第四部分基因工程GeneEngineering教學(xué)課件教學(xué)案例

第四節(jié)基因工程

GeneEngineering基因工程定義

基因工程：指通過人工方法將目的基因與載體DNA分子連接起來，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，從而使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種嶄新的育種措施.第一節(jié)基因工程概述一、基因工程的發(fā)展歷史（一）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：（二）技術(shù)上的三大發(fā)明：（三）基因工程的誕生（四）基因工程的幾個方面

3、60年代，Nirenbery等科學(xué)家確定了遺傳信息的傳遞方式：DNA—RNA—蛋白質(zhì)的中心法則。（一）理論上的三大發(fā)現(xiàn)1、1944年Avery的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)2、1953年Watson和Crick弄清了生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制：闡明了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理。（三）基因工程的誕生1973年，Cohen等實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。這是基因工程發(fā)展史上第一次實(shí)現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化成功的例子?；蚬こ虖拇苏Q生，這一年被定為基因工程誕生的元年。（四）基因工程的幾個方面1、基因工程技術(shù)的“神奇”所在2、“多利”的克隆3、基因工程技術(shù)與我們

1、基因工程技術(shù)的神奇所在？？而通過基因工程技術(shù)現(xiàn)在只要用10L發(fā)酵液就可獲得同樣的產(chǎn)量。實(shí)例1胰島素的提?。?00000胰臟只能提取3～4克，而用“工程菌”進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，則只要幾升發(fā)酵液就可取得同樣數(shù)量的產(chǎn)品。實(shí)例2

生長激素釋放因子（一種十四肽，能抑制其他激素的釋放和治療糖尿病）：它原來要從羊的腦下垂體中提取，宰50萬頭羊也只能提取5毫克的產(chǎn)品，1962約翰·格登宣布他用一個成年細(xì)胞克隆出一只蝌蚪

1984斯蒂恩·威拉德森用胚胎細(xì)胞克隆出一只羊

1996用成年哺乳動物細(xì)胞克隆出的個體克隆羊Dolly出世2000美國科學(xué)家用無性繁殖技術(shù)成功地克隆出一只猴子2001年美、意科學(xué)家聯(lián)手展開克隆人的工作

1996-2000歐美日俄中國等多國科學(xué)家成功克隆多種動物上世紀(jì)50年代科學(xué)家成功無性繁育出非洲爪蟾2、“多利”的克隆體細(xì)胞克隆技術(shù)－Dolly誕生記取出一個體細(xì)胞生產(chǎn)小羊胚胎體外培養(yǎng)植入母羊（第三只）細(xì)胞核置換取出一個卵細(xì)胞從克隆過程看"多利"克隆羊“多利”沒有父親，但卻有著三個母親三個母親中，后兩個只是形式上的母親

“多利”實(shí)際上是第一個母親的百分之百的“復(fù)制品”

“多利”的這一發(fā)生過程就叫"無性繁殖"

體細(xì)胞克隆成功率低

將434個體細(xì)胞的核移植至434個去核卵中，產(chǎn)生的融合細(xì)胞為277個，成功率為63.8％

將277個移植卵移到輸卵管成功者247個,成功率為89.2％

在輸卵管能夠發(fā)育到胚胎階段者29個，成功率為11．7％

將29個胚胎移植至13只代理母羊子宮中獲得成功者為1個,妊娠率7.7％

總的成功率為1：434,即用434個含體細(xì)胞核的卵移植入去核卵內(nèi),經(jīng)過種種階段,最后只產(chǎn)生出一只克隆羊。

在一定條件下，已經(jīng)分化過程的體細(xì)胞仍然是具有全能性的結(jié)論禁止“克隆”人被各國立法并已成聯(lián)合國公約“克隆”羊與“克隆”人之間在技術(shù)上不存在不可逾越的障礙3、基因工程技術(shù)與我們

