DB34∕T 2716-2016 兩系水稻不育基因鑒定功能標(biāo)記法

兩系水稻不育基因鑒定功能標(biāo)記法Identificationoftwo-linericemalesterilegenes—functionalmarkermethodHYPERLINK安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)歸口單位：安徽省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宋豐順、楊劍波、倪大虎、倪金龍、陸徐忠、李莉、汪秀峰、魏鵬程、楊亞春、馬卉、李浩、秦瑞英、許學(xué)、李娟。1兩系水稻不育基因鑒定功能標(biāo)記法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了兩系水稻不育基因功能標(biāo)記檢測(cè)的術(shù)語和定義、原理、主要儀器、試劑與溶液、操作步驟、帶型記錄和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于兩系水稻不育基因鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)GB4404.1糧食作物種子第1部分；禾谷類GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。功能標(biāo)記FunctionalMarker根據(jù)基因內(nèi)部引起表型性狀變異的功能突變位點(diǎn)開發(fā)出來的一種分子標(biāo)記。兩系水稻Two-LineRjce/b本標(biāo)準(zhǔn)將兩系不育系和兩系雜交水稻統(tǒng)稱為兩系水稻。兩系不育系是指利用水稻的光溫敏核不育特性選育的水稻雄性不育系，其在短日低溫條件下表現(xiàn)為雄性可脊，奇以繁殖種子，在長日高溫條件下表現(xiàn)為雄性不育，可用于雜交稻制種。兩系雜交水稻是指利用兩系不育系與恢復(fù)系雜交產(chǎn)生的F1代。標(biāo)準(zhǔn)樣品StandardSample標(biāo)準(zhǔn)樣品是指經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)定認(rèn)證的代表已知品種特征特性的樣品。本標(biāo)準(zhǔn)中包括陰性標(biāo)準(zhǔn)樣品和陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品。陰性標(biāo)準(zhǔn)樣品是指不攜帶pms3基因和tms5基因的水稻種子、幼葉或DNA。2陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品是指攜帶pms3基因或tms5基因的水稻種子、幼葉或DNA,包括pms3型不育系標(biāo)準(zhǔn)樣品、pms3型雜交水稻標(biāo)準(zhǔn)樣品、tms5型不育系標(biāo)準(zhǔn)樣品和tms5型雜交水稻標(biāo)準(zhǔn)樣品。送驗(yàn)樣品SubmitSample送到種子檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)的樣品。4.1生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用的兩系水稻按其不育基因種類可分為pms3型和tms5型兩類。4.2根據(jù)不育基因pms3和tms5的功能突變位點(diǎn)序列與可育基因(PMS3和TMS5)不同，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增功能突變位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶特異切割不育基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，而不酶切可育基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，形成片段長度多態(tài)，從而將不育基因、可育基因以及兩者的雜合體區(qū)分開。5主要儀器5.1PCR擴(kuò)增儀5.2離心機(jī)：最大離心力≥12,000g5.3電泳檢測(cè)系統(tǒng)：水平電泳系統(tǒng)5.4微量移液器：規(guī)格分別為2μL、20μL、100μL、200μL、1000μL,連續(xù)可調(diào)5.5低溫冰箱：最低溫度-20℃5.6凝膠成像系統(tǒng)5.7高壓滅菌鍋5.8電子天平：精確度0.001g5.9恒溫水浴鍋：溫控精確度±1℃5.10磁力攪拌器5.11微波爐5.12紫外分光光度計(jì)5.13酸度計(jì)：精度±0.01pHHYPERLINK6.1試劑要求僅使用分析純?cè)噭┖头螱B/T6682規(guī)定的一級(jí)水。6.2.1十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)6.2.2三羥甲基氨基甲烷堿(Tris-Base)6.2.3乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?·2H?O)6.2.4濃鹽酸6.2.5氫氧化鈉6.2.6氯化鈉36.2.7三氯甲烷6.2.8異戊醇6.2.9異丙醇6.2.10無水乙醇6.2.12DNA聚合酶及其GCBufferI和GCBufferII6.2.13四種脫氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP),縮略為dNTPs6.2.14限制性內(nèi)切酶RsaI6.2.15兩系水稻不育基因功能標(biāo)記引物(引物序列見附錄A)見附錄B。7操作程序7.1樣品制備7.1.1送驗(yàn)樣品可為水稻的種子、葉片或其他等效物。送驗(yàn)樣品為種子時(shí)，其分樣和保存應(yīng)符合GB/T3543.2的規(guī)定，種子發(fā)芽按GB/T3543.4規(guī)定執(zhí)行。7.1.2用于兩系水稻類型檢測(cè)的送驗(yàn)樣品，其純度應(yīng)符合GB4404.1的規(guī)定。隨機(jī)抽取至少5粒種子(或5個(gè)葉片),分別提取基因組DNA。委托方指定的單株葉片，可直接提取DNA。