中圖版高中生物考點加強課6限制酶的選擇原則

考點加強課6限制酶的選擇與口的基因的檢測

為藤?練~與鑒定

I展現肆方法|技法必備巧攻關

1.限制酶的選擇原則

Pst

PstISmaIPsiI

L+

sLI抗病法國京RI

圖中

(1)根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類

①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因"切出"，如圖甲可選擇

PstT。

②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，以防破壞目的基因，如圖甲不能選擇

Smal?

③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基

因和質粒，如圖甲也可選擇用PstI和EcoRI兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶

的切點)，而且這種切點不致于破壞所有的“標記基因”以及啟動子和終止子。

(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類

因其切點

不在啟動;

其會破壞啟動子不

子與終止M〃din—一宜選擇

子之間不

宜選擇其位『啟動子、終

，抗性赳終止天'BamH1止子之間宜選擇

■EcoRI

因其位于其會破壞終止子不

“標記基因宜選擇

內不宜選

此位點切割會導致

擇“

終止子丟失不宜選

因其位于或制原點內.如制原點被破壞或擇

切掉后不能在受體細胞中或制保存.而不

宜選擇

①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。

②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，

應至少含有一個完好的標記基因，如圖乙中限制酶夕stI因其會破壞標記基因而不宜選擇。

③所選限制酶切點不應位于復制原點處以防破壞復制原點，如果所選酶的切點不止一

個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復制原點區(qū)，則切割重組后的片

段進入受體細胞后不能自主復制。

④所選限制酶，其切點應位于啟動子與終止子之間，如圖乙中》〃7din會破壞啟動子,

FcoRI會破壞終止子，而A/del和BarriaI切出的切口可讓目的基因嵌入啟動子與終止

子之間。

(3)參考Ti質粒的T-DNA片段選擇限制酶

若質粒上標出T-DNA片段，則所選限制酶切點應位于T-DNA片段中，從而有利

于將目的基因嵌入到T-DNA片段上——因為Ti質粒的T-DNA片段最易轉移至受體細

胞并且整合到受體細胞染色體DNA上,如用兩種限制酶XbaI和SacI(兩種酶切出的

黏性末端不同)切割某DNA,獲得含目的基因的片段。若利用該片段構建基因表達載體，

則下圖中甲、乙、丁，Ti質粒均不宜選擇，而丙Ti質粒宜選取。(分析如下)

T-DNAT-DNAXbaISacIXbalXba\

切點不位于上而且含XbaI,T-DNA上

T-DNA上SacI兩種切點恰但缺乏Sac\

與目的基因兩端切點

切點相同

2.目的基因的檢測與鑒定

(1)界定〃標記基因〃與〃DNA分子雜交技術〃在目的基因檢測中的作用：

①載體上標記基因的標記原理

載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵

抗相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細

胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生

素就可以只保留轉入載體的受體細胞，倘若在選擇培養(yǎng)基中不能存活，則表明無質粒轉入，

當然不會有〃目的基因〃轉入，能存活時必含該載體,原理如下圖所示：

進入受_________在含南城節(jié)青尊隸I

的培養(yǎng)基上培養(yǎng)

只有含有載體.

含有氨節(jié)育

IQI并且載體上的

大腸桿菌中有的

霉素抗性基基因表達的大

因的質粒有載體進入,有

腸桿菌才能存

的沒有載體進入

活井增殖

②"標記基因"篩選后為何還需應用"DNA分子雜交技術”確認目的基因是否轉

入？

經上述步驟篩選得到的受體細胞，只是含特定的標記基因的質粒，然而，該質粒上是

否成功嵌入了目的基因，還不能確定，故仍需使用"目的基因"作探針，利用DNA分子

雜交技術，檢測受體細胞的質粒上是否含目的基因。

(2)使用"目的基因"作探針，運用"分子雜交技術”檢測目的基因是否轉錄出特定

mRNA。

(3)采用"抗原一抗體雜交技術"，從轉基因生物中提取蛋白質(作抗原)與相應抗體雜

交，依據是否出現雜交帶確認目的基因是否"指導"特定蛋白質的合成。

(4)采用抗蟲、抗病毒等"接種實驗”進行目的基因成功表達的"個體生物學"水平的

檢測。

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【例證】(2016?全國卷IH,40)圖⑻中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRI、

