生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

蛋白質(zhì)濃度測定（Foin-酚試劑法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉并掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)或（多肽）分子在含有酪氨酸或色氨酸，能與Folin-起氧化還原反應(yīng)，生成合物，藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可用比色法測定蛋白質(zhì)濃度。此法也適用酪氨酸或色氨酸的定量測定。三、儀器、原料和試劑（1）儀器：可見分光光度計(jì)（2）試劑：Folin-酚試劑A：將1g碳酸鈉溶于L0.1mol/L氫氧化鈉溶液。另將0.5gCuSO4?5H2O溶于L1%酒石酸鉀（或酒石酸鈉）溶液。將前者與硫酸銅-酒石酸鉀1mL混合，混合后的溶液1日內(nèi)有效。Folin-酚試劑B：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉（Na2WO4?2H2O），（Na2MoO4?2H2O），及700mL85%磷酸，L濃鹽酸充分混合，燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出，接上回流冷凝管以文火回流10h?；亓鹘Y(jié)束后，加入150g硫酸鋰（LiSO4），L蒸餾水及數(shù)滴液溴，開口繼續(xù)沸騰15min，以除去多余的溴。冷卻后溶液呈金黃色（如果仍呈綠色，須再重復(fù)的步驟），定容至1L，過濾，濾液置棕色瓶中保存，可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久，顏色由可加幾滴液溴，煮沸數(shù)分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定酸度，以酚酞為指示劑。該試劑的酸度應(yīng)為2mol/L左右，將之稀釋至相當(dāng)于1mol/L酸度使用，即為Folin-酚試劑。酪蛋（0.5%）。四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取7支干凈試管，分兩組按表1順序加入試劑?；靹?，室溫放置10min，各管再加Folin-酚試劑B0.5mL，30min后比色（500nm），以標(biāo)準(zhǔn)蛋白量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1Folin-酚法測定蛋白質(zhì)濃度——標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管號(hào)試劑0123456酪蛋白00.050.10.20.30.40.5蒸餾水(mL)0.50.450.40.30.20.10Folin-4.04.04.04.04.04.04.0（2）樣液測定準(zhǔn)確吸取樣液0.5mL置干凈試管內(nèi)，加入4mLFolin-酚試劑A，10min后，再加試劑B0.5mL，30min后比色（500nm），對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣液蛋白質(zhì)濃度。

總糖和還原糖的測定（3,5-二硝基水楊酸法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握還原糖和總糖的測定原理，學(xué)習(xí)用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理單糖和某些寡糖含有游離的醛基或酮基，有還原性，屬于還原糖；而多糖和蔗糖屬于非還原性糖。利用多糖能被酸水解為單糖的性質(zhì)，可以通過測定水解后單糖的含量對(duì)總糖進(jìn)行測定。還原糖在堿性條件下被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5－二硝基水楊酸（DNS）被還原生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。三、儀器、原料和試劑（1）儀器：水浴鍋，電子分析天平、紫外可見分光光度計(jì)（2）原料：面粉（3）試劑：3,5－二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.3gDNS和262mL2mol/L氫氧化鈉溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100mL，即含葡萄糖為2.0mg/mL。6mol/LHCl：取250mL濃HCl（35%～38%）用蒸餾水稀釋到500mL。6mol/LNaOH：稱取120gNaOH溶于500mL蒸餾水中。碘－碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100mL蒸餾水中。四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取干凈試管6支試管按下表進(jìn)行操作。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表13,5－二硝基水楊酸法定糖——標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管號(hào)試劑012345葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.81.0蒸餾水(mL)1.00.80.40.20試劑2.02.02.02.02.02.0沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，取出，用自來水冷卻至室溫9.09.09.09.09.09.0葡萄糖含量(mg)00.20.40.81.0A540（2）樣品中還原糖的提取和測定準(zhǔn)確稱取0.5g面粉，放入100mL燒杯中，加入50mL蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。（3）樣品中總糖的水解、提取和測定準(zhǔn)確稱取0.5g面粉，放入100mL三角瓶中，加3mL蒸餾水勻漿，轉(zhuǎn)入三角瓶中，并用12mL蒸餾水沖洗研缽2-3次，加入10mL6MHCl，攪拌均勻，置沸水浴中加熱水解30min（水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后，用6mol/LNaOH中和至pH呈中性，用蒸餾水定容至100mL，過濾，取濾液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，成稀釋1000倍的總糖水解液。取1mL總糖水解液，測定其還原糖含量。五、計(jì)算按照下列公式分別計(jì)算面粉中還原糖和總糖百分含量。ωω式中，ω（還原糖）：還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）；ω（總糖）：總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）；C1：還原糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；C2：水解后還原糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；V1：樣品中還原糖提取液的體積（mL）；V2：樣品中總糖提取液的體積（mL）；m：樣品的質(zhì)量（mg）

