高考生物二輪復習PCR技術(shù)與應(yīng)用專題拓展

新知講解一、教學目標：1.基于PCR原理，掌握引物的設(shè)計原則。2.由新冠病毒核酸檢測原理，體會在真實科學研究與實踐中，PCR技術(shù)的應(yīng)用情景，嘗試在實驗設(shè)計中，利用PCR技術(shù)解決實際問題。二、教學重點：通過案例，學生總結(jié)歸納出PCR技術(shù)應(yīng)用于新冠病毒核酸檢測的原理。三、教學難點：學生運用PCR技術(shù)，解決分析相關(guān)問題。復習舊知1.[（2017·全國卷Ⅰ，38（5）]艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗為證明DNA是遺傳物質(zhì)做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是___________________________________________________。DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體

體外重組的質(zhì)?？梢赃M入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達（3min）1.PCR反應(yīng)的體系預(yù)習檢測（4min）2.PCR技術(shù)的過程（退火）新知講解（25min）PCR的首要任務(wù)就是引物設(shè)計。引物設(shè)計的好壞，直接影響了PCR的結(jié)果。成功的PCR反應(yīng)既要高效，又要特異性擴增產(chǎn)物。一、PCR引物設(shè)計原則擴增特異性擴增高效性引物①引物長度要適宜②引物GC含量要適宜③引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列④引物5'端可以修飾，3'端不可修飾⑤退火溫度要適宜（7min）

一般，引物的長度為15-23bp，常用的長度為18-21bp。過長會導致退火溫度高，也會導致延伸溫度大于74℃，不適于Taq酶進行反應(yīng)。過短會導致退火溫度低，特異性差。①

引物長度要適宜引物的GC含量一般為45-55%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。過低擴增效果不佳，過高易出現(xiàn)非特異性條帶。上下游引物的GC含量不能相差太大。②引物GC含量要適宜堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，從而影響引物與模板的復性結(jié)合。1、發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）自身互補2、二聚體（Dimer）兩個引物間互補發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體③引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列引物的延伸是從3'端開始的，不能進行任何修飾。引物的5'端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點，加標記熒光，引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。在引物的5`端連接一對限制酶的識別序列，這樣便于目的基因連接到載體上。④引物5'端可以修飾，3'端不可修飾如果引物堿基數(shù)較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當減低退火溫度，使DNA雙鏈結(jié)合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的。退火溫度高，擴增特異性強；退火溫度低，擴增效率高。思考原因是什么？⑤退火溫度要適宜新型冠狀病毒的檢測（18min）新冠病毒核酸檢測咽拭子采樣檢測是否有新冠病毒RNA新冠病毒RNA的量太少無法檢測出來需要擴增后檢測PCR只能擴增DNA將新冠病毒的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄后形成DNAPCR擴增逆轉(zhuǎn)錄后的DNA檢測實時熒光定量PCR可以在擴增DNA的同時進行檢測。rRT-PCR可以分兩部分來看，其中r代表實時（real-time），主要是通過熒光PCR連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強弱的變化，即時分析目的基因的初始量，該技術(shù)的發(fā)明實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。RT表示逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）。在RT-PCR中，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增cDNA（圖1）。2019-nCoV核酸檢測優(yōu)點：早期診斷、靈敏度和特異性高，判斷是否感染新冠病毒的直接證據(jù)。二、PCR技術(shù)的應(yīng)用:（實時）熒光定量PCR（（r）RT-PCR）PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。熒光值1.PCR擴增過程中熒光信號強度變化的變化規(guī)律①早期:擴增產(chǎn)物較少，熒光信號不易檢測到②指數(shù)期:熒光值隨循環(huán)次數(shù)增加呈指數(shù)增加。③線性期:熒光值隨循環(huán)次數(shù)增加呈線性增加。④平臺期:熒光值隨循環(huán)次數(shù)增加幾乎不增加。早期指數(shù)期線性期平臺期Taq酶活性下降引物濃度下降原料濃度下降熒光值循環(huán)數(shù)2.相同DNA模板，在同一臺PCR儀器上重復擴增曲線圖通過重復擴增曲線發(fā)現(xiàn)，在指數(shù)期的早期，重復實驗的結(jié)果是一致。熒光值循環(huán)數(shù)3.熒光閾值在熒光擴增曲線的指數(shù)增長期的早期，設(shè)定一個熒光強度標準，稱為熒光閾值。如圖所示。熒光閾值熒光閾值是人為設(shè)定的，可以設(shè)定在指數(shù)擴增期早期的任意位置上。該位置上，在重復實驗中，熒光值是相同的。熒光值循環(huán)數(shù)4.Ct值(循環(huán)閾值)熒光閾值PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的熒光值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。Ct值4.Ct值(循環(huán)閾值)如圖，兩個不同樣品(樣品1和2)DNA經(jīng)過PCR擴增，得到的Ct值為Ct1和Ct2。熒光值循環(huán)數(shù)樣品1樣品2Ct1Ct2樣品中DNA的含量越多，其Ct值就越小。因此，樣品1中的DNA含量較樣品2中的DNA含量多。4.Ct值(循環(huán)閾值)如圖，兩個不同樣品(樣品1和2)DNA經(jīng)過PCR擴增，得到的Ct值為Ct1和Ct2。熒光值循環(huán)數(shù)樣品1樣品2Ct1Ct2樣品中DNA的含量越多，其Ct值就越小。樣品中DNA(模板DNA)的量與Ct值呈線性關(guān)系(負相關(guān))根據(jù)樣品擴增的Ct值就可以計算出樣品所含的模板DNA量。新冠病毒核酸檢測咽拭子采樣新冠病毒RNADNA逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCRCt值小于35大于35有傳染性無傳染性我國新冠肺炎防治最新診療方案(第9版)規(guī)定居家隔離醫(yī)院收治奧密克戎變異病毒毒力降低典例.（2021南通期末考試改編）（7min）“實時熒光定量RT—PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在l~2h內(nèi)即可得到檢測結(jié)果。TaqMan探針是實時熒光定量RT—PCR技術(shù)中一種常用探針（如圖1），其5末端連接熒光基團（R）,3末端連接淬滅劑（Q）。當探針完整時，R發(fā)出的熒光信號被Q吸收而不發(fā)熒光。在PCR擴增過程中，當Taq酶遇到探針時會使探針水解而釋放出游離的R和Q,R發(fā)出的熒光信號被相應(yīng)儀器檢測到，熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步（如圖2）。請據(jù)圖回答：（1）這種分子層面的熒光RT—PCR檢測具有特異性和靈敏性都很高的特點，主要與試劑盒中的

