試論牛卵母細(xì)胞體外受精技術(shù)

牛卵母細(xì)胞體外受精是指在脫離母體的情況下，人為創(chuàng)造母牛體內(nèi)繁殖條件，在牛體外完成精卵結(jié)合，培育出受精卵并在體外培養(yǎng)至桑椹胚或是囊胚階段，將胚胎移植到母牛體內(nèi)孕育胎兒。體外受精是繁育犢牛的重要技術(shù)，在牛繁殖領(lǐng)域應(yīng)用普遍，涉及到的技術(shù)有牛卵母細(xì)胞的采集、成熟培養(yǎng)與判斷，牛精子的篩選、獲能，以及具體的受精操作等。針對(duì)技術(shù)應(yīng)用關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及技術(shù)參數(shù)、操作細(xì)節(jié)的分析研究，最終達(dá)到獲取高質(zhì)量胚胎的目的，助力于養(yǎng)牛業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。1牛卵母細(xì)胞體外采集與培養(yǎng)技術(shù)1.1牛卵母細(xì)胞體外采集技術(shù)1.1.1采集方式常用的動(dòng)物卵母細(xì)胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母細(xì)胞，采用超排技術(shù)從動(dòng)物的輸卵管采集，但不適用于牛這種大型動(dòng)物；（2）活體采卵，選擇繁殖性能優(yōu)秀的母牛，借助腹腔鏡直接采集，對(duì)采集母牛的繁殖性能影響較??；（3）從屠宰場(chǎng)獲取，宰殺母牛后直接采集牛卵巢。該采集方式簡(jiǎn)單、直接、成本低，可大批量采集。1.1.2采集技術(shù)在從屠宰場(chǎng)獲取牛卵巢后，將其放入保溫瓶中，瓶中事先裝入用生理鹽水稀釋的硫酸慶大霉素，溫度大約是30℃，用于保持牛卵巢的新鮮度。在1h內(nèi)完成卵泡的收集，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，使用生理鹽水清洗干凈牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，獲取卵泡液，準(zhǔn)備進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。1.2體外成熟培養(yǎng)使用體視顯微鏡篩選質(zhì)量好的卵母細(xì)胞用于體外成熟培養(yǎng)，將篩選出的卵母細(xì)胞放入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含有17-E2的中央記憶型T細(xì)胞1.5μg/mL；胎牛血清10%，促黃體生成素20%；卵泡刺激素20μg/mL。將培養(yǎng)液放入經(jīng)過(guò)溫度校正后的培養(yǎng)箱中，溫度調(diào)整至38～39℃，氣象條件為5%的CO2，培養(yǎng)時(shí)間22～24h，需根據(jù)牛卵母細(xì)胞采集時(shí)的成熟情況，適當(dāng)延長(zhǎng)1～2h，但不可超過(guò)26h，一旦超過(guò)牛卵母細(xì)胞將進(jìn)入老化期。1.3體外成熟判定在培養(yǎng)24h后進(jìn)行牛卵母細(xì)胞的成熟檢查，當(dāng)其進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期則判定為成熟。由于牛卵母細(xì)胞成熟需經(jīng)歷第一次與第二次減數(shù)分裂期，整個(gè)成熟過(guò)程復(fù)雜，成熟判定難度較大。因此一般情況下以生發(fā)泡破裂或是卵丘細(xì)胞擴(kuò)展為判斷標(biāo)準(zhǔn)，以顯微鏡檢查卵丘細(xì)胞擴(kuò)展為例，1級(jí)成熟卵，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展程度超過(guò)裸卵直徑的3倍，2級(jí)則是2倍，3級(jí)為輕度擴(kuò)展，大于3級(jí)的情況下則可判定牛卵細(xì)胞成熟，具備進(jìn)行體外受精的條件。2牛精子體外獲能技術(shù)牛精子體外獲能是提高受精率的重要方式，只有其在母牛的生殖道內(nèi)停留一段時(shí)間，在適宜的溫度、pH值、滲透壓等條件下，牛精子發(fā)生一系列的變化后獲取受精能力。如果直接將精子與牛卵母細(xì)胞結(jié)合，牛精子在未獲能的情況下，受精率非常低。