生理學(xué)實驗：第一章 化學(xué)毒物的一般毒性作用

第一章化學(xué)毒物的一般毒性作用

（CommonToxicityofChemicalPoison)

急性毒性蓄積毒性亞慢性和慢性毒性局部毒性主要內(nèi)容

第一節(jié)急性毒性作用

（acutetoxicity)急性毒性和急性毒性試驗的目的急性毒性試驗急性毒性分級一、急性毒性概念

急性毒性(acutetoxicity)是指機體(人或試驗動物)一次接觸或24小時內(nèi)多次接觸化學(xué)物后在短期(最長到14天)內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。但須指出化學(xué)物使實驗動物發(fā)生中毒效應(yīng)的快慢和劇烈的程度，可因所接觸的化學(xué)物的質(zhì)與量不同而異有的化學(xué)物在實驗動物接觸致死劑量的幾分鐘之內(nèi)，就可發(fā)生中毒癥狀，甚至死亡而有的化學(xué)物則在幾天后才顯現(xiàn)中毒癥狀和死亡，即遲發(fā)死亡二、急性毒性試驗的目的①測試和求出化學(xué)毒物對一種或幾種試驗動物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性參數(shù)，了解急性毒作用強度。②通過觀察動物中毒表現(xiàn)和死亡的情況，了解急性毒作用性質(zhì)、可能的靶器官和致死原因，提供化學(xué)毒物的急性中毒資料、初步評價對人和動物產(chǎn)生損害的危險性。③探求化學(xué)毒物急性毒性的劑量—反應(yīng)關(guān)系與中毒特征；④為亞慢性、慢性毒性作用試驗的染毒劑量設(shè)計提供參考依據(jù)；⑤研究化學(xué)毒物急性中毒的預(yù)防和急救治療措施；⑥為毒理學(xué)機制研究提供線索

。LD50/LC50Zac

（LD50/Limac）劑量-反應(yīng)曲線斜率三、急性毒性試驗常用的毒性參數(shù)四、急性毒性試驗方法的要點

(一)實驗動物選擇

（1）選擇實驗動物的原則：

要求在其接觸化學(xué)物之后的毒性反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)與人接觸該化合物的毒性反應(yīng)基本一致試驗動物操作方便，易于飼養(yǎng)，價格較低，易于獲得應(yīng)選用兩種以上試驗動物，常用大白鼠和小白鼠實驗動物的選擇研究內(nèi)容實驗動物急性毒性免疫毒性放射病吸入性粉塵藥物對皮膚局部作用實質(zhì)性臟器的毒作用遲發(fā)性神經(jīng)毒慢性毒性致畸性致突變性、致癌性大、小鼠大、小鼠、最常用C57BL/6狗、大、小鼠，不宜用兔大鼠兔、豚鼠小鼠來亨雞大鼠、狗大、小鼠、兔大、小鼠動物種類成年體重選擇范圍（g)生活年限時間（月）體重（g)急性試驗慢性試驗小鼠1.5～221518～2510～15大鼠2～2.53150150～25050～100豚鼠6～83250200～250150～200兔4～93～415001500～20001200～1500貓10～123～415001500～25001000～1500狗15～203～4100008000～150004000～8000實驗動物的生活年限及體重選擇性別選擇

急性毒性試驗所用的動物應(yīng)當(dāng)是雌、雄各半；

如果在研究中發(fā)現(xiàn)待測化學(xué)物對雌、雄動物的毒性大小有明顯差異時，應(yīng)分別求出雌性與雄性動物各自的LD50值；如果試驗是為致畸試驗作劑量準備，也可僅做雌性動物的LD50試驗。在利用不同的方法測定化學(xué)物L(fēng)D50時，實驗設(shè)計中

對動物數(shù)的要求不同

如用霍恩氏法測LD50時要求有4個劑量組，每

組4或5只動物。

(2)實驗動物分組和數(shù)量

概率單位法、寇氏法測定則要求5～7個劑量組，每組10只動物或10只以上；

對于不同的化學(xué)物測定應(yīng)根據(jù)其相應(yīng)的試驗規(guī)程確定實驗動物數(shù)量。動物分組：均衡性和隨機性均衡性：要求各組動物的平均體重及體重的離散度盡可能一致。具體來說是（1）實驗動物的體重不應(yīng)超過全體實驗動物平均體重的20％---控制離散度（2）每組之間的平均體重相差不應(yīng)超過

