(shù)量或減少

工程體及其產(chǎn)物的數(shù)量或減少實驗試驗面積、空間等。

區(qū)的面積以降低基因工程體及其產(chǎn)

品迅速廣泛擴散的可能性六基因工程的生物安全性

類別措施要求

實驗室控制措施

相應安全等級的實驗室裝備；相應安全等級的操作要求（P1－P4級）

生物防護，分EK1－EK3級

中間試驗和環(huán)境釋放控制措施相應安全等級的安全控制措施。

商品貯運、銷售及使用相應安全等級的包裝、運載工具、

貯存條件、銷售、使用具備符合

公眾要求的標簽說明。

應急措施針對基因工程體及其產(chǎn)物的意外

擴散、逃逸、轉移，應采取的緊急措

施，含報告制度、撲滅、銷毀設施等。

廢棄物處理相應安全等級，采取防污處置的操作要求。

其他長期或定期的監(jiān)測記錄及報告制度。15．生物安全控制措施(按工作階段分)：六基因工程的生物安全性16．基因工程產(chǎn)業(yè)化安全性：受體系統(tǒng)的潛在危險:

原核系統(tǒng)的生物安全性；

真核系統(tǒng)的生物安全性；重組活疫苗質粒DNA疫苗基因治療的安全性醫(yī)藥生物技術產(chǎn)品潛在危險預防措施六基因工程的生物安全性第一章概論一基因工程與生物工程的關系二基因工程的基本定義三基因工程的基本形式四生物（工程）技術的其他內(nèi)容五基因工程的發(fā)展史六基因工程的生物安全性七基因工程的意義P1-P4(Physicalprotection)BSL1-4(Biosafetylevel)實驗室的生物安全水平分級根據(jù)所處理的微生物的危害程度,生物安全實驗室分為四級：

生物安全一級實驗室(BSL-1實驗室)

生物安全二級實驗室(BSL-2實驗室)

生物安全三級實驗室(BSL-3實驗室)

生物安全四級實驗室(BSL-4實驗室)實驗動物生物安全實驗室：

其適用微生物范圍與同級的一般生物安全實驗室相同，差別在于適用于實驗脊椎動物的飼養(yǎng)和動物模型實驗。根據(jù)所處理的微生物的危害程度分為四級，分別稱為ABSL-1，2，3，4實驗室。為探索生命的奧秘提供了有用手段，為生物新技術應用創(chuàng)造條件：基因芯片、蛋白芯片。闡明了基因是遺傳信息的載體。發(fā)現(xiàn)了多種基因新類型和全面的認識基因本質。從本質上闡明真核基因的表達調(diào)控分子機理，基因表達的時空特異性，核－質基因的協(xié)同表達，信號傳遞途徑等。從整體水平研究高等生物的發(fā)育與分化過程多種生物的基因組序列分析，特別是《人類基因組計劃》，

《水稻基因組計劃》的實施與完成。開辟了“反向生物學的研究新途徑。七基因工程的意義1.對生物科學研究的貢獻：反向生物學reversebiology

定義：利用基因工程技術先分離出基因，經(jīng)克隆后測序并進行表達，然后再研究其功能的學科。傳統(tǒng)生物技術是根據(jù)生物的性狀，找到有關的蛋白質，再確定其基因;現(xiàn)在可以先分離特定蛋白推測其基因或直接分離其基因，經(jīng)克隆測序、表達，再研究其功能。這一過程與傳統(tǒng)生物學相反，故稱反向生物學。

概括地講，其意義體現(xiàn)在以下三個方面：

●分離、擴增、鑒定、研究、整理生物信息資源●設計、構建生物的新性狀甚至新物種：基因工程可以繞過遠緣有性雜交的困難，使基因在微生物、植物、動物之間交流，迅速并定向的獲得人類需要的新的生物類型?！翊笠?guī)模生產(chǎn)生物活性物質2.對實踐的貢獻：七基因工程的意義大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質工程細胞基因工程蛋白質工程途徑工程發(fā)酵工程細胞工程分離工程酶酶工程分離工程野生細胞野生細胞生物活性物質3、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生我國生產(chǎn)的部分基因

