血清γ-球蛋白的分離、純化(實(shí)驗(yàn)六)培訓(xùn)課件

血清γ－球蛋白的分離、純化

實(shí)驗(yàn)原理1.了解并初步掌握鹽析法分離、純化蛋白質(zhì)的原理。2.熟悉鹽析法分離、純化蛋白質(zhì)的方法。

由于血清中各種蛋白質(zhì)所帶電荷多少、顆粒大小及親水程度都不一樣，因此使用某種中性鹽進(jìn)行鹽析時(shí)，所需要的鹽濃度也各不相同。50%飽和度的硫酸銨能使血清中的球蛋白沉淀，而33％飽和度的硫酸銨則使γ-球蛋白沉淀?？筛鶕?jù)所要分離的蛋白質(zhì)，選擇不同飽和度的硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析。

（二）濃縮

一般實(shí)驗(yàn)室常用的是透析袋（半透膜）濃縮。半透膜具有選擇透過性，只允許離子和小分子擴(kuò)散進(jìn)出，生物大分子（蛋白質(zhì)等）不能自由通過半透膜。將待濃縮的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋內(nèi)，用繩子扎緊，然后置于燒杯中。實(shí)驗(yàn)試劑與器材試劑：(1)小牛血清(2)PBS（pH7.2磷酸鹽緩沖生理鹽水）(3)3%BaCl2溶液(4)pH7.2飽和硫酸胺溶液器材：(1)離心管(2)離心機(jī)(3)移液管(4)透析袋

實(shí)驗(yàn)步驟（一）鹽析——中性鹽沉淀離心管加入血清2ml+2mlPBS

搖勻逐滴加入pH7.2飽和硫酸胺溶液7ml邊加邊搖靜置10min離心（3000轉(zhuǎn)/分）10min棄上清液沉淀+1.0mlPBS使之溶解逐滴加飽和硫酸胺1.5ml搖勻靜置10min離心（3000轉(zhuǎn)/分）10min棄上清液沉淀（γ－球蛋白）（二）濃縮將上述收集的蛋白質(zhì)+1mlPBS，沉淀完全溶解后，放入透析袋內(nèi)，用繩子扎緊，然后置于100ml燒杯中，加入純凈水。3~5min后，取1ml燒杯中溶液至試管中，再滴加BaCl2若出現(xiàn)白色混濁，將燒杯中的水倒掉，再換上純凈水。直至滴加BaCl2溶液不再出現(xiàn)白色混濁為止。

注意事項(xiàng)1.在鹽析時(shí)，飽和硫酸銨應(yīng)逐滴加入，速度不能過快，一定要邊滴加邊攪拌，以減少局部高濃度硫酸銨所引起的共沉現(xiàn)象，攪拌速度不宜過快，以免產(chǎn)生過多泡沫，致使蛋白質(zhì)變性。2.硫酸銨濃度越高越容易沉淀。但濃度過高容易引起其他雜蛋白的共沉作用，因此必須根據(jù)分離蛋白的濃度要求，控制適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度。3.離心時(shí)應(yīng)平衡放置離心管。

4.濃縮時(shí)，滴加BaCl2前，先取出透析袋再滴加。5.更換蒸餾水的目的，是為了增大半透膜兩邊的濃度差。思考題1.為何硫酸胺能沉淀蛋白質(zhì)?第一次鹽析時(shí)硫酸胺的飽和度是多少?沉淀的是何種蛋白質(zhì)，使沉淀溶解再次鹽析