7.1.3用于兩系雜交水稻不育株率鑒定的送驗(yàn)樣品，應(yīng)隨機(jī)抽取至少100粒種子(或100個(gè)單株)分7.1.4以相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對(duì)照。將水稻幼苗或葉片約5cm,置于2.0mL離心管中，加液氮用玻棒充分研磨至粉末狀；向離心管中加入700μL65℃預(yù)熱的DNA提取液，65℃孵育1h,每隔15min顛倒混勻一次；加入等體積氯仿/異戊醇混合液，輕緩混勻，室溫靜置15min;12,000g離心10min,吸取上清液至另一支1.5mL離心管中，再加入等體積異丙醇混勻，置于-20℃30min,4℃、12,000g離心10min,棄上清，加入1.0mL70%乙醇洗滌沉淀；.12/000_g,離心，10min后棄去乙醇，室溫干燥后加入100μL滅菌水，充分溶解；檢測(cè)濃度，I用滅菌水將提取的DNA終濃度稀釋至-50ng/μ,-20℃保存留用。7.3功能標(biāo)記檢測(cè)用附錄A中引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見附錄C表C.1和表C.2。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,循環(huán)35次，72℃5min,4℃保PCR反應(yīng)完成后，在反應(yīng)液中加入1～2URsaI酶，推薦反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃孵育4h～16h。47.3.3電泳檢測(cè)PCR酶切產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(參見附錄D)。8帶型記錄送驗(yàn)樣品在檢測(cè)位點(diǎn)的基因型用擴(kuò)增片段酶切后長度的變化表示。將送驗(yàn)樣品的電泳圖譜與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較，確定送驗(yàn)樣品的各條帶分子量。帶型數(shù)據(jù)記錄為x/y,其中x,y表示條帶有無和分子量大小。對(duì)于pms3-M標(biāo)記，x和y分別代表454bp和369bp位置DNA片段的有無，對(duì)于tms5-M標(biāo)記，x和y分別代表172bp和146bp位置DNA片段的有無，有片段則記錄為片段的大小，無片段則記錄為0。9結(jié)果判定9.1兩系水稻類型判定根據(jù)附錄A表A.1中的功能標(biāo)記在送驗(yàn)樣品中擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切電泳圖譜和帶型記錄，判斷不育基因存在與否及其類型(表1)。表1根據(jù)帶型判定兩系水稻類型帶型記錄不含有pms3和tms5的水稻tms5型雜交水稻主傳tms?純合型水稻9.2兩系雜交水稻不育株率判定根據(jù)兩系不育基因功能標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，兩系雜交水稻具有父母本互補(bǔ)帶型454/369或(和)172/146,而兩系不育株僅具有母本帶型0/369或(和)0/146,判定兩系雜交水稻中混入的不育株。根據(jù)每個(gè)受檢單株的帶型記錄，按公式(1)計(jì)算受驗(yàn)樣品的不育株率：5Nr——供檢種子粒數(shù)(幼苗數(shù)、株數(shù));No——具有0/369(pms3-M)或0/146(tms5-M)帶型的種子粒數(shù)(幼苗數(shù)、株數(shù))。6(規(guī)范性附錄)A.1功能標(biāo)記用于兩系水稻鑒定的功能標(biāo)記名稱、基因、引物序列、擴(kuò)增基因正向引物序列(5’—3’)反向引物序列(5’—3”)大小內(nèi)切酶A.2標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)結(jié)果用pms3-M標(biāo)記檢測(cè)pms3基因，擴(kuò)增產(chǎn)物被RsaI酶切后，陰性標(biāo)準(zhǔn)樣品(不攜帶pms3基因)稻標(biāo)準(zhǔn)樣品形成454bp、369bp和85bp的3個(gè)片段。用tms5-M標(biāo)記檢測(cè)tms5基因，擴(kuò)增產(chǎn)物被RsaI酶切后，陰性標(biāo)準(zhǔn)樣品(不攜帶tms5基因)樣品會(huì)出現(xiàn)172bp和146bp的2個(gè)片段。HYPERLINK7DB34/T2716—2016(資料性附錄)溶液B.11mol/LTris-HCI溶液60.55gTris堿溶于適量水中，加HCl調(diào)pH至8.0,定容至500mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。187.6gEDTA-Na?·2H?O溶于800mL水中，用NaOH調(diào)pH值至8.0,定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。B.3DNA提取液81.7gNaCl和20gCTAB充分溶于適量水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL,0.5mol/LEDTA40mL,定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。4℃貯存。B.4氯仿/異戊醇混合液體積比為24:1。B.570%乙醇溶液B.6加樣緩沖液2.5mg/mL溴酚蘭、40%(m/W蔗糖。aB.8溴化乙錠(EB)貯液10mg/mL溴化乙錠(EB)。8原濃度終濃度dNTPs(每種)下游引物一 原濃度終濃度dNTPs(每種)10證o17下游引物——9(資料性附錄)D.1凝膠制備D.1.1pms3-M標(biāo)記凝膠制備按2.0%(m/v)的瓊脂糖濃度配制凝膠。將1×TAE電泳緩沖液和瓊脂糖混合煮沸熔化，冷卻至55℃~60℃,加入0.01%凝膠體積的溴化乙錠，混勻，倒入已封好的膠槽中，插上樣品梳。按4.0%(m/v)的瓊脂糖濃度配制凝膠。其他與D.1.1同。D.2加樣D.3電泳pms3-M標(biāo)記電泳約40min,tms5-M標(biāo)記電泳約1h～1.D.4照相HYPERLINK[1]DingJ,LuaQ,OuyangY,MaoH,ZhangP,YaoJ,noncodingRNAregula