第二節(jié)基因工程原理一、基因工程工具酶二、核酸的提取操作和檢測技術(shù)三、基因工程操作步驟

一、基因工程工具酶

——限制性內(nèi)切酶2、命名和分類命名是根據(jù)分離出此酶的微生物學(xué)名而定的。即取微生物屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成三個斜體字母加以表示。如：EcoRI中的E表示大腸桿菌屬名第一個字母，co表示種名頭兩個字母，R表示株名，I表示該菌中第一個被分離出的酶。1、定義：是指能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點(diǎn)或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。3、限制性內(nèi)切酶的基本特性（1）形成粘性末端（cohesiveend/stickyend)（2）形成平末端(bluntend)常用限制酶的種類及切割方式切點(diǎn)出現(xiàn)的頻率及片斷大小部分消化和完全消化DNA限制酶分析其它工具酶連接酶T4DNALigase1967修補(bǔ)工具酶DNA聚合酶I大片斷Klenow1971末端加工酶S1核酸酶，堿性磷酸單脂酶末端轉(zhuǎn)移酶人工加polyA或polyT尾反轉(zhuǎn)錄酶二、核酸的提取操作和檢測技術(shù)1、質(zhì)粒DNA的提取2、電泳和DNA紫外檢測

M123Kb.

23.19.46.54.3

2.32.0

圖6質(zhì)粒酶切及去磷

MλHindⅢmarkers1pUC182,3pUC18酶切二、基因工程的基本操作步驟1、目的基因的取得2、載體的選擇3、目的基因與載體DNA的體外重組4、重組載體引入受體細(xì)胞5、表達(dá)篩選基因工程的操作步驟示意圖1、目的基因的取得1）從適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞的DNA中分離。2）通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA合成cDNA。3）由化學(xué)方法合成特定功能的基因。

M123

Kb.

23.1

9.46.5

4.3

2.32.0

圖3不同酶切時間電泳圖

MλHindⅢmarkers1酶切10分鐘2酶切20分鐘3酶切5分鐘

回收2-7KbDNA2、載體的選擇I1）是一個有自我復(fù)制能力的復(fù)制子（replicon)2)能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，即有較高的復(fù)制率。3）載體上最好只有一個限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上。4）載體上必須有一種選擇遺傳標(biāo)記，以便及時將“工程菌”選擇出來。載體的種類：1、質(zhì)粒載體2、入噬菌體載體3、柯斯質(zhì)粒載體4、M13噬菌體載體5、真核細(xì)胞的克隆載體：酶母質(zhì)粒載體、病毒載體6、人工染色體3、目的基因與載體DNA的體外重組

限制性內(nèi)切酶的處理和人為在DNA的3’末端加上polyA或polyT，兩個DNA產(chǎn)生互補(bǔ)粘性末端，“退火”處理，雙鏈重新形成，在外界連接酶的作用下形成一個完全有復(fù)制能力的環(huán)狀重組載體。4、重組載體引入受體細(xì)胞

重組載體引入受體細(xì)胞，使基因擴(kuò)增和表達(dá)出供體基因所提供的部分遺傳性狀。5、表達(dá)篩選1、抗生素平板法2、插入失活法3、插入表達(dá)法4、B-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法1、抗生素平板法2、插入失活法

無乳糖存在時3、插入表達(dá)法4、B-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法培養(yǎng)基中含X-gal和IPTGX-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚B-D-半乳糖苷IPTG：異丙醇B-D-硫代半乳糖苷B-半乳糖苷酶可以把培養(yǎng)基中無色的X-gal分解成半乳糖和呈藍(lán)色的5-溴-4-氯-靛藍(lán)，使菌落成藍(lán)色二、基因工程的應(yīng)用一、基因工程藥物：胰島素二、轉(zhuǎn)基因植物：轉(zhuǎn)基因棉花三、轉(zhuǎn)基因動物：轉(zhuǎn)基因豬、魚等四、基因治療：向靶細(xì)胞中引入具有正常功能的基因?；蛑委熇缭?971年，有人對人類半乳糖血癥遺傳病患者的成纖維細(xì)胞進(jìn)行過離體培養(yǎng)，然后將E.coli的DNA作為供體基因，并通過病毒作載體進(jìn)行轉(zhuǎn)移，結(jié)果使這一細(xì)胞的遺傳病得到