發(fā)酵過程中無機(jī)磷的利用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解發(fā)酵過程中無機(jī)磷的作用及磷酸化檢查方法。

（2）掌握定磷法的原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理酵母能夠發(fā)酵糖產(chǎn)生乙醇和CO2,這一現(xiàn)象的生理機(jī)理主要涉及到糖的氧化磷酸化過程。在此過程中，糖利用反應(yīng)體系中的無機(jī)磷，磷酸化成不同的有機(jī)代謝中間產(chǎn)物，使酵母發(fā)酵體系中無機(jī)磷的含量不斷減少。無機(jī)磷酸可以與鉬酸作用生成磷鉬酸絡(luò)合物，進(jìn)而被α-1，2，4-氨基萘粉璜酸鈉還原成鉬藍(lán)化合物，該化合物顏色的深淺與磷酸的量成正比，由此可對(duì)無機(jī)磷進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)通過定時(shí)定量測定反應(yīng)體系中的無機(jī)磷，來觀察發(fā)酵過程中酵母對(duì)無機(jī)磷的應(yīng)用情況。三、儀器、原料和試劑(1)儀器：恒溫水浴國、721型分光光度計(jì)、刻度離心管、研缽、吸量管、試管和試管架。(2)原料：新鮮啤酒酵母或活性干酵母。(3)試劑：①蔗糖②磷酸鹽溶液：準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）60.35g和磷酸二氫鉀（KH2PO4?2H2O）10g溶于水中，用水定容至500mL，放冰箱中備用。③標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽溶液（含磷25μg/mL）：先將磷酸二氫鉀在110℃烘干2h，在干燥器中冷卻后，準(zhǔn)確稱取0.0549g用水溶解并定容至500mL，放冰箱中備用。④5%三氯乙酸溶液。⑤硫酸-鉬酸銨溶液：3mol/L硫酸和2.5%鉬酸銨溶液等體積混合。⑥α-1，2.4-氨基酸萘酚磺酸鈉溶液：稱取0.25α-1，2，4-氨基萘磺酸、15g亞硫酸氫鈉和0.5g亞硫酸鈉，定容至100mL。臨用時(shí)，加4倍水混勻。四、操作步驟1．繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支試管，按下表操作。表1磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管編號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽溶液加入量/mL0.00.20.40.81.0水加入量/mL3.02.62.42.22.0硫酸-鉬酸銨溶液加入量/mL2.52.52.52.52.52.5α-1，2，4-氨基萘酚磺酸鈉加入量/mL0.50.50.50.50.50.5反應(yīng)條件37水浴保溫10min，冷卻至室溫含磷量加入量/mL0510152025A660注意：各管加入α-1，2，4-氨基萘磺酸鈉溶液時(shí)，應(yīng)加每一管，立即混勻。以無機(jī)磷量（μg）為橫坐標(biāo)，以A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．酵母發(fā)酵取約0.5活性干酵母和1g蔗糖放入研體中，加入3mL磷酸鹽緩沖液仔細(xì)研磨至糜，之后再加入和2mL磷酸鹽緩沖溶液，攪拌至均漿，倒入50mL錐形瓶中，立即取出0.5mL均勻的懸浮液，加入盛有3.5mL三氯乙酸溶液的試管中，搖勻，作為待測試樣1。同時(shí)將錐形瓶加入37℃水浴中保溫培養(yǎng)，經(jīng)常搖勻，每隔30min取出0.5mL懸液，并立即加入到盛有3.5mL三氯乙酸溶液的試管中，搖勻。共取三次