分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用-DNA測序技術(shù)

二代測序技術(shù)二代測序技術(shù)——發(fā)展歷程第二代測序使用最為廣泛。以Roche公司的454技術(shù)，Illumina公司的Solexa，HiSeq技術(shù)為代表二代測序技術(shù)01基本介紹02二代測序技術(shù)的方法03二代測序技術(shù)的應(yīng)用基本介紹01——捕捉新合成的末端標(biāo)記來確定DNA序列第二代測序技術(shù)邊合成邊測序或變鏈接邊測序。核心思想高通量、自動(dòng)化。特點(diǎn)第二代測序技術(shù)（大規(guī)模平行測序）一代與二代測序技術(shù)的區(qū)別對模板體外克隆→單獨(dú)反應(yīng)模板DNA打斷成小片段→文庫擴(kuò)增→測序。第一代測序技術(shù)第二代測序儀技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)01保證高準(zhǔn)確性02降低測序成本03提高測序速度二代測序技術(shù)的方法02焦磷酸測序：是一種由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶催化的新型酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光測序技術(shù)，通過對DNA合成反應(yīng)中釋放的生物光信號完成實(shí)時(shí)監(jiān)測，開創(chuàng)邊合成邊測序先河。焦磷酸測序原理每輪測序反應(yīng)體系——一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)配對測序引物的3′末端焦磷酸(PPi)釋放ATP5'-磷酰硫酸（APS）ppi形成熒光素氧化熒光素DNA聚合酶摻入的dNTP＝釋放的Ppi

ATP硫酸化酶催化熒光素酶催化可見光CCD感應(yīng)器——光信號→檢測峰每個(gè)峰的高度（光信號）與摻入的核苷酸數(shù)目呈正比Apyrase反應(yīng)體系光信號核苷酸ATP原理淬滅降解再生454/Roche測序系統(tǒng)原理基于焦磷酸測序法，依靠生物發(fā)光對DNA序列進(jìn)行檢測。正確熒光標(biāo)記的引物、核酸探針、電泳錯(cuò)誤快速、準(zhǔn)確、高靈敏度、高自動(dòng)化不匹配IonTorrent/LifeTechnologies測序系統(tǒng)DNA分子DNA分子核苷酸DNA分子PH值變化→結(jié)合→釋放HH→PH值改變→數(shù)字信號＝兩個(gè)相同的堿基芯片記錄兩個(gè)相同的堿基檢測雙倍電壓檢測不到電壓不會(huì)記錄堿基4.Solexa/Illumina測序系統(tǒng)測序系統(tǒng)同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究和功能基因組學(xué)研究。測序儀一次讀取1,000個(gè)左右堿基，DNA樣品制備和分析時(shí)間長。測序系統(tǒng)高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度和低運(yùn)行成本。二代測序技術(shù)的應(yīng)用03應(yīng)用應(yīng)用第二代測序技術(shù)的核心思想是什么？思考題三代測序技術(shù)目錄01基本介紹02三代測序技術(shù)的方法03應(yīng)用發(fā)展歷程第二代測序使用最為廣泛。以Roche公司的454技術(shù)，Illumina公司的Solexa，HiSeq技術(shù)為代表基本介紹01三代測序技術(shù)重組DNA分子以不經(jīng)擴(kuò)增的單分子測序和長讀長為標(biāo)志的測序技術(shù)稱為第三代測序，這些技術(shù)一次可讀取長達(dá)數(shù)萬堿基的片段，大大降低了拼接難度，更重要的是大大減少了過去無法定位的漏洞。三代測序技術(shù)優(yōu)勢①第三代基因測序讀長較長，可以減少拼接成本，節(jié)省內(nèi)存和計(jì)算時(shí)間；②作用原理上避免了PCR擴(kuò)增引入錯(cuò)誤；③拓展應(yīng)用：RNA的序列，甲基化的DNA序列等；缺陷①單讀長的錯(cuò)誤率偏高，需重復(fù)測序以糾錯(cuò)（增加測序成本）；②依賴DNA聚合酶的活性；③成本較高（二代Illumina的測序成本是每100萬個(gè)堿基0.05-0.15美元，三代測序成本是每100萬個(gè)堿基0.33-1.00美元）。④生信分析軟件不夠豐富、數(shù)據(jù)積累少。三代測序技術(shù)的方法

021.PacificBiosciencesSMRT測序技術(shù)發(fā)展歷程SMRT測序技術(shù)由Webb和Craighead提出，Korlach、Turner、PacificBiosciences（PacBio）將其進(jìn)一步發(fā)展，并于2009年作為PacBio測序平臺(tái)推出。1.PacificBiosciencesSMRT測序技術(shù)原理