所以在牛卵母細(xì)胞體外受精過(guò)程中，精子體外獲能技術(shù)的應(yīng)用是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在體外環(huán)境下誘導(dǎo)牛精子獲能，進(jìn)一步的培養(yǎng)其受精能力。2.1影響獲能因素精子體外獲能技術(shù)是創(chuàng)造與精子體內(nèi)獲能相似的條件，促進(jìn)牛精子正常的生理與生行反應(yīng)。通過(guò)牛精子體內(nèi)獲能過(guò)程的分析，確定了如下影響牛精子獲能因素：（1）精子來(lái)源，牛精子獲能時(shí)間大約為1h，牛采精部位的不同會(huì)直接影響到牛精子獲能，在精子體外獲能操作過(guò)程中，需重點(diǎn)關(guān)注該影響因素。（2）溫度，牛精子所處獲能環(huán)境細(xì)微的溫差變化對(duì)精子獲能有著一定的影響，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，牛精子體外獲能最佳溫度是38.5～39℃，大部分哺乳動(dòng)物是37～38℃。（3）pH值，最佳pH7.4～8.0，偏高會(huì)減少體外獲能時(shí)間，過(guò)高則會(huì)殺死精子，偏低則增加獲能時(shí)間。（4）滲透壓，滲透壓在295～315mOsm/L的條件下，牛精子體外獲能效果最好。（5）鈣離子載體，其對(duì)牛精子頂體反應(yīng)有著積極作用，有助于糖酵解，為精子運(yùn)動(dòng)提供充足的能量。鈣離子載體與鈣離子形成復(fù)合物，進(jìn)入精子促進(jìn)其頂體反應(yīng)。但如果鈣離子載體濃度過(guò)高，作用過(guò)于強(qiáng)烈，作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起精子死亡。（6）氨基多糖，氨基多糖有利于鈣吸收，促進(jìn)牛精子發(fā)生頂體反應(yīng)。但氨基多糖的類型不同，影響著牛精子的獲能水平。比如在牛精子液體中添加肝素10～50μg/mL，處理10～50min，誘導(dǎo)牛精子體外獲能效果良好。（7）高離子強(qiáng)度液，使用滲透壓為380mOsm/L的高離子強(qiáng)度液氯化鈉處理牛精子，置換精子表面的抗原物質(zhì)，刺激牛精子的頂體反應(yīng)。（8）咖啡因，具有抑制環(huán)腺苷酸二酯酶的作用，提升精子活力，與鈣離子載體、肝素等聯(lián)合運(yùn)用，可增加牛精子獲能的水平。（9）血清白蛋白，其為大分子物質(zhì)，在處理牛精子過(guò)程中，與精子膜中的膽固醇結(jié)合，減少了精子脂肪，釋放精子活力，提高牛精子的受精率。2.2精子篩選方法未經(jīng)處理的牛精液中含有一些有害物質(zhì)，采用精子預(yù)處理方法去除其中的精清、死精子、弱精子等，篩選出適合體外受精的精子，以改善精子獲能。比較常用的處理方法有精子上浮法、Percoll密度梯度分離法、離心洗滌法等。精子上浮法預(yù)處理較為簡(jiǎn)單，解凍精子后放入TALP培養(yǎng)液中，靜置大約1h，提取上浮的精子。Percoll密度梯度分離法，借助Percoll大分子硅膠顆粒離心處理，平衡分離精子，使不同密度的精子分布在不同密度的梯度中。離心洗滌法適用于冷凍精液，主要是去除冷凍保護(hù)劑與精漿蛋白，但在洗滌過(guò)程中容易損傷精子。2.3獲能操作方法牛精子體外獲能選用BO液，在其中添加25μg/mL肝素鈉，6μg/mL牛血清白蛋白，培養(yǎng)液pH值調(diào)整至7.6。采用精子上浮法篩選出優(yōu)質(zhì)精子70μL，制作成精子懸浮液。在培養(yǎng)皿上制作3個(gè)100μL的受精液微滴，每個(gè)微滴上滴入3μL的精子懸浮液，然后放入CO2濃度為5%，38℃的培養(yǎng)箱中，牛精子持續(xù)獲能60min。2.4檢測(cè)精子質(zhì)量在牛精子獲能操作過(guò)程中，使用顯微鏡檢測(cè)牛精子獲能情況。一方面是精子獲能時(shí)檢測(cè)，在顯微鏡下可觀察到精子非?；钴S，尾部活動(dòng)明顯；另一方面是精子獲能后檢測(cè)，精子在獲能后，頭部曲線運(yùn)動(dòng)，尾部鞭打有力，幅度加大，表現(xiàn)為超激活運(yùn)動(dòng)。3牛卵母細(xì)胞體外受精技術(shù)3.1體外受精原理體外受精是成熟牛卵母細(xì)胞與獲能牛精子的結(jié)合過(guò)程，促使牛精子順利進(jìn)入牛卵母細(xì)胞，最終形成胚胎。受精的基本原理是人為創(chuàng)造牛體內(nèi)受精條件，經(jīng)過(guò)對(duì)精子的離心洗滌、上浮處理后，獲取高質(zhì)量精子，獲能后與成熟卵母細(xì)胞共同放入受精液中，促進(jìn)精卵相遇，完成原核發(fā)育。