工程疫苗和藥物

許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來源限制產(chǎn)量有限，其價格往往十分昂貴。

微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應藥物成分的基因導入微生物細胞內(nèi)，讓它們產(chǎn)生相應的藥物，不但能解決產(chǎn)量問題，還能大大降低生產(chǎn)成本。七基因工程的意義

胰島素從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。

將合成的胰島素基因導入大腸桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！使其價格降低了30%-50%!3、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生

從人血中提取干擾素，300L血才提取1mg！

通過基因工程的方式創(chuàng)造了能合成人干擾素的大腸桿菌，每1Kg的培養(yǎng)液可提取20—40mg干擾素人造血液及其生產(chǎn)3、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生1977年，Genetech在美國舊金山市誕生1982年,人胰島素獲準上市，標志基因工程產(chǎn)品商品化進入實用階段各種基因工程產(chǎn)品有：抗病毒劑，抗癌因子，新型抗生素，重組疫苗，免疫輔助劑，心血管防護急救藥，抗衰老藥，生長因子，基因治療，診斷Kit等。3、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生七基因工程的意義生物技術主體產(chǎn)品①單克隆抗體（細胞雜交瘤技術）和重組蛋白藥物：美國約1300家生物技術公司,60％以上事生物藥品開發(fā)；歐洲約700家生物技術公司,43％以上從事生物藥品開發(fā).②疾病類型：治療癌癥，心腦血管，艾滋病，遺傳疾病等藥物。③主要上市藥：胰島素（第一個上市）人生長激素，紅細胞生成素，干擾素，白細胞介素，集落刺激因子，疫苗，單抗等50多種獲準上市。3、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生七基因工程的意義主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時間產(chǎn)品時間國家用途上市時間國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美國乙肝1986歐洲人白細胞介素1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國3、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生七基因工程的意義1998年止美國有53種獲FDA獲準上市，使上千萬人受益，生物技術產(chǎn)品的銷售額增長迅速。

臨床試驗：350種正研究開發(fā)：2200種1980年美國現(xiàn)代生物技術產(chǎn)品銷售額0增長1991年59億美元基因工程藥物1996年101億美元80億美元年增長13％1997年130億美元2000年500億美元2006年可達250億美元日本1991年2648億日元

1996年6552億日元

5年時間增長了有一倍多

3、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生七基因工程的意義－基因診斷與基因治療

運用基因工程設計制造的“DNA探針”檢測肝炎病毒等病毒感染及遺傳缺陷，不但準確而且迅速。

通過基因工程給患有遺傳病的人體內(nèi)導入正?；蚩伞耙淮涡浴苯獬∪说募部唷?、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生－生物芯片從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息?；蛐酒\斷技術以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術。3、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生有重要經(jīng)濟意義的目的基因的分離，改造有重要經(jīng)濟現(xiàn)狀的性狀的工程植株培育出具有生物反應器功能的工程植株（藥用蛋白質）培養(yǎng)抗病（廣普抗病毒，真菌，細菌，線蟲等），抗蟲，抗除草劑性狀的轉基因農(nóng)作物。氨基酸，助鮮劑，甜味劑，食品添加劑，淀粉酶，纖維素酶，脂肪酶。4、基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)生物技術發(fā)展的第二個浪潮――將在農(nóng)業(yè)領域掀起轉基因農(nóng)作物產(chǎn)品市場銷售額：（世界市場）1995年0.75億美元1998年15億美元（4年增長20倍）2000年30億美元2010年將達到200億美元4、基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)轉黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉魚抗寒基因的番茄生長快、肉質好的轉基因魚(中國)乳汁中含有人生長激素的轉基因牛(阿根廷)5、基因工程與環(huán)境保護⑴環(huán)境監(jiān)測：

基因工程做成的DNA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒、細菌等污染。1t水中只有10個病毒也能被DNA探針檢測出來

利用基因工程培育的“指示生物”能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉化污染物。⑵環(huán)境污染治理：