10％---控制均衡性隨機性：每只動物分散到各組去的機會是均等的，以避免成見或系統(tǒng)誤差

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，選擇健康的動物（3）實驗動物的預(yù)檢：（4）禁食凡經(jīng)口染毒時，要求試驗前要對動物禁食，以保證胃內(nèi)無食物，減少食物對化學(xué)物毒性的干擾；

禁食時間:

大鼠、小鼠：隔夜進食；染毒后禁食4h；大動物：每日上午喂食前染毒，染毒后繼續(xù)禁食2-4h，但在禁食時要保障飲水恒定的溫度：22±3℃濕度：30~70%照度：晝夜各半飼料合格、飲水合格、墊料合格

（5）試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境

(二)受試物及處理受試物的接受、分樣、保管、稱重、配制以及在此過程中嚴格的質(zhì)量保證影響急性毒性試驗。

受試物劑型：水溶液、混懸液、油溶液1.經(jīng)口(胃腸道)染毒：

（1）灌胃：空腹灌胃后2-3h復(fù)食灌胃的體積不超過體重的1-2％

小鼠為0.2

1.0ml/只或0.1

0.5ml/10g較合適；

大鼠為5ml/只(通常用0.5

1.0ml/100g；

家兔為10ml/2kg體重，狗不超過50ml/10kg。

(三)染毒方法2.經(jīng)呼吸道接觸

在常溫、常壓下為氣態(tài)，或在生產(chǎn)過程中和生活過程中以蒸氣、氣溶膠、煙、粉塵狀態(tài)污染生產(chǎn)與生活環(huán)境空氣，此時就有可能經(jīng)呼吸道吸入。吸入接觸分為兩種方式靜式吸入動式吸入3.經(jīng)皮膚染毒

研究外源化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收應(yīng)當(dāng)盡量選擇皮膚解剖、生理與人類較近似的動物為對象，目前多選用家兔和豚鼠。但由于研究化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收的毒性(求經(jīng)皮LD50)所需的實驗動物較多，使用家兔、豚鼠不夠經(jīng)濟，也常用大鼠代替。4.經(jīng)注射染毒常用實驗動物給予受試物的體積(ml)注射方式小鼠大鼠豚鼠兔狗腹腔0.2～1.01～32～55～105～15肌肉0.1～0.20.2～0.50.2～0.50.5～12～5靜脈0.2～0.51～21～53～105～15皮下0.1～0.50.5～10.5～21～33～10

(四)劑量選擇首先了解分析受試化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其理化性質(zhì)，依此查閱文獻，找出與受試化學(xué)物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué)物的毒性資料，并以其LD50(LC50)值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值。但應(yīng)注意：1.一定是相同動物種系和相同接觸途徑；

2.以此預(yù)期毒性中值為待測化學(xué)物的中間

劑量組，再上下各推一到兩個劑量組做

預(yù)試驗；

3.每個劑量組間的組距可以大些，有利于

找出受試化學(xué)物的致死劑量范圍。外源化學(xué)物L(fēng)D50時設(shè)置幾個劑量組較為合適，應(yīng)依預(yù)試驗結(jié)果而定；一般設(shè)置5

7個劑量組即可，它即符合統(tǒng)計計算要求又可節(jié)省人力和財力。每個劑量組的動物數(shù)，小鼠不少于10只、大鼠6

8只、家兔4

6只。（五）毒性作用觀察1.中毒體癥和發(fā)生過程觀察

很多化學(xué)物在實驗動物接觸的初期往往先出現(xiàn)興奮現(xiàn)象，有的化學(xué)物在動物接觸的初期首先表現(xiàn)為抑制現(xiàn)象。2.死亡情況和時間分布：計算LD503.體重：

在觀察期間應(yīng)注意觀察其體重變化。這有助于了解受試化學(xué)物所致的中毒效應(yīng)是短暫的或較長期的效應(yīng)。4.病理檢查和其它指標觀察

