脂質(zhì)體脂膜結(jié)構(gòu)的測(cè)定 X射線(xiàn)小角散射檢測(cè)方法-征求意見(jiàn)稿

2T/SASXXXX—XXXX本文件規(guī)定了利用X射線(xiàn)小角散射技術(shù)測(cè)定脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層及其修飾磷脂層的厚度與分布的方法。本文件適用于脂膜特征結(jié)構(gòu)在納米尺寸范圍內(nèi)的各向同性的稀疏樣品體系，主要包括包載藥物等成分的脂質(zhì)體溶液樣品。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T13221納米粉末粒度分布的測(cè)定X射線(xiàn)小角散射法GB/T38944無(wú)損檢測(cè)中子小角散射檢測(cè)方法ISO17867粒度分析-X射線(xiàn)小角散射方法(Particlesizeanalysis-SmallangleX-rayscattering(SAXS))ISO20804X射線(xiàn)小角散射方法測(cè)量多孔及顆粒體系內(nèi)比表面積(Determinationofthespecificsurfaceareaofporousandparticulatesystemsbysmall-angleX-rayscattering)ISO23484X射線(xiàn)小角散射方法測(cè)量粒子濃度(Determinationofparticleconcentrationbysmall-angleX-rayscattering)ISO26824顆粒體系的粒子表征-術(shù)語(yǔ)(Particlecharacterizationofparticulatesystems–Vocabulary)3術(shù)語(yǔ)和定義ISO26824界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1脂質(zhì)體liposome由脂質(zhì)雙分子層形成的微小囊泡。3.2稀疏體系dilutesystem所包含的待測(cè)粒子濃度低，粒子間相互作用可以忽略不計(jì)的體系。4符號(hào)本文件使用的符號(hào)如表1所示。表1符號(hào)含義及單位qnm-1I(q)-T-P(q)-3T/SASXXXX—XXXXF(q)-P(z)-5方法原理X射線(xiàn)小角散射是由樣品中電子密度不均勻性分布所引起的、位于入射X射線(xiàn)束附近（通常小于5°)的散射現(xiàn)象。對(duì)于溶液樣品而言，其散射圖像源于X射線(xiàn)照射到的所有溶劑和溶質(zhì)分子散射信號(hào)的疊加。因此，為得到脂質(zhì)體粒子的散射強(qiáng)度，需從總散射強(qiáng)度中扣除溶劑等本底散射強(qiáng)度。在稀疏樣品體系中，粒子間的相互作用忽略不計(jì)，脂質(zhì)體粒子的散射強(qiáng)度直接反映了其內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征。因此，可以通過(guò)結(jié)構(gòu)模型擬合計(jì)算得到脂質(zhì)雙分子層及其修飾磷脂層的厚度和分布等參數(shù)。6試樣的制備和要求6.1濃度要求脂質(zhì)體樣品濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致散射信號(hào)太弱，而濃度過(guò)高可涉及粒子間的相互作用，影響數(shù)據(jù)分析。樣品制備時(shí)宜通過(guò)建立濃度梯度確定散射強(qiáng)度與濃度的依賴(lài)關(guān)系。6.2分散性要求樣品制備宜保證其均一性或單分散性，如采用特定孔徑的聚碳酸酯膜擠出。6.3輔助性測(cè)試要求宜結(jié)合動(dòng)態(tài)光散射、透射電鏡等表征技術(shù)確定樣品的尺寸、形貌等基本特征，輔助X射線(xiàn)小角散射技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)模型的建立。對(duì)于包載藥物等成分的脂質(zhì)體樣品，宜同時(shí)制備其未包載的空白脂質(zhì)體作為檢測(cè)對(duì)照組。7檢測(cè)系統(tǒng)和裝置7.1檢測(cè)系統(tǒng)X射線(xiàn)小角散射檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)包括光源、準(zhǔn)直系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、樣品臺(tái)、探測(cè)器等，可選用實(shí)驗(yàn)室X射線(xiàn)小角散射儀或同步輻射X射線(xiàn)小角散射線(xiàn)站進(jìn)行檢測(cè)。前者通常采用金屬靶產(chǎn)生X射線(xiàn)，后者則依托更高強(qiáng)度的同步輻射X射線(xiàn)光源。7.2樣品池裝置樣品池應(yīng)滿(mǎn)足X射線(xiàn)散射的光路要求，如自身不能產(chǎn)生明顯的散射信號(hào)、X射線(xiàn)透過(guò)率高等。