3.2精卵比例把控牛卵母細(xì)胞體外受精采用微滴（包含10～15個(gè)卵母細(xì)胞），微滴大小在50～200μL，精子濃度為0.64～1.0×106個(gè)/mL。在牛正常體內(nèi)受精的情況下，精卵的比例一般是1～15:1，在體外授精的情況下，通過(guò)精卵比例的換算，確定精卵比例在10000～20000:1，所以采用了上述的卵母細(xì)胞個(gè)數(shù)與精子濃度。如果精子濃度過(guò)低，直接降低受精率，過(guò)高則會(huì)提升多精受精的概率，降低囊胚發(fā)育的質(zhì)量。3.3精卵作用時(shí)間控制體外受精選用的受精液不同，精卵作用的時(shí)間會(huì)有較大的差異，比如在BO液中大約是7h左右，在TALP液中大約是19h，少于16h會(huì)降低受精的質(zhì)量。在體外受精研究中，有的人使用TALP作為受精液，精卵作用5h后，提取出卵母細(xì)胞，然后放入早期培養(yǎng)液中，以此避免水解酶對(duì)受精卵的損傷，并且精卵共同孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)增加多精子受精量。所以在使用TALP受精液時(shí)，孵育時(shí)間不可少于18h，但不可超過(guò)24h。3.4體外受精操作方法首先取出培養(yǎng)成熟的牛卵母細(xì)胞，放入受精液中洗滌4次；其次平衡處理獲能牛精子，制作成懸浮液微滴，精子濃度為0.8×106個(gè)/mL，接著在每個(gè)微滴上添加100μL卵母細(xì)胞液，保證每個(gè)精子微滴上有10～15個(gè)卵母細(xì)胞；再次，將放有精卵微滴的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中CO2濃度為5%，濕度為100%，溫度為38℃，如果是BO受精液培養(yǎng)時(shí)間6～8h，TALP受精液培養(yǎng)時(shí)間20～24h。培養(yǎng)過(guò)程中使用顯微鏡觀察受精卵的卵裂情況。在體外授精中需注意把握好精卵相遇的時(shí)間，最好是精子發(fā)生頂體反應(yīng)時(shí)與卵子相遇，以確保精子順利進(jìn)入牛卵母細(xì)胞。牛卵母細(xì)胞體外受精還可直接采用顯微鏡進(jìn)行操作，在顯微鏡下將精子注入牛卵母細(xì)胞中，直接完成受精，在精子數(shù)量有限的情況下適合采用該方法。3.5受精檢測(cè)與判斷卵裂是判斷牛卵母細(xì)胞體外受精是否成功的依據(jù)，牛卵母細(xì)胞在沒(méi)有受精的情況下，卵母細(xì)胞的周隙很小，在受精后周隙增加，但有的老化卵也會(huì)出現(xiàn)該現(xiàn)象，需要繼續(xù)培養(yǎng)，觀察囊胚的發(fā)育情況。牛卵母細(xì)胞體外受精受到人為操作、培養(yǎng)環(huán)境與條件的影響，出現(xiàn)異常受精現(xiàn)象，常見(jiàn)的有多精受精、胚胎染色體異常等，應(yīng)在受精階段做好受精檢測(cè)與判斷，及時(shí)發(fā)現(xiàn)受精異常問(wèn)題，以提高受精成功的概率。3.6體外受精注意事項(xiàng)3.6.1注意解決多精受精問(wèn)題在牛卵母細(xì)胞成熟判定中，主要的依據(jù)是原核發(fā)育情況，但原核成熟不是牛卵母細(xì)胞成熟判定的唯一標(biāo)準(zhǔn)，還需判斷細(xì)胞質(zhì)、透明帶等的成熟情況，以此方可保證精卵之間的正常作用和變化，形成對(duì)多精的防御，避免多個(gè)精子在牛卵母細(xì)胞中生理變化。在體外受精過(guò)程中，可適當(dāng)增加牛卵母細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間，確保完全成熟，或嚴(yán)格控制受精時(shí)精子的密度，以及進(jìn)行受精液中影響精子活力物質(zhì)的調(diào)整，以降低多精受精的發(fā)生概率。3.6.2避免胚胎發(fā)育阻滯的發(fā)生胚胎發(fā)育阻滯是體外受精面臨的難點(diǎn)，一般好發(fā)生在胚胎發(fā)育早期，主要的原因是胚型基因激活滯后，導(dǎo)致胚型基因激活失敗。為了避免發(fā)育阻滯的出現(xiàn)，在完成牛卵母細(xì)胞受精后，利用中間受體（兔或綿羊的輸卵管）培養(yǎng)受精卵至囊胚階段，然后再進(jìn)行移植操作，也可采用“TCM199+血清”與體細(xì)胞（輸卵