2024-2025學(xué)年講義生物（選擇性人教版2019）第3章第2節(jié)實(shí)驗(yàn)突破二DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

一、DNA片段的擴(kuò)增1．實(shí)驗(yàn)原理2．實(shí)驗(yàn)步驟二、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定1．實(shí)驗(yàn)原理2．實(shí)驗(yàn)步驟三、操作提示1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。2．緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。四、關(guān)鍵點(diǎn)撥1．PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，復(fù)性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。復(fù)性溫度過高會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)，復(fù)性溫度過低又會(huì)造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結(jié)合。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，假設(shè)引物的長(zhǎng)度相同，在G、C含量高時(shí)，設(shè)定的復(fù)性溫度要高一些。因?yàn)镈NA分子中G—C之間有三個(gè)氫鍵，A—T之間有兩個(gè)氫鍵。2．未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的主要原因(1)TaqDNA聚合酶失活。(2)引物出現(xiàn)質(zhì)量問題。(3)Mg2＋濃度過低。(4)變性時(shí)的溫度低，變性時(shí)間短。3．出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶的主要原因(1)模板DNA出現(xiàn)污染。(2)引物特異性不強(qiáng)或形成引物二聚體。(3)Mg2＋濃度過高。(4)復(fù)性時(shí)的溫度過低等。例1(2023·云南昆明高二月考)關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列相關(guān)敘述正確的是()A．PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，但在使用時(shí)需根據(jù)擴(kuò)增的DNA片段以及引物的情況人工設(shè)定合適的溫度B．PCR反應(yīng)體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶主要在復(fù)性過程中起作用C．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都必須進(jìn)行高壓滅菌處理D．電泳時(shí)，電泳緩沖液不能沒過凝膠，以免凝膠加樣孔中的電泳樣液流出答案A解析PCR反應(yīng)體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶主要在延伸過程中起作用，B錯(cuò)誤；為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前都必須進(jìn)行高壓滅菌處理，移液器不需要高壓滅菌，C錯(cuò)誤；電泳時(shí)，電泳緩沖液以沒過凝膠1mm為宜，D錯(cuò)誤。例2用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜，其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號(hào)為蒸餾水，PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析，不合理的是()A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250～500bp之間B．3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNAC．9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D．10號(hào)確定反應(yīng)體系等對(duì)結(jié)果沒有干擾答案B解析PCR過程中，可以通過設(shè)計(jì)特定的引物來擴(kuò)增特定的DNA片段，4～9號(hào)是轉(zhuǎn)基因植株，理論上應(yīng)包含目的基因，結(jié)合2號(hào)野生型和10號(hào)蒸餾水組的結(jié)果，推測(cè)包含目的基因的片段大小應(yīng)為250～500bp，A合理；3號(hào)PCR結(jié)果包含250～500bp片段，應(yīng)包含目的基因，B不合理；9號(hào)PCR結(jié)果不包含250～500bp片段，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株，C合理；10號(hào)放入蒸餾水，可排除反應(yīng)體系等對(duì)結(jié)果的干擾，D合理。1．使用PCR儀的正確實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為()①設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序②按配方準(zhǔn)備好各組分③用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分④進(jìn)行PCR反應(yīng)⑤離心使反應(yīng)液集中在離心管的底部A．②⑤③④① B．①⑤③②④C．②③⑤①④ D．④②⑤③①答案C解析PCR反應(yīng)的操作步驟一般為準(zhǔn)備(包括配制試劑及將各試劑放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上)→移液→混合→離心→反應(yīng)。PCR儀是一種能自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，設(shè)置好循環(huán)程序就可以進(jìn)行反應(yīng)。2．下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯(cuò)誤的是()A．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理B．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20℃儲(chǔ)存C．將PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出，需放在高溫環(huán)境中迅速融化D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換答案C解析將PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出，需放在冰塊上緩慢融化，C錯(cuò)誤。3．(2023·重慶渝中區(qū)高二期中)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是()A．增加模板DNA的量 B．延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C．延長(zhǎng)延伸的時(shí)間 D．提高復(fù)性的溫度答案D解析增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少非特異性條帶的產(chǎn)生，A錯(cuò)誤；延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間和延長(zhǎng)延伸的時(shí)間會(huì)影響變性延伸過程，但對(duì)于延伸中的配對(duì)影響不大，故不能有效減少產(chǎn)生非特異性條帶，B、C錯(cuò)誤；非特異性條帶增加的原因可能是復(fù)性溫度過低而造成引物與模板的錯(cuò)配，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。4．下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是()A．電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程B．待測(cè)樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA在電泳中的遷移速率C．進(jìn)行電泳時(shí)，帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)D．PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定答案C解析由于同性相斥、異性相吸，帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)，C錯(cuò)誤。5．為優(yōu)化目的基因(700bp)的PCR條件，研究者設(shè)計(jì)不同的復(fù)性溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖。據(jù)圖分析，下列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是()A．對(duì)照組可用無菌蒸餾水代替模板，其他成分相同B．電泳條帶的寬度、亮度與擴(kuò)增產(chǎn)物大小呈正相關(guān)C．復(fù)性溫度的高低會(huì)影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純度D．58℃是本實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增該基因的最佳復(fù)性溫度答案B解析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循對(duì)照原則與單一變量原則，故對(duì)照組可用無菌蒸餾水代替模板，其他成分相同，A正確；PCR技術(shù)中，反應(yīng)最終的電泳條帶的寬度、亮度與PCR起始狀態(tài)的模板DNA(或者模板)含量呈正相關(guān)，B錯(cuò)誤；據(jù)圖可知，58℃條件下條帶寬度最大，故該溫度是本實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增該基因的最佳復(fù)性溫度，D正確。6．(2023·江蘇揚(yáng)州高二期末)在基因工程操作中，科研人員利用兩種限制酶(R1和R2)處理基因載體，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是()A．電泳時(shí)，核酸的移動(dòng)方向是從負(fù)極到正極的B．該載體最可能為環(huán)狀DNA分子C．限制酶R1與R2的切點(diǎn)最長(zhǎng)相距約600bpD．兩種限制酶在載體上識(shí)別的序列可能相同答案D解析根據(jù)圖示可知，200bp的DNA分子量小，800bp的DNA分子量較大，200bp的DNA移動(dòng)速度快，所以在電泳時(shí)，核酸的移動(dòng)方向是從負(fù)極到正極的，A正確；當(dāng)僅用一種限制酶切割載體時(shí)，僅產(chǎn)生一種長(zhǎng)度的DNA片段，因此該載體最有可能為環(huán)狀DNA分子，B正確；兩種限制酶同時(shí)切