基因工程做成的“超級細菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質。

通常一種細菌只能分解石油中的一種烴類，用基因工程培育成功的“超級細菌”卻能分解石油中的多種烴類化合物。有的還能吞食轉化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質。發(fā)展趨勢：轉基因技術基因組學技術蛋白質組學技術生物信息學技術

七基因工程的意義發(fā)展中存在的問題（我國）1）仿制過多，創(chuàng)新不夠2）重復過多，水平不高，浪費太大3）支撐產(chǎn)業(yè)薄弱4）產(chǎn)業(yè)裝備落后5）上下游銜接不夠緊密6）生物安全性研究亟待加強

七基因工程的意義第一章緒論復習思考題（一）現(xiàn)代生物技術探討的主要問題是什么現(xiàn)代生物技術有哪些主要內(nèi)容？3.什么叫基因工程？有什么特征？4.基因克隆的主要目的是什么？5.基因工程的三大要求是什么？6.什么是反向生物學？舉例它在哪些研究領域中應用？7.國內(nèi)外重組蛋白藥物研究情況調(diào)研。（綜述舉例）8.基因工程對生物科學研究的貢獻。基

因

工

程第二章基因工程的基本原理四基因工程的支撐技術第二章基因工程的基本原理三基因工程的基本原理二基因的分子生物學一重組DNA技術的理論基礎一重組DNA技術的理論基礎19世紀中孟德爾

豌豆雜交試驗

遺傳因子

經(jīng)典遺傳學20世紀初摩爾根

果蠅雜交實驗

基因

基因學1944年艾弗瑞

肺炎雙球菌轉化實驗

遺傳物質DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鮑耶

DNA分子體外拼接

Berg—Jackson—Cohen--Boyer分子遺傳學1953年沃森-克瑞克

DNA雙螺旋結構

分子生物學基因工程二基因的分子生物學三基因工程的基本原理分子遺傳學、分子生物學以及生化工程學是基因工程原理的三大基石。三基因工程的基本原理1、分子遺傳學原理——提高外源基因的劑量

利用載體DNA在受體細胞中獨立于染色體DNA而自主復制的特性,將外源基因與載體分子重組，通過載體分子的擴增提高外源基因在受體細胞中的劑量，借此提高宏觀表達水平。這是涉及到DNA分子高拷貝復制以及穩(wěn)定遺傳的分子遺傳學原理。三基因工程的基本原理2、分子生物學原理A.篩選、修飾、重組基因表達的轉錄調(diào)控元件，如：啟動子、增強子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等；B.選擇、修飾和重組蛋白質生物合成的翻譯調(diào)控元件，如：SD序列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等三基因工程的基本原理

3、生化工程學原理

基因工程菌（微型生物反應器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)

基因工程菌（細胞）是現(xiàn)代生物工程中的微型生物反應器，在強化并維持其最佳生物效能的基礎上，從工程菌大規(guī)模培養(yǎng)的工程和工藝角度切入，合理控制微型生物反應器的增值速度和最終數(shù)量，也是提高外源基因表達產(chǎn)物的主要環(huán)節(jié)。四基因工程的支撐技術核酸凝膠電泳技術核酸分子雜交技術細菌轉化轉染技術DNA序列分析技術寡核苷酸合成技術基因定點突變技術聚合酶鏈反應（PCR）技術基

因

工

程復旦大學劉明秋第三章基因工程的基本條件第三章基因工程的基本條件三用于基因轉移的受體菌或細胞二用于基因克隆的載體一用于核酸操作的工具酶93一用于核酸操作的工具酶工具酶：在生物技術中常用的各種工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割，連接，聚合、反轉錄等有關操作的各種酶，統(tǒng)稱為工具酶。一用于核酸操作的工具酶1、限制性核酸內(nèi)切酶2、DNA連接酶3、DNA聚合酶4、核酸酶5、核酸修飾酶951、核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內(nèi)切酶。主要從原核生物中分離和純化出來的。據(jù)1994年《分子生物學百科全書》統(tǒng)計，僅II型核酸內(nèi)切酶就有2300種以上，可識別230種不同的DNA序列。限制酶的發(fā)現(xiàn)導致重組DNA技術的發(fā)展大自然賜給基因工程學家的一件了不起的禮物。96大多數(shù)細菌對于噬菌體的感染都存在一些功能障礙吸附障礙：尚未發(fā)現(xiàn)任何一種既可感染假單胞桿菌又可感染大腸桿菌的噬菌體轉錄障礙：非寄主細菌的RNA聚合酶不能夠識別“外源”噬菌體的啟動子序列寄主控制的限制（restriction）與修飾（modification）現(xiàn)象，簡稱R/M體系（類似免疫體系）。97