8amHI和Sau3AI三種限制性內切酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達載體的示

意圖(載體上的EcoRI、Sa=3AI的切點是唯一的)。

—GAATTCGGATCC—GATC

——Cl'TAAGCCTAGG——CTAG

,Sau3AI

抗生素抗性基因

圖(b)

根據基因工程的有關知識，回答下列問題：

(1)經BarriaI酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被酶切后的產物

連接，理由是__________________________________________________

(2)若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組DNA

分子，如圖(c)所示，這三種重組DNA分子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的

有,不能表達的原因是

目的H的基因

基因

目的

基因

圖(C)

(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有和，其

中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_______________________O

［慧眼識圖獲取信息］

(1)三種限制酶切割結果分析

&?RI切割后的黏性末端I切割后的新性末端

-GAATTC——G{GATC}C—

—errAAG——CCTAG—A"G一

3AI切割后的黏性末端

GATC—

Tta?-此兩類黏性末端

▲可相互.配對”

..............一故可連接

(2)表達載體與重組DNA分子分析

由此可見,只有乙所示目的基因其首端為

啟動于.尾端燧止于，故其能正常表達

答案(l)Sa=3Al兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端(2)甲、丙甲中

目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不

能被轉錄(3)￡co//DNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶

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1.（2019?湖南長沙長郡中學月考）下圖是利用工程菌（大腸桿菌）生產人生長激素的實驗

流程。所用的PBR322質粒含有限制酶PstI、EcoRI和HindHI的切點各一個，且三種

酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨莘青霉素抗性基因，TeV表示四環(huán)素抗性基

因。請回答以下相關問題：

構建基因表二大

一達載體腸

桿

赭

無菌牙簽

含四

壞素

切割后的啦粒人

生

培養(yǎng).分離純化

代

丙激

人生長激素

素基因（器器臺01僦

三人生長激凝mRNA」一人的某組織細胞

（1）過程①所用到的組織細胞是,過程④所用的酶是o⑤過程常用

溶液處理大腸桿菌。

（2）經②過程得到的互補DNA片段，稱為。

（3）如果用限制酶R?I、￡coRI和477dHI對圖中質粒進行切割，用一種酶、兩種

酶和三種酶分別切割時形成的DNA片段種類與用一種酶和兩種酶分別切割時形成的DNA

片段種類（填"相同"或"不同"），這些種類的DNA片段中含有完整氨節(jié)青霉素

抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有種和種。

（4）如果只用限制酶PstI切割目的基因和質粒，完成過程④、⑤后（受體大腸桿菌不含

Amp、TeV）,將三角瓶內的大腸桿菌先接種到甲培養(yǎng)基上，形成菌落后用無菌牙簽挑取培

養(yǎng)基甲上的單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培養(yǎng)基的相同位置上，一段時間后，菌落的

生長狀況如圖乙、丙所示。接種到甲培養(yǎng)基上的目的是篩選的大腸桿菌;

接種到培養(yǎng)基乙上的大腸桿菌菌落，能存活的大腸桿菌體內導入的是.含有

目的基因的大腸桿菌在培養(yǎng)基乙和丙上的生存情況是

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________O

（5）將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨茉青霉素、四環(huán)素培養(yǎng)基上的過程，屬于基因工程基本操作

中的___________________________________________________

步驟。該基因工程中的PBR322質粒徹底水解的產物是___________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________O

解析（1）過程①獲得的是人生長激素mRNA,所以組織細胞取自人垂體組織細胞；過

程④構建基因表達載體的酶是DNA連接酶；過程⑤將基因表達載體導入大腸桿菌前，常

用CaCL溶液處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細胞。（2）②過程是人的生長素mRNA逆轉

