DB12T 651-2016 轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆GTS40-3-2及其衍生品種定量檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR方法

67.050B

23

DB12天津 市地 方標(biāo) 準(zhǔn)DB12/T

651—2016轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆

GTS40-3-2

定量檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光

PCR

方法Detection

of

and

—Quanlitative

for

soybean

GTS

40-3-2

and

derivates2016-09-27

發(fā)布 2016-11-01

實(shí)施天津市市場(chǎng)和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布DB12/T

651—2016 本標(biāo)準(zhǔn)按照

GB/T

給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督寶坻檢測(cè)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、宛煜嵩、楊炳存、趙新、李亮、陳銳、朱珠、劉娜、王成、徐石勇。本標(biāo)準(zhǔn)

年

9

月首次發(fā)布。DB12/T

651—2016

GTS40-3-2

方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆

GTS

轉(zhuǎn)化體特異性定量

PCR

檢測(cè)方法的術(shù)語和定義、檢測(cè)方法、結(jié)果計(jì)算。本標(biāo)準(zhǔn)適用于轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆

GTS

及其衍生品種，以及制品中

GTS

轉(zhuǎn)化體的定量

PCR

檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T

轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè) 通用要求農(nóng)業(yè)部

1485

4—2010 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) DNA

農(nóng)業(yè)部

2031

號(hào)公告—19—2013 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè) 3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1Lectin

Lectin

編碼大豆凝集素的基因。3.2

轉(zhuǎn)化體特異性序列

40-3-2GTS

外源插入片段

5′

啟動(dòng)子部分序列和大豆基因組的部分序列。4原理根據(jù)大豆外源基因和內(nèi)標(biāo)基因特異性序列設(shè)計(jì)引物和

熒光探針，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光

PCR

擴(kuò)增。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品模板拷貝數(shù)與

Ct

值間的線性關(guān)系，分別繪制外源基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算試樣中外源基因和內(nèi)標(biāo)基因的拷貝數(shù)及其比值。5 檢測(cè)方法5.1

試劑和材料除非另有說明，僅使用分析純?cè)噭┖椭卣麴s水或符合

GB/T

6682

規(guī)定的一級(jí)水。5.1.1

PCR

反應(yīng)試劑盒。DB12/T

651—20165.1.2引物和探針。5.1.2.1

基因。lec-1215F：5′′lec-1332R：5′′lec-1269P：5′-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-3′預(yù)期擴(kuò)增片段大小為

（參見附錄

A）。5.1.2.2

轉(zhuǎn)化體特異性序列。GTS40-3-2F：5'-

CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG

-

3'：

GACTTGTCGCCGGGAATG

-

3'：5'

-CGCAACCGCCCGCAAATCC-

3'預(yù)期擴(kuò)增片段大小為

121

（參見附錄

A

10

μmol/L需避光保存。5.2 儀器

g

和

PCR

其他相關(guān)儀器設(shè)備。5.3 分析步驟5.3.1 按

NY/T

672

和農(nóng)業(yè)部

2031

號(hào)公告—19—2013

規(guī)定執(zhí)行。5.3.2 試樣準(zhǔn)備按

NY/T

672

和農(nóng)業(yè)部

2031

號(hào)公告—19—2013

規(guī)定執(zhí)行。5.3.3 試樣預(yù)處理按農(nóng)業(yè)部

1485

號(hào)公告—4—2010

規(guī)定執(zhí)行。5.3.4 DNA

模板制備按農(nóng)業(yè)部

1485

號(hào)公告—4—2010

規(guī)定執(zhí)行。5.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備采用相同的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制

轉(zhuǎn)化體和

內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因組

DNA

0.1×TE

或水稀釋至

1×10

copies/μL（相當(dāng)于

20-100

ng/μL模板。然后再用

0.1×TE

梯度稀釋初始模板，制備不同濃度的

標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液至少涵蓋

5

個(gè)

濃度梯度，最低濃度拷貝數(shù)小于

200，最高濃度拷貝數(shù)大于

40000。5.3.6PCR

反應(yīng)5.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣實(shí)時(shí)熒光

PCR

同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣的

PCR

反應(yīng)，每個(gè)