修飾的λ（B）10-4(限制作用)1110-4(限制作用)

修飾的λ（K）

圖3.1大腸桿菌寄主控制的限制與修飾體系

(數(shù)字表示λ噬菌體的成斑率（E.O.P.），表示限制程度.噬菌體在大腸桿菌K或B菌株上生長，即λ(K)或λ(B)

大腸桿菌K大腸桿菌B1.1限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)981.2由宿主控制的限制與修飾作用

由修飾甲基轉移酶和限制性核酸內(nèi)切酶兩種酶活性配合進行的5’GAATTC3’3’CTTAAG5’EcoRIMEcoRI

限制作用修飾作用

↓

↓

MeG3’5’AATTC3’5’GAATTC5’CTTAA5’3’G5’3’CTTAAG3’EcoRIMe

圖3－2EcoRI與MEcoRI的限制與修飾作用機理+1.3限制性核酸內(nèi)切酶（一）寄主控制的限制與修飾系統(tǒng)的生物功能：保護自身DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解。hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達1001970年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌Rd株中分離出

HindII和HindIII

限制性核酸內(nèi)切酶的功能：主要存在于原核細菌中，識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈，幫助細菌限制外來DNA的入侵。（二）限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識別序列旋轉對稱序列切割位點距識別序列1kb處識別序列內(nèi)或附近距識別序列下游隨機性切割特異性切割24-26bp處單側切割1.3限制性核酸內(nèi)切酶EcoB：TGAN8TGCTEcoK：AACN6GTGCEcoP1：AGACCEcoP15:CAGCAG非對稱識別（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIIIHindIIHaemophilus

influenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶1.3限制性核酸內(nèi)切酶（四）II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構5‘

…

GCT

GAATTC

GAG…3’3‘

…

CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點1.3限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端EcoRI37℃退火4-7℃5‘

…

G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘

…

C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘

…

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘

…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘

…

G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘

…

C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘

…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’

3‘

…

C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘

…

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘

…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘

…

G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘

…

C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

107切割頻率：與識別的靶序列長度有關識別4個堿基的酶，如Sau3AI↓GATC平均44=256個核苷酸對中出現(xiàn)一次機會識別6個堿基的酶，如EcoRI，平均46=4096個核苷酸對中出現(xiàn)一次機會識別8個堿基的酶，如NotIGC↓GGCCGC，可產(chǎn)生1~1.5X106bp的片段，適用于哺乳動物DNA大尺度物理圖譜的構建識別多種核苷酸序列的酶HindII,5’-CTPyPuAC-3’Py,嘧啶堿基C或T，Pu,嘌呤堿基A或G.108酶活性（1U）：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1mg標準DNA所需的酶量，即為1U。（五）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素1.3限制性核酸內(nèi)切酶（五）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應總體積延長反應時間1.3限制性核酸內(nèi)切酶（五）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：

從正常的大腸桿菌菌株中分離出來的質粒DNA，只能被局部消化，甚至不消化。基因克隆中使用失去了甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質粒DNA。1.3限制性核酸內(nèi)切酶111（五）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位

引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等1.3限制性核酸內(nèi)切酶112（五）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：1.3限制性核酸內(nèi)切酶哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中鳥嘌呤的C5位上引入甲基.不同位點之間的甲基化程度是互不相同的，而且還與DNA來源的細菌類型有密切的關系。真核基因組DNA的甲基化作用模式，可以根據(jù)各種同裂酶所具有的不同的甲基化敏感性進行研究。113（五）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素酶切消化反應的溫度：1.3限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI37℃ApaI30℃SmaI25℃TaqI65℃BclI50℃114（五）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA分子的結構：1.3限制性核酸內(nèi)切酶

