實驗一微藻的培養(yǎng)基配制

實驗一微藻的培養(yǎng)基配制

一、實驗目：掌握微藻的培養(yǎng)基配制方法。以海水單胞藻培養(yǎng)液通用配方“f/2”為例二、實驗原理藻類的培養(yǎng)液必須具備藻類的生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)元素，并且營養(yǎng)鹽的比例應該符合藻類生長繁殖的需要。不同種類的微藻對營養(yǎng)鹽的質和量的需求不同，各有其特殊性，因此，制定某種微藻的一個培養(yǎng)液配方時，首先必須進行一系列的試驗，了解這該種藻類對營養(yǎng)的要求，并在使用中驗證配方的效果，加以改進，使配方達到更理想的水平。藻類對營養(yǎng)鹽的需求也有很多共同點，因而一些培養(yǎng)液配方（如F/2）可應用于多種藻類的培養(yǎng)。

進行微藻培養(yǎng)時，可根據(jù)培養(yǎng)藻類對營養(yǎng)的要求，選用合適的配方，在消毒水中按配方加入各種營養(yǎng)物質配成。所加肥料應保持清潔，某些不清潔肥料必須消毒，預防敵害生物通過肥料污染。

綠藻培養(yǎng)液配方：①海洋三號扁藻培養(yǎng)液（海洋研究所，1960）：NaNO30.1g2Na3C6H5O7﹒11H2O0.02gK2HPO40.01gFe(SO4)3(1%溶液)10滴海水1000ml②亞心形扁藻培養(yǎng)液（湛江水產(chǎn)學院）：NaNO30.05g維生素B12200mμgKH2PO4(1%溶液)0.005g人尿2mlFeC6H5O70.2ml維生素B1200μg海水1000ml培養(yǎng)亞心形扁藻及其他綠藻使用，多用于小型培養(yǎng)和中繼培養(yǎng)，如能加入海泥抽出液20ml，效果更好。硅藻培養(yǎng)液配方：①艾倫-內(nèi)爾森（Allen-Nelson）培養(yǎng)液{Allen，E.J.etal（1910）}：A.KNO320.2g純水100mlB.Na2HPO4.12H2O4.0gCaCl.6H2O4.0gHCl（濃）2.0ml純水80mlFeCl3（溶液）2.0mlB液的配制法：先把氧化鈣4g溶解于40ml純水中。另外把磷酸氫二鈣4g溶解于40ml純水中，再把三氯化鐵溶融液2ml，緩慢滴入，搖動，產(chǎn)生白色沉淀，加熱，緩慢滴入濃鹽酸2ml，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上兩溶液混合。使用時，取A液2ml和B液1ml，加入1000ml海水中，充分混合后加熱消毒，消毒后靜置24h，然后將上層清夜倒出使用。

培養(yǎng)液是根據(jù)培養(yǎng)液配方配制的。為了減少每次稱量的麻煩，固體的營養(yǎng)元素一般都配成母液（如濃縮1000倍的母液），在使用時，只要吸取一定的量加入培養(yǎng)液中即成。主要營養(yǎng)元素可以單項營養(yǎng)元素配成母液，也可以分成若干組，每組2種或多種營養(yǎng)元素同配在一起。微量元素和輔助生長有機物質也多種組合在一起，配成母液。在濃營養(yǎng)溶液中一般生物因不能忍受而死亡。三、實驗材料及用具1、器材電爐；滅菌鍋；pH計500ml試劑瓶（每組5個）；玻棒、500ml燒杯、50ml容量瓶（每組一個）/牛皮紙、細綿繩2、試劑：蒸餾水、海水各種試劑NaNO3;NaH2PO4；FeCl3EDTA；Na2SiO3.9H2O；鹽酸硫銨素(VB1)；BiotinVH三、實驗步驟（一）F/2(+Si)培養(yǎng)基母液的配制（用去離子水配制）1.A液500ml1000倍NaNO337.5g;NaH2PO42.5g2.B液500ml1000倍Fe-EDTA2.5g(FeCl31.6g+EDTA0.9g)3.C液500ml1000倍

Na2SiO3.9H2O10g4.D液500ml1000倍

鹽酸硫銨素(VB1)5mg(試劑50mg/ml取100μl)BiotinVH0.025mg(試劑0.1mg/ml取250μl)VB120.025mg(試劑0.25mg/ml取100μl)先用維生素分別用純水溶解混合，稀HCl將pH調到4.5~5.0，最后用純水稀釋至1升。膜過濾后冰凍保存。5.E液500ml1000倍

