《2.2 動物細(xì)胞培養(yǎng)》教學(xué)課件2

動物細(xì)胞培養(yǎng)

在治療大面積燒傷時(shí)，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進(jìn)行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。那么，怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚？

借助動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建人造皮膚。

不能用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚。原理：細(xì)胞分裂增殖（有絲分裂）過程：動物細(xì)胞培養(yǎng)是指從動物體中_____出相關(guān)的_______，將它們_______________，然后在_________________下，讓這些細(xì)胞______和______的技術(shù)。生長取組織分散成單個(gè)細(xì)胞適宜的培養(yǎng)條件增殖

目的：獲得細(xì)胞或者細(xì)胞產(chǎn)物地位：動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物組織胰蛋白酶膠原蛋白酶單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株（系）無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境其他條件營養(yǎng)條件動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、血清等動物體內(nèi)的細(xì)胞之所以為何能夠維持正常的生命活動，有些細(xì)胞還能不斷增殖？機(jī)體給這些細(xì)胞提供了適宜的條件，包括充足的營養(yǎng)、穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。

動物細(xì)胞培養(yǎng)的需要何條件？動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件（1）營養(yǎng)條件：①培養(yǎng)基的構(gòu)成：②合成培養(yǎng)基：將細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基稱為合成培養(yǎng)基。③血清等一些天然成分：由于人們對細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)尚未全部研究清楚。血清可補(bǔ)充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)。④培養(yǎng)基類型：一般使用液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）。合成培養(yǎng)基+血清等一些天然成分為什么要加入動物血清？

血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中，蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白；氨基酸有多種，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本原料，且有些必需氨基酸必須由培養(yǎng)液提供；激素有胰島素、生長激素等。血清還含多種未知的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，它們能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和貼附。在培養(yǎng)動物細(xì)胞時(shí)，為保證細(xì)胞能夠順利生長和增殖，需在培養(yǎng)基中添加10%~20％血清等天然成分。（2）無菌、無毒的環(huán)境：清除代謝物，防止細(xì)胞代謝物積累對細(xì)胞自身造成危害。①對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行滅菌處理②在無菌環(huán)境下進(jìn)行操作③可根據(jù)實(shí)際情況適量添加抗生素培養(yǎng)液需要定期更換：（3）溫度、pH和滲透壓：①適宜的溫度：哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度多以___________為宜；②適宜的pH：多數(shù)動物細(xì)胞的適宜pH為_______。③適宜的滲透壓：維持細(xì)胞正常的形態(tài)和功能36.5±0.5℃7.2-7.4（4）氣體環(huán)境：O2是細(xì)胞代謝所必需CO2則維持培養(yǎng)液的pH通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶置于含有95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)①氣體的組成及作用：②容器③儀器動物細(xì)胞培養(yǎng)的兩大類型細(xì)胞能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖；需要貼附于某些基質(zhì)表面才能生長增殖，大多數(shù)細(xì)胞屬于這類型。二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程細(xì)胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。接觸抑制：當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會停止分裂增殖的現(xiàn)象。（一）動物組織的取材動物胚胎或幼齡動物的組織、器官。動物細(xì)胞培養(yǎng)為何要選取幼齡的動物組織器官？細(xì)胞分化程度低，增殖能力強(qiáng)，容易培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程（二）制成細(xì)胞懸液1.將組織分散成單個(gè)細(xì)胞①方法:用機(jī)械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理②原因:a.細(xì)胞間靠在一起的細(xì)胞彼此限制生長和增殖；b.使細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，更易進(jìn)行物質(zhì)交換2.用培養(yǎng)液將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。（三）原代培養(yǎng)動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。操作方法：將細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于適宜環(huán)境中培養(yǎng)。（四）傳代培養(yǎng)思考1.需分瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)的原因？

懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會因細(xì)胞密度過大、有害代謝物積累和培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)等因素而分裂受阻，貼壁細(xì)胞在生長增殖時(shí)，除受上述因素影響外，還會發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象。操作方法①收集細(xì)胞a.懸浮生長類直接用離心法收集b.貼壁生長類重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個(gè)細(xì)胞，然后再用離心法收集②將收集的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分瓶培養(yǎng)

胰蛋白酶第一次使用的目的是使組織細(xì)胞分散開，第二次使用的目的是使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來，分裝后繼續(xù)培養(yǎng)。思考2.為什么要使用胰蛋白酶？有何作用？