PacBioSMRT技術(shù)其實(shí)是應(yīng)用了邊合成邊測序的思想（使用4色熒光標(biāo)記4種堿基），其超長讀長的關(guān)鍵在于使用了活性持久且高保真的DNA聚合酶，并以SMRT芯片為測序載體（ZMW原理）。1.PacificBiosciencesSMRT測序技術(shù)優(yōu)勢及劣勢①SMRT技術(shù)的測序速度很快，每秒約10個(gè)dNTP；②錯(cuò)誤率較高，達(dá)到15%，出錯(cuò)隨機(jī)，可通過多次測序來進(jìn)行有效的糾錯(cuò)（如使用Sparc對30X的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，錯(cuò)誤率可達(dá)到0.5%）；③原始DNA不被破壞；④讀長可達(dá)10kbp。2.OxfordNanoporeTechnologiesNanopore測序技術(shù)發(fā)展歷程Bayley于2005年成立OxfordNanoporeTechnologies（ONT）公司，2014年第一個(gè)消費(fèi)級別的納米孔測序儀的原型機(jī)——MinION在ONT誕生。原理該技術(shù)設(shè)計(jì)了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭，最終得到電信號而不是光信號或pH信號的測序技術(shù)。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時(shí)，電荷將發(fā)生變化，因而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。2.OxfordNanoporeTechnologiesNanopore測序技術(shù)優(yōu)勢及劣勢①讀長很長，大約在幾十kb，甚至100kb；②錯(cuò)誤率目前相比較高，且是隨機(jī)錯(cuò)誤，而不是聚集在讀取的兩端；③數(shù)據(jù)可實(shí)時(shí)讀取；④通量很高(30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成)；⑤起始DNA在測序過程中不被破壞；⑥樣品制備簡單又便宜；⑦可直接測序RNA。2.OxfordNanoporeTechnologiesNanopore測序技術(shù)三代測序技術(shù)的應(yīng)用03相關(guān)應(yīng)用單分子測序的分辨率具有優(yōu)勢，使其在特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定中大顯身手。耐藥任與FLT3基因下游出現(xiàn)的稀有新突變有關(guān)，重新證明了FLT3基因是這種最常見白血病——急性髓細(xì)胞白血?。ˋML)的有效治療靶標(biāo)。PacBio平均3000bp的讀長，獲得了更多基因下游的寶貴信息，而基于單核酸分子的測序能夠檢測到低頻率（低至1%）罕見突變。請思考第三代測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)都有什么？思考題一代測序技術(shù)發(fā)展歷程第二代測序使用最為廣泛。以Roche公司的454技術(shù)，Illumina公司的Solexa，HiSeq技術(shù)為代表一代測序技術(shù)01基本介紹02一代測序技術(shù)的方法基本介紹01基本介紹——第一代測序的發(fā)明人在1997年發(fā)明了利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止測定DNA核苷酸序列的方法。FredSanger及其同事基本介紹——第一代測序的發(fā)明人第一代測序技術(shù)概念：傳統(tǒng)的鏈終止法，化學(xué)降解法，以及在它們的基礎(chǔ)上的各種DNA測序技術(shù)。一代測序技術(shù)的方法02一代測序技術(shù)的方法０１對DNA片段5’或3’末端進(jìn)行放射性標(biāo)記。０２采用特異性化學(xué)試劑修飾和裂解特定的堿基位點(diǎn)。Maxam-Gilbert

化學(xué)降解測序法實(shí)驗(yàn)步驟將標(biāo)記完的樣品，分成四份取待測DNA片段２．G+A反應(yīng)"甲酸"１．G反應(yīng)，"硫酸二甲酯"４．C反應(yīng)在NaCl存在時(shí)，只有C與肼反應(yīng)，得到一系列C末端的片段３．T+C反應(yīng)"肼"一代測序技術(shù)的方法形成大小不一的DNA鏈電泳分離DNA鏈根據(jù)同位素標(biāo)記自顯影后讀出序列Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法的弊端化學(xué)降解測序法自建立以來沒有很大的改進(jìn)，目前僅在分析DNA和蛋白質(zhì)相互作用中的DNA一級結(jié)構(gòu)時(shí)等中才使用。受制于當(dāng)時(shí)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨能力dNTP和ddNTP分子結(jié)構(gòu)式Sanger雙脫氧鏈終止法利用DNA聚合酶特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3’末端。基本原理：雙脫氧鏈終止法主要用于DNA基因分析一代測序技術(shù)的方法Sanger雙脫氧鏈終止測序法原理原理：是以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，在寡核苷酸引物的引導(dǎo)下依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則。在此對引物進(jìn)行了事先標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)4個(gè)測序反應(yīng)在同一反應(yīng)管中進(jìn)行?？梢岳米燥@影技術(shù)。測序程序2.在4只試管中加入適當(dāng)?shù)囊?、模板?種dNTP。分別加入一種一定濃度的ddNTP。3.與單鏈模板結(jié)合的引物