錄形成cDNA的過程。（3）為？1、Ecc^I和/■/力dm三種酶的切點分別用1、2、3表示，

一種酶酶切時，一共可以得到3種相同長度的片段；兩種酶酶切時，可得至I」1-2,2-1,

2-3,3-2,1-3,3-1六種片段;三種酶酶切時,可得到1-2,2-3,3-1三種片

段，與前面重復，因此用一種酶、兩種酶和三種酶分別切割時形成的DNA片段種類與用

一種酶和兩種酶分別切割時形成的DNA片段種類相同。這些種類的DNA片段中含有完整

氨萃青霉素抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有3種和3種。（4）

在甲中能生長的是具有四環(huán)素抗性的細菌，含有四環(huán)素抗性基因；在乙培養(yǎng)基中能生長的

是具有四環(huán)素和氨莘青霉素抗性的細菌，所以導入的是完整的PBR322質?；蚝蠥mp1

Tetr的質粒。與丙相比，乙培養(yǎng)基中少了兩個菌落，說明丙培養(yǎng)基中這兩個菌落中的大腸

桿菌成功導入了重組質粒，而且目的基因插入質粒后，破壞了氨莘青霉素抗性基因，使含

有目的基因的大腸桿菌不能在含有氨茉青霉素的乙培養(yǎng)基上生長，但四環(huán)素抗性基因是完

好的，則含有目的基因的大腸桿菌能在含有四環(huán)素的丙培養(yǎng)基上生長。（5）將大腸桿菌培養(yǎng)

在含氨莘青霉素、四環(huán)素培養(yǎng)基上的過程，屬于基因工程中的篩選含目的基因的受體細胞

步驟。該基因工程中的pBR322質粒的化學本質是DNA,其徹底水解的產物是磷酸、脫

氧核糖和四種含氮堿基。

答案（1）人垂體組織細胞DNA連接酶CaCI2

（2）cDNA⑶相同33⑷含四環(huán)素抗性基因完整的pBR322質粒（或含有

Amp'Tetr的質粒）在丙中能存活，在乙中不能存活（5）篩選含目的基因的受體細胞磷

酸、脫氧核糖、四種含氮堿基

2.（2019?河南名校聯(lián)盟調研）如圖所示為培育轉基因細菌的操作流程，回答下列問題：

◎+1細菌在培養(yǎng)液中

繁殖后,在固體

培養(yǎng)基生長建一

我體外源DNA-重。制質粒

轉染

—市組DNA增殖篩選含重組

細菌咬粒的細菌

2

（1）圖中①過程所用工具酶有o為了防止載體和外源DNA自連，應

如何操作?.

(2)當細菌的轉化過程中吸收的外源DNA是病毒DNA時，該轉化過程又稱轉染。圖

中外源DNA來自。為了提高轉染效率，應使用處理細菌。

⑶圖中②過程，重組DNA增殖時需要哪些條件？

_______________________________________________________O

(4)圖中③過程，篩選含重組質粒的細菌需用到基因的功能。已知所用載體內

有青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因兩種抗性基因，請寫出能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，

但不能在含青霉素的培養(yǎng)基上生長的細菌即為含外源DNA細菌的前提條件：

_________________________________________________(答出兩點即可)。

解析根據轉染的定義可知，培育圖示轉基因細菌的外源DNA應來自(DNA)病毒。

另外，限制酶也可以答成限制性核酸內切酶。

答案Q)限制酶和DNA連接酶應使用兩種限制酶同時切割載體和外源DNA

(2)(DNA)病毒Ca2+

(3)模板、原料、酶和能量等

(4)標記原細菌不具有青霉素和四環(huán)素的抗性基因，外源DNA插入到載體的青霉素

抗性基因內部

課后?加強訓練

（時間：15分鐘）

1.（2016?全國卷I,40）某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tet「中會

導致相應的基因失活（Ampr表示氨茉青霉素抗性基因，Tet「表示四環(huán)素抗性基因）。有人將

此質粒載體用BamHI酶切后,與用8a6HI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接

酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的

被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入

了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：

啟動于

⑴質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有

（答出兩點即可）,而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和

終止子。

（2）如果用含有氨萃青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化

的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是

并且和的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是

在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落,

還需使用含有的固體培養(yǎng)基。

（3）基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于

解析（1）作為運載體必須具備如下特點：①能自主復制，從而在受體細胞中穩(wěn)定保存；

②含標記基因，以供重組DNA的鑒定和篩選；③具一個至多個限制酶切割位點以便外源

DNA插入。（2）在含有氨莘青霉素的培養(yǎng)基上,只有具有Ampr的大腸桿菌才能夠生長。

而Ampr位于質粒上，故未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌細胞中無Ampr,不

能在培養(yǎng)基中生長，而僅含有質粒載體的和含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌均

