PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物平端連接法實(shí)驗(yàn)詳述

第第頁(yè)P(yáng)CR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物平端連接法實(shí)驗(yàn)詳述實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)步驟：一、PCR反應(yīng)1.依次混勻下列試劑（1）H二、電泳取10l擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長(zhǎng)度。三、PCR產(chǎn)物的純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。1.酚/lv仿法（1）取反應(yīng)產(chǎn)物加100lTE。（2）加等體積lv仿混勻后用微型離心機(jī)10000rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次，可除去覆蓋在表面的礦物油。（3）再用酚:lv仿:抽提二次，每次回收上層水相。（4）在水相中加300l95％乙醇，置-20℃下30min沉淀。（5）在小離心機(jī)上10000rpm離心10min，吸凈上清液。加入1ml70％乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復(fù)洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7mlddH2.WizardPCRDNA純化系統(tǒng)WizardPCRDNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴(kuò)增液中的DNA，提純后的DNA可用于測(cè)序、標(biāo)記、克隆等。該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化，試劑包括：50mlWizardPCRDNA純化樹(shù)脂、5ml直接提取緩沖液、50支Wizard微型柱。（1）吸取PCR反應(yīng)液水相放于1.5mleppendorf管中。（2）加100ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。（3）加1mlPCRDNA純化樹(shù)脂，1分鐘內(nèi)渦旋混合3次。（4）取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進(jìn)入微型柱。（5）將注射器與微型柱分開(kāi)，取出注塞，再將注射筒與微型柱相連，加入2ml80%異丙醇，對(duì)微型柱進(jìn)行清洗。（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12000g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。（7）將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50lTE或水，靜止1分鐘后，12000g離心20秒。（8）丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。四、載體加dT尾1.將1gpUC19用SmaⅠ全酶切。2.在小管中按上述PCR反應(yīng)，加入各種混合物，除將4l4種dNTP改為4l25mMdTTP。3.加入1l(5U)的TaqDNA聚合酶在72℃下加熱2h。4.按前面三中所述，用酚:lv仿:抽提二次。5.加入2倍體積95％乙醇，在-20℃下沉淀1h。6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10mlddH2O中。五、PCR產(chǎn)物與載體粘末端連接1.在7mlPCR產(chǎn)物中加1ml帶dT尾的pUC質(zhì)粒。2.加1mlT4DNA連接酶，1ml10連接緩中液，混勻，16℃連接過(guò)夜。3.取5ml連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。六、PCR產(chǎn)物3'突出端切平及平末端連接1.在50ml的PCR產(chǎn)物中，直接加0.5mlT4DNA聚合酶混勻。2.37℃反應(yīng)10分鐘后，70℃滅活10分鐘。3.用酚:lv仿抽提2次。4.乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7mlddH注意事項(xiàng)：1.PCR反應(yīng)液可直接用于連接，但最好對(duì)PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，既能去掉dNTP與ATP競(jìng)爭(zhēng)連接酶又能濃縮PCR產(chǎn)物。2.PCR非常靈敏，操作應(yīng)盡可能在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行。3.吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌，每次吸頭用畢應(yīng)更換，不要互相污染試劑。4.加試劑前，應(yīng)短促離心10秒鐘，然后再打開(kāi)管蓋，以防手套污染試劑及管壁上的試劑