CuSO4.5H2O0.0098mg；

ZnSO4.7H2O0.022mgCaCl2.6H2O0.01mg；

MgCl2.4H2O0.180mgNa2MoO4.2H2O0.0063mgA、B、D、E高壓滅菌備用（三）F/2培養(yǎng)基配制1000ml(1升)F/2(+Si)培養(yǎng)基=1000ml(1升)過濾滅菌海水+1mlA液+1mlB液+1mlD液+1mlE液(+1mlC液)注意：煮沸的海水放置涼后（50度以下）再加母液，否則會出現(xiàn)沉淀。（二）海水處理沉淀——砂池過濾——（抽濾）——滅菌（海水放于三角瓶中，置于電爐上煮沸，可殺來一般細菌）實驗二單細胞藻類的培養(yǎng)

一、實驗目的掌握單細胞微藻的實驗室培養(yǎng)(藻種培養(yǎng))方法，細胞生長曲線觀察。二、實驗材料及用具1、實驗材料：小球藻（500ml）、等鞭金藻、扁藻2、實驗儀器：可見分光光度計、顯微鏡（1部/組）、血球計數(shù)板（一個/組）、電爐、滅菌鍋、pH計、500ml燒杯（1個/組）、膠頭滴管（3支/組）、250ml錐形瓶（每組3個）、牛皮紙、細綿繩3、試劑：蒸餾水、海水、碘化鉀三、實驗步驟1、培養(yǎng)基配制：見實驗一2、接種：一般培養(yǎng)的接種量為1/3～1/5.3、計數(shù)：分光光度計測定500nm（OD500）和750nm（OD750）吸光值；細胞計數(shù)板計數(shù)。4、每天測定一次，分別繪制以OD值和細胞絕對數(shù)目為縱坐標、時間為橫坐標的生長曲線，分析細胞數(shù)目與OD500和OD750的相關性。5、觀察并描述微藻不同生長時期的特點小球藻扁藻球等鞭金藻1、血球計數(shù)板計數(shù)方法：（1）攪拌：由于藻類細胞在培養(yǎng)液中分布不均勻，所以在取產(chǎn)前必須進行攪拌，攪拌后立即取樣。（2）固定、稀釋：運動細胞需加碘液殺死才能計數(shù)。如細胞濃度過大，計數(shù)困難，需把水樣稀釋到適宜的程度。（附：魯哥氏液（Lugol‘sSolution）又稱碘液，常用的配方是：將6克的碘化鉀溶于20毫升水中，待完全溶解后加入4克碘，搖蕩，待碘完全溶解后，加入80毫升蒸餾水，貯存在棕色試劑瓶內(nèi)。）（3）計數(shù)板與蓋玻片洗凈擦干――蓋好蓋玻片――搖蕩藻液――吸取藻液（干的微吸管）――迅速加樣――1分鐘后低倍鏡下計數(shù)－計數(shù)任何對角兩大格（加蓋玻片后每一大格即形成一個體積為0.1立方毫米的空間），然后取其平均值。每個樣品須重復計數(shù)兩次。1毫升水體藻細胞＝計算平均值×10,000×藻稀釋倍數(shù)

2、分光光度計定量法比色皿用75％酒精消毒后，將藻液搖勻，倒入2/3體積，在兩個波長下測定吸光度值。注意分光光度計測定前要調零和調滿度。

作業(yè):1、分別繪制以OD值和細胞絕對數(shù)目為縱坐標、時間為橫坐標的生長曲線(三張圖)，分析細胞數(shù)目與OD500和OD750的相關性（兩次相關性），比較哪個波長下的密度值更能代表藻細胞數(shù)目。5、觀察并描述微藻不同生長時期的特點。實驗三藻類細胞葉綠素的提取和細胞色素的觀察一、實驗目的掌握大型和微型海藻葉綠素測定方法。觀察比較不同門藻類的葉綠素的吸收光譜。葉綠素含量是衡量大型海藻生長狀態(tài)的指標之一。浮游植物葉綠素含量，可用來初步估量浮游植物的光合作用能力，并進行估量水域初級生產(chǎn)力。也適用于評價實驗室單種生長狀況。二、實驗材料及用具1、實驗材料：海帶、裙帶菜、紫菜、小球藻、球等鞭金藻等,選4種藻2、實驗儀器：紫外分光光度計(208實驗室)3、實驗器材：研缽（每組一套）、15ml離心管（每組4支-依藻種類定）、15ml刻度試管（每組4支）、0.45