某些RE，超螺旋質粒DNA或病毒DNA所需要的酶量比消化線性DNA的高；某些RE，切割不同部位的限制位點，效率也有明顯的差別，可能與側翼核苷酸成分差異造成的。有些特定的限制位點，只有當其它的限制位點也同時被廣泛切割的條件下，才能被有關的RE所消化。大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100μlTT37℃1-1.5hr不正確的NaCl、MgCl2濃度還可能導致識別序列的改變。1.3限制性核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質：（五）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（五）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的星號活性（Staractivity）現(xiàn)象；

EcoRI在正常條件下識別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’（EcoRI*）1.3限制性核酸內(nèi)切酶117限制性內(nèi)切酶的次級活性

星號活性(StarActivity)定義：某些條件下，一種特異性識別順序的限制性內(nèi)切酶在酶切同一種DNA片段時會產(chǎn)生新的酶切位點而得到不同的酶解片段的酶活性則稱星號活性。實例：EcoRI

正常：識別GAATTC6個核苷酸順序。

異常：可識別AATT4個核苷酸的順序。

所以，酶切產(chǎn)物能電脈鑒定出現(xiàn)的DNA條帶數(shù)比正常情況下有增加。（六）II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應注意：5‘

…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘

…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘

…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’

3‘

…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘

…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘

…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’1.3限制性核酸內(nèi)切酶（B＋S）（S＋B）（六）II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥1.3限制性核酸內(nèi)切酶120

同尾酶(Isocaudomers)有些來源不同的限制酶，識別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生出相同的粘性末端，這類限制酶稱為同尾酶。但兩種同尾酶切割形成的DNA片段經(jīng)連接后所形成的重組序列，不能被原來的限制酶所識別和切割。MunI：5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`EcoRI：5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新連接后的序列：5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`121但是也有例外，如BamHI和BglII,Sau3AIA↓GATCTG↓GATCC↓GATCTCTAG↑ACCTAG↑GCTAG↑

↓BglII↓BamHI↓Sau3AI

AGATCCGATCTCTAGG

連接酶連接酶

AGATCCAGATC

TCTAGGTCTAG

連接后的產(chǎn)物由于堿基排列順序略有變化，BamHI和BglII都不能再識別和切割了，而Sau3AI仍然有可能可以切割。122同尾酶的應用BamHIGGATCCBglIIAGATCTBclITGATCASer(TCC)Gly(GGA)GSlinker的應用GSAgeneBgene連接后，目的基因不能再次被取出123同裂酶（isoschizomers）：

通常將能切割同一靶序列的酶稱為同裂酶，形成同樣的末端。有些同裂酶對于切割位點上甲基化堿基的敏感性有所差別，故可用來研究DNA甲基化作用。HpaII與MspI共同的靶序列是：CCGG但是HpaII不能切割C*

CGG(5-甲基胞嘧啶)MspI能夠切割C*

CGG(5-甲基胞嘧啶)附：許多脊椎動物和棘皮動物基因組的DNA中的90%以上的甲基，都是在序列CG處以5-甲基胞嘧啶的形式出現(xiàn)，這些甲基化的胞嘧啶有許多是發(fā)生在MspI酶的靶序列內(nèi)，所以通過比較HpaI和MspI的DNA消化產(chǎn)物接可以檢測它們的存在。124

酶反應的終止終止酶反應的方法有：①65℃保溫10分鐘。（只對此溫度敏感的酶，如EcoRI）②加入終止反應液多為電脈土樣液，主要成份為50％甘油，100MMEDTA(PH=8.0),1％SDS和0.1％溴酚蘭。③用飽和酚、氯仿抽提DNA方法純化。（六）II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應的操作125限制性內(nèi)切酶基因如何克隆進大腸桿菌？克隆的原因：1，沒有RE，不能實現(xiàn)重組DNA技術；

