微生物顯微鏡和顯微技術(shù)培訓(xùn)課件

微生物顯微鏡和顯微技術(shù)9/20/20242微生物顯微鏡和顯微技術(shù)借助于顯微鏡觀察微生物的方法即顯微技術(shù)，顯微技術(shù)是微生物檢驗(yàn)技術(shù)中最常用的技術(shù)之一。9/20/20243微生物顯微鏡和顯微技術(shù)顯微鏡的種類和原理顯微觀察樣品的制備9/20/20244微生物顯微鏡和顯微技術(shù)一、顯微鏡的種類和原理(一)、光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡現(xiàn)在的光學(xué)顯微鏡分辨的最小極限達(dá)0.2μm。9/20/20245微生物顯微鏡和顯微技術(shù)普通光學(xué)顯微鏡的幾個(gè)基本概念9/20/20246微生物顯微鏡和顯微技術(shù)9/20/20247微生物顯微鏡和顯微技術(shù)9/20/20248微生物顯微鏡和顯微技術(shù)9/20/20249微生物顯微鏡和顯微技術(shù)9/20/202410微生物顯微鏡和顯微技術(shù)1、普通光學(xué)顯微鏡由三部分構(gòu)成①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器；②光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成；③機(jī)械裝置：用于固定材料和觀察方便9/20/202411微生物顯微鏡和顯微技術(shù)油鏡使用光鏡使用方法9/20/202412微生物顯微鏡和顯微技術(shù)2、暗視野顯微鏡原理：聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。適用范圍：生活細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察。

9/20/202413微生物顯微鏡和顯微技術(shù)特點(diǎn):只能看到物體的存在與運(yùn)動(dòng),不能辨清其微細(xì)結(jié)構(gòu)。暗視野顯微鏡的使用9/20/202414微生物顯微鏡和顯微技術(shù)基本原理:把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。3、相差顯微鏡相差顯微鏡使用9/20/202415微生物顯微鏡和顯微技術(shù)微分干涉差顯微鏡DIC顯微鏡下的硅藻形態(tài)適用范圍：對(duì)透明的活體進(jìn)行直接觀察9/20/202416微生物顯微鏡和顯微技術(shù)4、熒光顯微鏡原理：熒光素吸收紫外線并放出部分波長較長的可見光，發(fā)熒光的物體會(huì)在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體9/20/202417微生物顯微鏡和顯微技術(shù)綠色：銅綠假單胞菌黃色：蠟樣芽孢桿菌綠色：微管紅色：微絲藍(lán)色：核9/20/202418微生物顯微鏡和顯微技術(shù)1931年在德國柏林由克諾爾和哈羅斯卡首先裝配完成的。用高速電子束代替光束。放大倍數(shù)可達(dá)80萬倍，分辨的最小極限達(dá)0.2納米。

（二）電子顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡9/20/202419微生物顯微鏡和顯微技術(shù)1、透射電子顯微鏡目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。用電子束作光源，用電磁場作透鏡。用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬倍.由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。9/20/202420微生物顯微鏡和顯微技術(shù)高爾基體的TEM照片(偽彩色)9/20/202421微生物顯微鏡和顯微技術(shù)9/20/202422微生物顯微鏡和顯微技術(shù)2、掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖工作原理：電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標(biāo)本表面立體形貌有關(guān)。電子經(jīng)探測器收集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)9/20/202423微生物顯微鏡和顯微技術(shù)掃描電子顯微鏡原理9/20/202424微生物顯微鏡和顯微技術(shù)9/20/202425微生物顯微鏡和顯微技術(shù)3、掃描隧道顯微鏡（STM）掃描隧道顯微鏡拍攝的7個(gè)鈾原子團(tuán)9/20/202426微生物顯微鏡和顯微技術(shù)9/20/202427微生物顯微鏡和顯微技術(shù)4原子力顯微鏡9/20/202428微生物顯微鏡和顯微技術(shù)特點(diǎn)光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡最高放大倍數(shù)約1000-150010萬以上最佳分辨率0.2微米0.5納米輻射源可見光電子束輻射源通過的媒介空氣高真空透鏡類型玻璃電磁體反差來源光吸收的差異或特定波長電子散射聚焦機(jī)械機(jī)械調(diào)節(jié)透鏡位置調(diào)節(jié)電磁透鏡的流向改變放大倍數(shù)的方法調(diào)換物鏡或目鏡調(diào)節(jié)電磁透鏡的流向樣品承載載玻片金屬網(wǎng)（通常為銅網(wǎng)）光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的特點(diǎn)比較9/20/202430微生物顯微鏡和顯微技術(shù)（一）光學(xué)顯微鏡制樣活體觀察染色壓滴法懸滴法菌絲埋片法活菌死菌美藍(lán)染色簡單染色鑒別染色革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色二、顯微觀察樣品的制備9/20/202431微生物顯微鏡和顯微技術(shù)（1）壓滴法：菌懸液滴于載玻片上，加蓋玻片，觀察。（2）懸滴法：蓋玻片中央加一小滴菌懸液，翻轉(zhuǎn)置于特制的凹載玻片上，觀察。（3）菌絲埋片法：無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，觀察菌絲形態(tài)。光學(xué)顯微鏡樣品制備－－活體觀察特點(diǎn)：避免染色對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，用于運(yùn)動(dòng)性、攝食特性、生長繁殖過程中形態(tài)變化等觀察