PCR

反應(yīng)設(shè)置

3

轉(zhuǎn)化體實(shí)時(shí)熒光

PCR

1

在

PCR

反應(yīng)管中依次加入反應(yīng)試劑，混勻；

內(nèi)標(biāo)基因?qū)崟r(shí)熒光

PCR

反應(yīng)按

10

GTS40-3-2F0.8

2.0

10

GTS40-3-2R0.8

2.0

10

GTS40-3-2P0.4

.0

2.0

25.0

25.0

10

lec-1215F0.2

0.5

10

lec-1332R0.2

0.5

10

lec-1269P0.2

0.5

.0

25.0

25.0

DB12/T

651—2016表

2

在

PCR

反應(yīng)管中依次加入反應(yīng)試劑，混勻。將

PCR

管放在離心機(jī)上，500

g~3

000

g

離心

10

s，然后取出

PCR

管，放入

PCR

儀中。運(yùn)行實(shí)時(shí)熒光

PCR

反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性

2

；進(jìn)行

95℃變性

15

s，60℃退火延伸

1

60

光信號(hào)。表

1表

1

PCR

反應(yīng)體系表

2 Lectin

PCR

反應(yīng)體系

DNA

作為

轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)的陰性對(duì)照的模板；以鮭魚精子

DNA

內(nèi)標(biāo)基因檢測(cè)的陰性對(duì)照的模板；用純水作為空白對(duì)照

PCR

PCR

PCR

反應(yīng)條件與

相同。5.3.7 數(shù)據(jù)分析5.3.7.1

設(shè)定閾值實(shí)時(shí)熒光

PCR

反應(yīng)結(jié)束后，以

PCR

剛好進(jìn)入指數(shù)期擴(kuò)增來設(shè)置熒光信號(hào)閾值，并根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整。設(shè)定閾值處，要求不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線平行，而且同一樣品的不同平行間重復(fù)性良好。5.3.7.2

Ct

值

n

n

(2)DB12/T

651—2016設(shè)定閾值后，熒光定量

PCR

儀的數(shù)據(jù)分析軟件自動(dòng)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的

Ct

值，并記錄。5.3.7.3

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

Ct

轉(zhuǎn)化體和Lectin

內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：式中：y—測(cè)試樣品的

Ct

a—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；x—模板拷貝數(shù)以

10

為底數(shù)的對(duì)數(shù)；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。5.3.7.4

數(shù)據(jù)可接受的標(biāo)準(zhǔn)

陰性對(duì)照和空白對(duì)照的

轉(zhuǎn)化體

Ct

值≥38；Lectin

陰性對(duì)照和空白對(duì)照的Lectin

內(nèi)標(biāo)基因

Ct

38

R

以進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。否則重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光

PCR

擴(kuò)增。5.3.7.5

含量計(jì)算5.3.7.5.1

計(jì)算試樣模板拷貝數(shù)將試樣的

轉(zhuǎn)化體和

內(nèi)標(biāo)基因的

Ct

值分別帶入

轉(zhuǎn)化體和

Lectin

內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算

轉(zhuǎn)化體和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

的拷貝數(shù)。計(jì)算試樣模板拷貝數(shù)公式：ba式中：n—模板拷貝數(shù)y—測(cè)試樣品的

Ct

a—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。5.3.7.5.2

計(jì)算試樣中轉(zhuǎn)基因含量將

轉(zhuǎn)化體拷貝數(shù)和

3

百分含量。計(jì)算試樣中

轉(zhuǎn)化體百分含量的公式：×100 % (3)式中：c—試樣中

的百分含量(%)；n—GTS40-3-2

轉(zhuǎn)化體拷貝數(shù)；n—大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

拷貝數(shù)。DB12/T

651—20166 結(jié)果分析與表述6.1

Lectin

內(nèi)標(biāo)基因和

GTS40-3-2

內(nèi)標(biāo)基因和

轉(zhuǎn)化體的

Ct

值<36

轉(zhuǎn)化體，

轉(zhuǎn)化體含量為

c”。6.2

內(nèi)標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，且

Ct

值<36，

轉(zhuǎn)化體

Ct

值38

或未出現(xiàn)典型擴(kuò)增

轉(zhuǎn)化體”。6.3

Lectin

內(nèi)標(biāo)基因和

GTS40-3-2

轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，

內(nèi)標(biāo)基因

值<36，

轉(zhuǎn)化體

Ct

36～38

之間，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合

6.1-6.2

的情況，依照

6.1-6.2

進(jìn)行判斷；如重復(fù)實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，但

Ct

值仍在

36～38

之間，則判定樣品檢出

轉(zhuǎn)化體，表述為“樣品中檢測(cè)出

轉(zhuǎn)化體”

。6.4

Lectin

內(nèi)標(biāo)基因和

GTS40-3-2

轉(zhuǎn)化體未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，或

Ct

值38，表明樣品中未檢出大豆。6.5

Lectin

內(nèi)標(biāo)基因和

GTS40-3-2

Ct

值均在

36～38

驗(yàn)。如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合

6.1-6.4

的情況，依照

6.1-6.4

進(jìn)行判斷；如重復(fù)實(shí)驗(yàn)

內(nèi)標(biāo)基因和

Ct

值仍在

36～

轉(zhuǎn)化體，表述為“樣品中檢測(cè)出

DB12/T

651—2016附錄A（資料性附錄）A.1 Lectin基因?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列（Accession

No.K00821）1

CCACATTTGG

CCGGTAGCGT

TGCCAGCTTC61

GCCGCTTCCT

CTTCTATGCC

AAAGGC