m的濾膜（每組3個），抽濾裝置，離心機（或用20ml針管和濾膜器）4、試劑：丙酮（分析純）、MgCO3三、實驗步驟1、抽濾：減壓過濾5ml的藻類培養(yǎng)液到玻璃纖維濾片上，約加0.1gMgCO3細粉，使均勻覆蓋于薄膜上，倒入水樣抽濾，注意避免高溫、強光及壓力過高，水濾完后，應繼續(xù)抽氣數(shù)分鐘，以盡量吸盡濾膜上水分。2、儲存：將折膜放入樣品儲存裝置中，置黑暗、干燥、低溫處保存。3、研磨和提?。喊褳V膜放到一個組織研磨管內(nèi)的底部，加入2－3ml的90％丙酮，把杵插入管內(nèi)，研磨，在弱光下將濾得的試樣研磨1到2min，再用5ml的90％丙酮把杵上和研磨管內(nèi)的東西洗入15ml的有螺旋蓋的離心管內(nèi)，靜置于暗處10min，使色素充分被提取。（觀察葉綠素熒光）4、離心：（2000g）5min，離心，5、測定：將上清液用90％丙酮定容25ml，在分光光度計上，用1cm的比色皿分別讀取750nm、663nm、645nm、630nm波長的吸光度，并以90％的丙酮作校正吸光度測定。6、計算：分別從663、645、630nm時的光密度值，減去750nm時的光密度值，再除以液槽光程（厘米），即為D663、D645、D630的值。下式計算葉綠素在90％丙酮中的含量。聯(lián)合國教科文組織國際工作組推薦公式Chla（mg/ml）=11.64*D663-2.16*D645+0.1D630Chlb（mg/ml）=3.94*D663+20.97*D645-3.66D630Chla（mg/ml）=5.53*D663-14.81*D645+54.22D6307、葉綠素吸收光譜的測定：將提取的葉綠素放于(石英)比色皿中，用紫外分光光度計測定400nm-750nm波段的吸收光譜。三、作業(yè)：1、計算幾種藻類的葉綠素含量2、比較并說明不同藻類的葉綠素吸收光譜有何異同，并分析原因實驗四微藻的分離方法---微吸管分離法一、實驗目的

1、單胞藻類的培養(yǎng)，首先需要有藻種。原始的藻種是從天然水域混雜的生物群中，運用一定的方法，把所需要的個體，分離出來，而獲得單種培養(yǎng)。2、若藻種受敵害生物及其他雜藻的污染也要通過分離進行純化。

本實驗的目的是使學生了解單胞藻的分離方法，掌握單細胞藻類的微吸管法分離技術。二、實驗材料及用具1、實驗材料：扁藻，球等鞭金藻或小球藻2、實驗儀器：顯微鏡3、實驗器材：細玻璃管或毛細管；載玻片；小試管；脫脂棉；紗布；酒精燈4、試劑：滅菌海水；F/2培海水養(yǎng)基三、實驗步驟1、采樣：水樣可取自天然水域、養(yǎng)殖池、湖泊、溪流及特殊水域環(huán)境等。此外，培養(yǎng)水生生物的或儲水的各種容器、水池，均可能生長大量浮游或附著藻類，也是采樣的理想場所。2、拉制微吸管：選直徑5毫米的細玻璃管，或者其它任何適合拉成毛細管的巴氏滴管，用鑷子夾住滴管的前端，放在酒精噴燈的外焰上，直到玻璃變軟，迅速移離火焰，同時快速拉成毛細管。4、將裝有藻細胞的試管置于適宜的條件下培養(yǎng)。三、實驗步驟3、分離：鏡檢待分離的藻液，調藻液濃度為5-6個藻細胞為宜，在已滅菌的載玻片上滴加6滴消毒培養(yǎng)液，另取一載玻片滴一滴稀釋的待分離藻液，在顯微鏡下用微吸管吸取所需的藻細胞，放在第一滴消毒水中，清洗，再用微吸管吸取所需的藻細胞放在備有培養(yǎng)液的試管中。實驗五微藻的分離方法---平板分離法一、目的：學生掌握平板分離單藻種的方法。適用于能在固體培養(yǎng)基上