胰蛋白酶的作用：消化細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，使組織分散成單個(gè)細(xì)胞。胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白質(zhì)外，長時(shí)間的作用也會消化細(xì)胞膜蛋白等，對細(xì)胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時(shí)間。思考3.兩次胰蛋白酶的目的相同嗎？動物胚胎或幼齡動物的組織、器官單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞懸浮液原代細(xì)胞大量細(xì)胞胰蛋白酶因這些細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)。動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。成塊組織中細(xì)胞與細(xì)胞靠在一起，彼此限制了細(xì)胞的生長和增殖。因細(xì)胞貼壁生長到表面相互接觸時(shí)就停止分裂增殖，故需定期用胰蛋白酶使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來傳代培養(yǎng)。加培養(yǎng)液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)胰蛋白酶植物組織培養(yǎng)與動物細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基狀態(tài)特有取材接種前處理培養(yǎng)過程生長特點(diǎn)培養(yǎng)結(jié)果植物激素及有機(jī)添加物動物血清和血漿離體的植物器官、組織或細(xì)胞離體的胚胎；幼齡動物的組織、器官脫分化、再分化原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)植物體大量細(xì)胞植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞的增殖胰蛋白酶或膠原蛋白酶使組織散成單細(xì)胞消毒固態(tài)液態(tài)貼壁生長、接觸抑制細(xì)胞增殖不分化愈傷組織、胚狀體細(xì)胞增殖分化干細(xì)胞定義：動物和人體內(nèi)保留的具有分裂和分化能力的細(xì)胞。分布：干細(xì)胞存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中。胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）成體干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）分類：干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用①胚胎干細(xì)胞（簡稱ES

細(xì)胞）分布：存在于早期胚胎中特點(diǎn)：具有分化為成年動物體內(nèi)的任何一種類型的細(xì)胞，并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官甚至個(gè)體的潛能。實(shí)例：ES細(xì)胞在體外分化成心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和造血干細(xì)胞等。局限性：胚胎干細(xì)胞必須從胚胎中獲取，涉及倫理問題；因而限制了在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。舉例：骨髓中的造血干細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細(xì)胞、睪丸中的精原干細(xì)胞等；②成體干細(xì)胞分布：存在于成體組織或器官內(nèi)中發(fā)現(xiàn)最早、研究最多、應(yīng)用最成熟的實(shí)例是造血干細(xì)胞；主存于成體的骨髓、外周血和臍帶血中。特點(diǎn)：具有組織特異性，只能分化成特定的細(xì)胞或組織，不具有發(fā)育成完整個(gè)體的能力。

有著自我更新能力及分化潛能的干細(xì)胞，與組織、器官的發(fā)育、再生和修復(fù)等密切相關(guān)。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）概念：通過體外誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞，獲得了類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞，稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，簡稱iPS細(xì)胞。誘導(dǎo)方法：將特定基因或特定蛋白導(dǎo)入細(xì)胞或用小分子化合物誘導(dǎo)形成。優(yōu)點(diǎn)①誘導(dǎo)過程無須破壞胚胎；②iPS細(xì)胞可來源于病人自身的體細(xì)胞，將它移植回病人體內(nèi)后，理論上可以避免免疫排斥反應(yīng)。取成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)入相關(guān)因子細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞定向分化為多種組織細(xì)胞移植回病人體內(nèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞應(yīng)用類型應(yīng)用造血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病治療神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕　柎暮Ｄ〉龋┛芍委熜∈蟮溺牋罴?xì)胞貧血癥，在治療阿爾茲海默病、心血管疾病等領(lǐng)域的研究也取得了新進(jìn)展干細(xì)胞應(yīng)用面臨問題存在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。1.動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件是（

）①無菌無毒的環(huán)境

②營養(yǎng)

③氣體環(huán)境④溫度、pH和滲透壓⑤透明的容器A.①②③④B.①②③⑤C.②③④⑤D.①③④⑤B課堂練習(xí)2.相對細(xì)菌和植物細(xì)胞而言，動物細(xì)胞離體培養(yǎng)更需關(guān)注培養(yǎng)基的滲透壓，是因?yàn)閯游锛?xì)胞（）A.沒有中央液泡，不能發(fā)生滲透作用B.滲透壓遠(yuǎn)高于細(xì)菌或植物細(xì)胞的滲透壓C.沒有細(xì)胞壁，易吸水漲破D.生長緩慢，各生長階段對環(huán)境的滲透壓要求不同C課堂練習(xí)3.下列與動物細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的表述中，不正確的是（）A.培養(yǎng)液通常含有葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動物血清B.原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右便會出現(xiàn)生長停滯C.動物細(xì)胞培養(yǎng)一般能夠傳到40～50代，但其遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變D.動物細(xì)胞培養(yǎng)可用于檢測有毒物質(zhì)和獲得大量自身健康細(xì)胞C（3）培養(yǎng)首先在B瓶中進(jìn)行，瓶中的培養(yǎng)基成分有___________等。在此瓶中培養(yǎng)一段時(shí)間后，有許多細(xì)胞衰老死亡，這是培養(yǎng)到第_____代。（4）為了把B瓶中的細(xì)胞分裝到C瓶中，用___________處理，然后配置成__________，再分裝。4.下圖是動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程示意圖