9/20/202432微生物顯微鏡和顯微技術(shù)用途：微生物的細(xì)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)染色前需要對(duì)樣品固定.常用固定方法：酒精火焰加熱、化學(xué)固定光學(xué)顯微樣品制備－－染色觀察9/20/202433微生物顯微鏡和顯微技術(shù)1)、簡單染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢2）、革蘭氏染色法：涂片→固定→結(jié)晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脫色→番紅復(fù)染→水洗→干燥→觀察9/20/202434微生物顯微鏡和顯微技術(shù)（二）、電子顯微鏡的制樣樣品在進(jìn)行電鏡觀察前必須進(jìn)行固定和干燥，制樣時(shí)一般采用重金屬鹽染色或噴鍍，提高在電鏡下的反差。9/20/202435微生物顯微鏡和顯微技術(shù)※1、透射電鏡的樣品制備負(fù)染技術(shù)投影技術(shù)超薄切片技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)9/20/202436微生物顯微鏡和顯微技術(shù)負(fù)染法將樣品的背景染色以凸現(xiàn)樣品，所以稱為負(fù)染法。一般是采用電子密度高，本身不會(huì)顯示任何結(jié)構(gòu)，又和樣品不起反應(yīng)的物質(zhì)，如磷鎢酸的鈉鹽將樣品包圍，同時(shí)染色劑還會(huì)進(jìn)入觀察對(duì)象的內(nèi)部，這樣，既能顯示外形，又可在一定程度上反映樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。負(fù)染法原理9/20/202437微生物顯微鏡和顯微技術(shù)負(fù)染色法觀察的鞭毛用途：可以觀察細(xì)菌細(xì)胞、病毒等。9/20/202438微生物顯微鏡和顯微技術(shù)在真空條件下，用電子散射能力強(qiáng)的重金屬原子來噴鍍樣品表面，這樣在樣品和沒有噴鍍的區(qū)域形成了較強(qiáng)的反差，而沒有噴鍍的部分成了樣品的投影，根據(jù)投影了解樣品的立體形狀、高度。投影法9/20/202439微生物顯微鏡和顯微技術(shù)投影法觀察的噬菌體用途：觀察細(xì)菌的鞭毛或病毒的顆粒9/20/202440微生物顯微鏡和顯微技術(shù)這是最常用的方法，可以觀察細(xì)胞或其它樣品內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。樣品固定→脫水→包埋→切片。只有在20—100納米厚度的切片用透射電子顯微鏡才能觀察，所以一般細(xì)菌樣品，一個(gè)細(xì)胞要分割成10片到50片。超薄切片法超薄切片法觀察的一種厭氧弧菌9/20/202441微生物顯微鏡和顯微技術(shù)樣品-196℃迅速冷凍→加溫到-100℃→切割樣品→升華(真空)掉斷口處的冰→重金屬噴鍍斷口表面→電子顯微鏡觀察冰凍蝕刻法9/20/202442微生物顯微鏡和顯微技術(shù)冰凍蝕刻法制備的酵母菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖優(yōu)點(diǎn):可以避免在固定、脫水和包埋過程中造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的人為改變而形成的假象。9/20/202443微生物顯微鏡和顯微技術(shù)

2、、掃描電鏡樣品的制備樣品先要經(jīng)過固定、脫水等處理，以免在