應(yīng)當(dāng)重視病理組織學(xué)檢查。凡中毒死亡動物應(yīng)及時解剖做病理學(xué)檢查，檢查器官有無充血、出血、水腫或其它改變，并對有變化的臟器作病理組織學(xué)檢查。對存活動物于觀察期結(jié)束后應(yīng)做病理學(xué)檢查

(六)觀察時間和周期

測定外源化學(xué)物的LD50(LC50)，一般要求計算實驗動物接觸化學(xué)物之后兩周內(nèi)的總死亡數(shù)。

對于一些速死性化學(xué)物求其LD50(LC50)也可僅計算24小時的死亡率。有些速殺性化學(xué)物的24小時LD50與兩周LD50值往往沒有差別。但應(yīng)注明是多少時間的LD50值，以便于在進行毒性比較時有共同的基礎(chǔ)。改良寇氏法計算LD501.預(yù)試找出死亡率在0～100％的劑量范圍；2.相鄰兩組劑量的公比：r＝1.2或1.53.計算LD50：lgLD50＝Xm－d（∑P-0.5）

Xm:最大劑量的對數(shù)，

d：相鄰劑量比值的對數(shù)

∑P：各組的死亡率之和4.求lgLD50的標準誤（S）：

SlgLD50＝d·（∑pq/n）1/2

d：劑量比值的對數(shù)

p：死亡率

q：存活率

n：動物組數(shù)5.求LD50的95％可信限：＝lg－1（lgLD50±1.96·SlgLD50

）若試驗結(jié)果最高死亡率在80％－100％之間，最低死亡率在20~0％之間，可用下式校正：

lgLD50＝Xm－d·[∑p－（3-pm-pn）/4]pm:最高死亡率

pn:最低死亡率五、急性毒性分級和評價不論我國或國際上的急性毒性分級標準均還存在不少缺點，因為它們主要是根據(jù)經(jīng)驗確定，客觀性還不足；目前還沒有全世界公認、統(tǒng)一的毒性分級標準。外源化學(xué)物的急性毒性分級（WHO)急性分級大鼠經(jīng)口LD50（mg/kg)6只大鼠吸入4h，死亡2～4只濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50（mg/kg)對人可能致死的估計量g/kgg/60kg劇毒＜1＜10＜5＜0.050.1高毒1～10～5～0.05～3中等毒50～100～44～0.5～30低毒500～1000～350～5～250微毒5000～10000～2180～＞15＞1000外源化學(xué)物的急性毒性分級標準急性分級大鼠經(jīng)口LD50（mg/kg)大約相當(dāng)體重70kg人的致死劑量6級（極毒）＜1稍嘗，＜7滴5級（劇毒）1～507滴～1茶匙4級（中等毒）51～5001茶匙～35g3級（低毒）501～500035～350g2級（實際無毒）5001～15000350～1050g1級（無毒）＞15000＞1050g急性分級小鼠一次經(jīng)口LD50（mg/kg)小鼠吸入2hLD50（mg/kg)

兔經(jīng)皮LD50（mg/kg)劇毒＜10＜50＜10高毒11～10051～50011～50中等毒101～1000501～500051～500低毒1001～100005001～50000501～5000微毒＞10000＞50000＞5000工業(yè)毒物急性毒性分級第二節(jié)蓄積毒性作用

蓄積作用（accumulation)：當(dāng)化學(xué)物與機體發(fā)生亞慢性接觸，將反復(fù)進入機體，而且當(dāng)進入的速度或總量超過代謝轉(zhuǎn)化與排出的速度或總量時，化學(xué)物就有可能在機體內(nèi)逐漸增加并貯留的現(xiàn)象。一、基本概念蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)；一種外源化學(xué)物有無蓄積作用是評定該化學(xué)物是否可能引起潛在慢性中毒的論據(jù)之一，也是制定衛(wèi)生限量標準時安全系數(shù)的一種依據(jù)。物質(zhì)蓄積（materialaccumulation)

實驗動物反復(fù)多次接觸化學(xué)物后，用化學(xué)分析方法能夠測得機體內(nèi)存在該化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物。功能(機能)蓄積（functionalaccumulation)

有的化學(xué)物在長期接觸后，機體內(nèi)雖不能測出其原型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。

功能蓄積可能是由于貯存體內(nèi)的化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，不能檢出物質(zhì)的蓄積或者是由于每次機體接觸化學(xué)物之后所引起的損害累積所致。二、蓄積作用的研究方法