通?？梢詫悠纷⑷氡”诿?xì)管（如外徑為1mm，壁厚為0.01mm的石英玻璃毛細(xì)管）內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。宜選擇便于重復(fù)使用的樣品池裝置，以避免因樣品池間差異所造成的本底散射扣減的不準(zhǔn)確。7.3檢測(cè)區(qū)間及校正在檢測(cè)之前，應(yīng)根據(jù)脂質(zhì)體脂膜結(jié)構(gòu)的尺寸范圍對(duì)所需的散射矢量區(qū)間按照公式（1）進(jìn)行估算，式中：d——樣品的目標(biāo)結(jié)構(gòu)尺寸，單位為納米（nm）。估算出所需要的散射矢量檢測(cè)區(qū)間后，即可在一定的入射X射線(xiàn)波長(zhǎng)條件下，通過(guò)改變樣品到探測(cè)器距離來(lái)調(diào)節(jié)實(shí)際的檢測(cè)范圍。應(yīng)選擇校準(zhǔn)樣品（如山崳酸銀粉末）對(duì)當(dāng)前檢測(cè)條件下的散射矢量進(jìn)行標(biāo)定。8檢測(cè)步驟4T/SASXXXX—XXXX8.1步驟一將樣品池裝置固定在樣品臺(tái)上，調(diào)整樣品池中心與X射線(xiàn)光路位置一致。8.2步驟二將樣品注入樣品池中。根據(jù)樣品對(duì)X射線(xiàn)的吸收情況以及散射信號(hào)接收探測(cè)器的靈敏度和飽和度，選擇合理的曝光時(shí)間。若采用同步輻射X射線(xiàn)光源測(cè)試，曝光時(shí)間宜設(shè)置為1s～100s；采用金屬靶X射線(xiàn)源測(cè)試，曝光時(shí)間宜設(shè)置為30min～60min。8.3步驟三開(kāi)始測(cè)試樣品，保存及記錄樣品的散射圖像以及光強(qiáng)度計(jì)數(shù)。應(yīng)進(jìn)行多次曝光測(cè)試，取平均值以提高散射數(shù)據(jù)信噪比。8.4步驟四清洗樣品池后，將與樣品相匹配的緩沖溶劑注入樣品池中。測(cè)試過(guò)程中的光路狀態(tài)、曝光時(shí)間等應(yīng)與樣品的測(cè)試條件保持一致。8.5步驟五清洗樣品池后，從步驟二開(kāi)始測(cè)試下一個(gè)樣品。9檢測(cè)數(shù)據(jù)分析9.1步驟一利用軟件標(biāo)出探測(cè)器損壞及無(wú)效的像素單元（例如不能正常感光、束流阻擋器位置處的像素單元等并在后續(xù)計(jì)算過(guò)程中忽略該單元的數(shù)據(jù)。9.2步驟二脂質(zhì)體溶液樣品為各向同性體系，無(wú)需選取特定方向，全探測(cè)器的數(shù)據(jù)均可用于徑向平均轉(zhuǎn)化為一維散射強(qiáng)度數(shù)據(jù)。注：絕對(duì)散射強(qiáng)度校正非本標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析必要步驟，如有需要，可參考ISO9.3步驟三按公式（2）對(duì)樣品吸收、本底進(jìn)行校正，得到修正后的散射強(qiáng)度，式中：Imeasq——實(shí)驗(yàn)測(cè)得的脂質(zhì)體粒子散射強(qiáng)度；Is(q)——樣品散射強(qiáng)度；Ib(q)——與樣品相匹配的緩沖溶劑散射強(qiáng)度；Ts——樣品透射率；Tb——緩沖溶劑透射率。透射率由光強(qiáng)度計(jì)數(shù)比值計(jì)算而得。9.4步驟四宜根據(jù)檢測(cè)樣品的脂膜特征信息（如雙分子層層數(shù)等選擇合適的結(jié)構(gòu)模型以及尺寸分布函數(shù)進(jìn)行散射強(qiáng)度曲線(xiàn)擬合。9.5步驟五5T/SASXXXX—XXXX基于公式（3）進(jìn)行優(yōu)化搜索，定量解析出脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層及其修飾磷脂層的厚度等參數(shù)。簡(jiǎn)化的卡方值x越接近于1，表明模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的吻合度越高。式中：Imeasq——通過(guò)公式（2）修正后的散射強(qiáng)度；Imodelq——利用模型計(jì)算的理論散射強(qiáng)度；N——數(shù)據(jù)點(diǎn)個(gè)數(shù)；M——擬合參數(shù)個(gè)數(shù)；?I(q)——不確定度；i——數(shù)據(jù)點(diǎn)的索引。10檢測(cè)數(shù)據(jù)分析結(jié)果10.1擬合結(jié)果的曲線(xiàn)表示宜采用實(shí)驗(yàn)散射強(qiáng)度與模型擬合散射強(qiáng)度的對(duì)比關(guān)系圖表達(dá)，橫坐標(biāo)為散射矢量，縱坐標(biāo)為散射強(qiáng)度，如圖1所示。圖1實(shí)驗(yàn)散射強(qiáng)度與模型擬合散射強(qiáng)度對(duì)比10.2相關(guān)參數(shù)表示可根據(jù)需要，采取表格形式展示擬合參數(shù)、結(jié)構(gòu)參數(shù)等。