2，RE天然存在于許多種微生物中，如好氧菌、厭氧菌、光和菌、固氮菌、嗜溫菌、嗜寒菌、慢生菌、快生菌等。3，每一種微生物必須優(yōu)化一整套詳細的發(fā)酵方案，如溫度、pH、生長條件等等，所以克隆入E.coli內(nèi)，將生長條件標準化。126G-中RE和M甲基化酶的分布這種分隔方式既能使限制性內(nèi)切酶遠離染色體DNA，又使甲基化酶接觸到染色體DNA。RRMRRRRRRRRRMMM127克隆要求1，為避免異源RE對宿主DNA的降解，可以在同一生物中同時克隆RE及其對應的修飾酶（這在技術上很復雜，除非兩個基因在染色體上距離很近）。2，為了防止RE對宿主的破壞，轉化之后的甲基化酶必須在RE之前表達。（大多數(shù)限制性內(nèi)切酶基因及其相應的修飾酶基因在同一操縱子中編碼）128例一：G-斯氏普威登斯菌（Providenciastuartii）中分離PstI基因克隆到E.coliHindIII處理菌的染色體DNA和質粒載體pBR322；片段連接后，將菌的克隆文庫轉入HB101菌，轉化子在液體中培養(yǎng)后用λ-phage感染（RE基因表達后，由于RE可以降解感染的phageDNA，所以宿主細胞對phageDNA的裂解活性產(chǎn)生抗性）抗λ-phage裂解的轉化子可以生長，利用滲透壓破細胞，釋放出周質蛋白進行REPstI的活性分析。限性克隆進行PstI甲基化酶活性分析。（發(fā)夾型熒光分子探針用于DNA甲基化酶的活性分析及其在藥物篩選中的應用?！痘瘜W學報》2006年20期，周興旺

李軍

王柯敏

譚蔚泓

羊小海

孟祥賢

顏鴻飛

）129結果：實驗得到一個陽性克隆，在其4.0Kb片段中含有完整的PstIRE和ME基因的操縱子，包括該菌啟動子，這種結構保持了天然的合成順序，即ME在RE之前合成。E.coli中PstI表達量約是原菌的10倍；正如預料，PstI分布在周質，而甲基化酶分布在細胞質。130例二：分離RE和ME基因還有另一種方案應用范圍：對于那些相應修飾酶（甲基化酶）基因離得很近的目的限制性內(nèi)切酶基因，且目的RE基因克隆到至少具有一個同樣識別位點的質粒中，這一方案卓有成效。131步驟：1，將已證明具有RE的生物總DNA建立克隆庫，質粒載體至少有一個目的RE的識別位點；2，克隆庫轉化E.coli，擴增重組質粒，表達修飾酶；3，轉化細菌在選擇性液體培養(yǎng)基中生長，分離質粒；4，目的限制性內(nèi)切酶處理質粒；5，步驟4中處理過的質粒轉化E.coli。132克隆脫硫弧菌（Desulfovibriodesulfuricans）DdeI修飾酶和RE基因的方法1,克隆弧菌DNA的質粒轉化E.coli,2,轉化子在液體中培養(yǎng)后抽提質粒，再用REDdeI處理；3,編碼表達DdeI修飾酶的質粒由于位點被甲基化而不被消化；4,質粒轉化E.coli，轉化子檢測DdeI限制性酶活性和甲基化酶活性。133

表2－1兩種DNA連接酶比較

T4DNAligase（E.coli）DNAligase來源

T4

噬菌體大腸桿菌分子量60，00075000

輔助因子ATPNAD+底物1.雙鏈DNA分子的粘.平端同源互補粘端

2.RNA—DNA雜和體，RNA鏈缺口

3.雙鏈DNA分子中的單鏈缺口雙鏈分子中的單鏈缺口應用范圍廣泛.

效率高窄2.DNA連接酶1342.2DNA連接酶連接作用的分子機理1) 連接酶與輔助因子ATP（或NAD+）提供的激活AMP形成一共價結合的酶－AMP復合物（腺苷酰酶）。同時釋放出焦磷酸（Ppi）[或煙酰胺單核苷酸（NMN）]2)激活的AMP從賴氨酸殘基轉移到DNA一條鏈的5’－末端磷酸基團上形成DNA－腺苷酸復合物。3)3’－OH末端對活躍的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，將缺口封起來，同時釋放出AMP