1.求出外源化學(xué)物的蓄積系數(shù)，了解蓄積毒性大小；2.為慢性毒性試驗及其他有關(guān)毒性試驗的劑量選擇提供參考。蓄積毒性試驗?zāi)康男罘e作用的檢測有兩類方法理化方法：應(yīng)用化學(xué)分析或其他技術(shù)測定化學(xué)物進入機體以后，在體內(nèi)含量變化的過程。該方法可確定化學(xué)物的半減期，故可作為檢測物質(zhì)蓄積的方法。生物學(xué)方法：即將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)進行比較，故所測出的蓄積性不能區(qū)分功能蓄積和物質(zhì)蓄積。

(一)蓄積系數(shù)法

原理：在一定期限之內(nèi)以低于致死劑量(小于LD50劑量)，每日給予實驗動物，直至出現(xiàn)預(yù)計的毒性效應(yīng)(或死亡)為止，計算達到預(yù)計效應(yīng)的總累積劑量，求出此累積劑量與一次接觸該化學(xué)物產(chǎn)生相同效應(yīng)的劑量的比值，此比值即為蓄積系數(shù)(K值):K=ED50(n）/ED50(1)

毒理學(xué)實際工作中，蓄積作用試驗多用小鼠或大鼠為實驗動物，一般以死亡為指標，其K值計算公式如下：

K=LD50(n）/LD50(1)

LD50(n)表示引起一半動物死亡的累積總劑LD50(1)表示引起一半動物死亡的一次劑量。意義：K值越小，表示化學(xué)物的蓄積毒性越大1.固定劑量法：先測出1次染毒的LD50（1)，然后每天給予1/10(1/20)LD50直到半數(shù)動物死亡為止，此時總劑量即為LD50（n)蓄積系數(shù)法由于分次染毒的設(shè)計不同，分為：2.劑量遞增法：實驗開始時，按0.1LD50×

4天，0.15LD50×

4天，0.22LD50×

4天，0.34LD50×

4天，依次類推，最長28天，試驗期間，當(dāng)化學(xué)物引起動物累計死亡一半時間即可終止，計算K值。3.劑量固定的20天蓄積法：實驗分為5組，包括陰性對照組和1/20LD50，1/10LD50，1/5LD50，1/2LD50，每組動物數(shù)10只，雌雄各半，每日染毒1次，連續(xù)20天，觀察每組動物死亡數(shù)。

劑量固定20天蓄積試驗評價標準各劑量組均無死亡，蓄積性不明顯1/2LD50劑量組死亡，其他組無死亡，則弱蓄積性1/20LD50劑量組無死亡，其他各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為中等蓄積性1/20LD50劑量組有死亡，各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為強蓄積性(二)生物半減期法

生物半減期法是用毒物動力學(xué)原理闡明外來化學(xué)物在機體內(nèi)的蓄積作用特征。第三節(jié)亞慢性和慢性毒性作用(一)概念亞慢性毒性：是指實驗動物或人連續(xù)較長期接觸外源化合物所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。一、亞慢性毒性作用subchronictoxicity)（二）、亞慢性毒性試驗的目的1.研究受試物亞慢性毒性劑量一反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL）和未觀察到有害作用的劑量（NOAEL），初步提出此受試物的安全限量參考數(shù)值。2.確定受試物亞慢性毒性的效應(yīng)譜，毒作用特點和靶器官。3.研究受試物亞慢性毒性損害的可逆性。4.為慢性毒性試驗的劑量設(shè)計及觀察指標選擇提供依據(jù)。5.為在其他試驗中發(fā)現(xiàn)的或未發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，比較不同動物物種毒效應(yīng)的差異，為受試物毒作用機制研究和將研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。（三）亞慢性毒性試驗方法的要點

1、實驗動物的選擇亞慢性毒性作用研究一般要求選拔兩種實驗動物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類，如大鼠和狗，以便全面了解受試物的毒性特征。

由于亞慢性毒性試驗期較長，所以選擇被動物的體重(年齡)應(yīng)較小，如小鼠應(yīng)為15g左右，大鼠100g左右。2、染毒途徑亞慢性毒性試驗接觸外來化合物途徑的選擇，應(yīng)考慮兩點：