10.3誤差分析主要包含散射強(qiáng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化時(shí)的統(tǒng)計(jì)誤差、數(shù)據(jù)處理過(guò)程中的誤差傳遞等。11檢測(cè)報(bào)告檢測(cè)報(bào)告應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：a)儀器設(shè)備的型號(hào)；b)測(cè)試條件；c)樣品信息；d)所依據(jù)的分析方法文件及其編號(hào)，如標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)及編號(hào)等；e)分析結(jié)果；f)檢測(cè)人員及日期等。6T/SASXXXX—XXXX一種脂膜多層結(jié)構(gòu)模型根據(jù)溶液散射理論，在稀疏溶液體系中可以忽略粒子間的相互作用，那么完成本底校正后的粒子散射強(qiáng)度Iq可近似為其形狀因子Pq，即將散射振幅的平方F(q)2在所有取向上的平均，用公式（A.1）表示：以單層脂質(zhì)體為例，如果忽略脂質(zhì)體整體形貌及尺寸對(duì)散射數(shù)據(jù)的影響，只關(guān)注脂膜結(jié)構(gòu)特征，那么可以在一定的散射矢量范圍內(nèi)，選擇如下脂膜多層結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行結(jié)構(gòu)擬合計(jì)算。圖A.1一種脂膜多層結(jié)構(gòu)模型示意圖在該模型中，平行于膜層的同一平面內(nèi)的電子密度均一，但是在每個(gè)膜層內(nèi)，沿垂直于脂膜平面方向上的電子密度分布函數(shù)為高斯函數(shù)，用公式（A.2）表示：式中：z——沿平面結(jié)構(gòu)的法線(xiàn)方向的坐標(biāo)位置；p(z)——單個(gè)脂質(zhì)體在z坐標(biāo)處電子密度；i——片層結(jié)構(gòu)模型中各膜層所在的層數(shù)；piexp[?(z?εi)2/(2σ)——位于第i層的膜層的電子密度分布；pi——第i層膜層的最大電子密度值；εi——電子密度為pi處的坐標(biāo)位置；σi——第i層膜層的電子密度分布標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)公式（A.2）電子密度分布函數(shù)進(jìn)行傅立葉變換并進(jìn)行取向平均后，得到該結(jié)構(gòu)模型的形狀因子，用公式（A.3）表示：通過(guò)上述計(jì)算模型，擬合實(shí)驗(yàn)測(cè)得的散射數(shù)據(jù)與理論散射曲線(xiàn)，使得兩者盡可能接近。進(jìn)一步地，通過(guò)此優(yōu)化求解后的電子密度分布情況，可以得到脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層及其修飾磷脂層的厚度與分布特征。各膜層厚度的定義可參考現(xiàn)有技術(shù)，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行說(shuō)明并體現(xiàn)在報(bào)告中，如定義膜層的邊界位置為該層電子密度衰減至最大值的10%位置處。7T/SASXXXX—XXXX參考文獻(xiàn)[1]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行），2021年[2]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，脂質(zhì)體藥物質(zhì)量控制技術(shù)研究指導(dǎo)原則，2023年[3]O.Glatter,O.Kratky.SmallangleX-rayscattering.AcademicPress,London,1982.[4]M.H.J.Koch,P.Vachette,D.I.Svergun.Small-anglescattering:aviewontheproperties,structuresandstructuralchangesofbiologicalmacromoleculesinsolution.Q.Rev.Biophys.2003,36,147–227.[5]M.R.Brzustowicz,A.T.Brunger.X-rayscatteringfromunilamellarlipidvesicles.J.Appl.Crystallogr.2005,38,126-131.[6]Y.Schilt,T.Berman,X.Wei,Y.Barenholz,U.Raviv.UsingsolutionX-rayscatteringtodeterminethehigh-resolutionstructureandmorphologyofPEGylatedliposomaldoxorubicinnanodrugs.Biochim.Biophys.Acta.Gen.Subj.2016,1860,108-119.[7]Y.W.Li,