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有關(guān)。（2）新冠病毒（nCoV-2019）是冠狀病毒大家庭中的新的一員，其堿基序列與引起SARS的冠狀病毒堿基序列有79.5%的相似性，與流感病毒堿基相似度也較高，但nCoV-2019有部分特有序列，那么實時熒光定量RT—PCR中引物、TaqMan探針中堿基序列的設(shè)計應(yīng)主要依據(jù)

，以避免假陽性的出現(xiàn)。引物TaqMan探針nCoV-2019特有序列（3）在實時熒光定量RT—PCR過程中，通過熒光強度的變化監(jiān)測產(chǎn)生量的變化從而得到一條熒光擴增曲線圖（如下圖）。最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，設(shè)置為基線;之后進入指數(shù)增長期，在這個時期設(shè)置一個熒光閾值線;Ct值是PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)，則Ct值越小，起始模板量越

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從而實現(xiàn)對起始模板的相對定量分析。若每分子探針水解釋放的R基團熒光強度為定值a，則反應(yīng)體系中某時刻熒光信號強度（Rn）主要與

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有關(guān)。指數(shù)擴增期平臺期大擴增次數(shù)病毒RNA初始數(shù)量典例2：新型冠狀病毒是一種單鏈RNA病毒，新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定。(1)首先，從樣本中提取病毒RNA，經(jīng)__________酶作用生成cDNA。然后以cDNA為模板進行實時熒光PCR擴增，測定樣品中病毒核酸量。逆轉(zhuǎn)錄(2)通過實時熒光PCR擴增目的基因，需額外添加熒光標記探針（一小段單鏈DNA，可與目的基因中部序列特異性結(jié)合）。當探針完整時，不產(chǎn)生熒光。在PCR過程中，與目的基因結(jié)合的探針被TaqDNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測到（如圖1）。①當樣本中有目的基因時，引物和探針與目的基因退火時，通過______________________原則而特異性結(jié)合。②在PCR循環(huán)的延伸階段，TaqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。檢測到的熒光強度與反應(yīng)體系中DNA分子數(shù)呈_________（正相關(guān)或反相關(guān)）關(guān)系。堿基互補配對原則正相關(guān)(3)通過實時熒光PCR檢測新型冠狀病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖2所示。①與指數(shù)增長期相比，線性增長期目的基因數(shù)量的增長率下降，原因有_________。Taq酶活性下降、引物濃度下降、原料dNTP濃度下降等。(3)通過實時熒光PCR檢測新型冠狀病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖2所示。②Ct值的含義：在PCR擴增過程中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)。因此，當樣本中初始模板越多時，Ct值就_________。越小(3)通過實時熒光PCR檢測新型冠狀病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖2所示。③某新型冠狀病毒核酸檢測說明書標明，Ct≤37判定為陽性，Ct>40或無Ct值判定為陰性。圖2所示新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果應(yīng)判定為_________。陽性(4)陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染?？赡墚a(chǎn)生假陰性的因素有________。a.取樣太早，樣本中病毒量少，達不到實時熒光PCR檢測閾值b.樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解c.病毒發(fā)生變異abc（5min）NC膜上的檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）。結(jié)合墊內(nèi)含有標記的抗原特異性抗體，可以與樣本中的抗原（病毒蛋白）發(fā)生結(jié)合，當液流到達檢測線（T線）時，固定在這條線上的第二種抗原特異性抗體再次與抗原結(jié)合，將會呈現(xiàn)陽性結(jié)果。質(zhì)控線（C線）包被IgG抗體，可以結(jié)合樣本墊中抗體，用于判斷層析過程是否順利?？贵w

新型冠狀病毒肺炎發(fā)病7天后，血清特異性抗體逐漸產(chǎn)生，首先出現(xiàn)的是免疫球蛋白IgM抗體，然后出現(xiàn)IgG抗體。因此，IgM抗體增高提示近期急性感染，IgG抗體增