1.盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該化合物的途徑或方式；

2.應(yīng)與預(yù)期進行慢性毒性試驗的接觸途徑相一致；

具體接觸途徑主要有經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種。

亞慢性試驗的上限劑量，需控制在實驗動物接觸受試化合物的整個過程中，不發(fā)生死亡或僅有個別動物死亡，但有明顯的中毒效應(yīng)，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。此劑量的確定可參考兩個數(shù)值，一是以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗的最高劑量；一是以此化合物L(fēng)D50的1/20

1/5為最高劑量。3.劑量選擇與分組4.觀察指標

(1)一般性指標外觀體征、行為活動：動物體重：體重變化的表示方式，可將接觸組與對照組同期體重絕對增長的重量或體重百分增長率(以接觸化合物開始時動物體重為100%)進行統(tǒng)計和比較食物利用率亞慢性試驗期間必須注意觀察并記錄動物的飲食情況，在此基礎(chǔ)上計算食物利用率，即動物每食入100g飼料所增長的體重克數(shù)。分析比較接觸組與對照組食物利用率，有助于分析受試化合物對實驗動物的生物學(xué)效應(yīng)。癥狀實驗動物在接觸外來化合物過程中所出現(xiàn)的中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時間均應(yīng)記錄和分析。（2）實驗室檢查：主要指血象和肝、腎功能的檢測，在亞慢性試驗中研究外來化合物對實驗動物的毒性作用，使用這類指標，一般為篩檢性和探討性。通常血象檢測包括紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)和分類、血紅蛋白定量等。肝、腎功能也是一種常規(guī)指標，如SGOT、SGPT、血清尿素氮、尿蛋白定性或定量、尿沉渣鏡檢等。(3)系統(tǒng)尸檢和病理學(xué)檢查

亞慢毒性試驗中應(yīng)重視病理學(xué)檢查。凡是在染毒過程中死亡的動物均應(yīng)及時解剖，肉眼檢查后再進行病理組織學(xué)檢查。必要時作組織化學(xué)或電鏡鏡檢。

1）臟器系數(shù)(稱臟/體比值)：是指某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常以100g體重計。如肝/體比即(全肝濕重/體重)

100

此指標的意義是實驗動物在不同年齡期，其各臟器與體重之間重量比值有一定規(guī)律；若受試化學(xué)物使某個臟器受到損害，則此比值就會發(fā)生改變，可以增大或縮小。因此，臟/體比值是一個靈敏、有效和經(jīng)濟的指標2）病理學(xué)檢查：

制作病理切片，借助顯微鏡觀察病理變化二、慢性毒性作用（chronictoxicity)慢性毒性：是指實驗動物或人長期（甚至終生）反復(fù)接觸外源化學(xué)物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)慢性毒性試驗的試驗期限，應(yīng)依受試物的具體要求和實驗動物的物種而定如用大鼠試驗期限可為1年，用狗則試驗期限可1～2年慢性毒性試驗應(yīng)終生接觸受試物如果慢性毒性試驗與致癌試驗結(jié)合進行，則實驗動物染毒時間最好接近或等于動物的預(yù)期壽命(一）慢性毒性試驗的目的1.研究受試物慢性毒性的劑量一反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，確定其慢性毒性參數(shù)的下限，即觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL）和未觀察到有害作用的劑量（NOAEL），為對該受試物的危險性評價和制定安全限量提供依據(jù)。2.研究受試物的慢性毒性效應(yīng)譜，確定慢性毒作用的靶器官。

3.如果試驗期限不是終生染毒，則還應(yīng)觀察受試物毒性損害的可逆性。

4.為毒性機制研究和將毒性結(jié)果外推到人提供依據(jù)。（二）慢性毒性試驗方法要點

1、實驗動物的選擇慢性毒性試驗選擇實驗動物的條件與亞慢性毒性試驗相同。但實驗動物最好為純系甚至同窩動物均勻分布于各劑量組。實驗動物年齡應(yīng)較小，大鼠和小鼠應(yīng)為初斷奶者，即小鼠出生后3周，體重10

12g；大鼠出生后3

4周，體重50

70g。性別要雌雄各半2.慢性毒性試驗期限