具有Ampr因而能在培養(yǎng)基中生長。目的基因的插入破壞了質粒載體的TeV,故含有插入

了目的基因的重組質粒的大腸桿菌不能在含有四環(huán)素的平板上生長，從而與僅含有質粒載

體的大腸桿菌得以區(qū)分。（3）噬菌體是病毒，無細胞結構，無法自主合成DNA,需借助宿

主細胞完成DNA復制。

答案Q）能自我復制、具有標記基因

（2）二者均不含有氨節(jié)青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長含有質粒載體含有

插入了目的基因的重組質粒（或答含有重組質粒）二者均含有氨芋青霉素抗性基因，在該

培養(yǎng)基上均能生長四環(huán)素

（3）受體細胞

2.（2019?湖北武漢市調研）人類是乙型肝炎病毒的唯一宿主，現有的肝硬化、肝癌多從

乙肝發(fā)展而來，接種乙肝疫苗是預防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的研制先后經

歷了血源性疫苗和基因工程疫苗階段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用

高速離心法提純血液中的乙肝病毒，之后再將其滅活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染風

險。如圖所示為乙肝基因工程疫苗的生產和使用過程（注：質粒中后cZ基因可使細菌利用

培養(yǎng)基中的物質X-gal,從而使菌落呈藍色，若無該基因，則菌落呈白色）。請回答下列

問題：

BtimHI

青毒素

基因|導入,廝桿菌日|乙肝病即外殼|

抗性基因/"'Z

粒|I注射?按種

BamHI目的BamHI/?l

匚您“I/

IH加抗體I

EroRVEcoRI

（1）過程①最好選用的限制酶方案可以是,

A.&TJRV和6a/77HIB.Ba/nHI和&'oRI

C.FcoRV和EcoRID.只用88mHI

⑵由圖中過程③可知，該目的基因的具體功能是

⑶若要迅速獲取大量的目的基因，以提高重組質粒產生的效率，常用的技術是

（寫中文全稱）。圖中過程②常需要用處理，使大腸桿菌細胞轉化為感受態(tài)細胞。

（4）為了篩選、獲取含重組質粒的大腸桿菌，需在培養(yǎng)大腸桿菌的通用培養(yǎng)基中額外加

入,培養(yǎng)一段時間挑選出呈（填"藍色"或"白色"）的菌落進一步

培養(yǎng)獲得大量目的菌。

（5）用基因工程疫苗接種比血源性疫苗更安全，試從疫苗的結構特點解釋原因

解析Q）分析題意可知，切割目的基因和運載體應用相同的限制酶，所用限制酶要保

證目的基因的完整性，并且把目的基因插入質粒中，故選用BamHI和EcoRI（用一種限

制酶切割時，目的基因和運載體可能會發(fā)生自身環(huán)化或隨意連接）。（2）從過程③可知，目的

基因在大腸桿菌體內可表達出乙肝病毒外殼，故該目的基因的功能是指導乙肝病毒外殼蛋

白的合成。（3）獲取大量目的基因通常采用PCR技術擴增，即多聚酶鏈式反應。將目的基

因導入大腸桿菌細胞的方法通常是用Ca2+處理細胞，使其變成易于接受外源DNA的感受

態(tài)細胞。（4）篩選含重組質粒的大腸桿菌，可在培養(yǎng)大腸桿菌的通用培養(yǎng)基中加入青霉素和

X-gal,青霉素可以篩選出轉入了含目的基因的重組質粒和正常質粒的大腸桿菌，由于重

組質粒中/acZ基因被破壞，而后叱基因可使細菌利用培養(yǎng)基中的物質X-gal,使菌落呈

藍色，若無該基因，菌落呈白色，故挑選出白色菌落即可。（5）研制血源性疫苗需滅活破壞

乙肝病毒的核酸結構，有可能由于意外因素導致其沒有被滅活，導致乙肝病毒在宿主細胞

內大量增殖，從而使接種者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白質，不

會引發(fā)病毒增殖和感染。

答案Q)B(2)指導合成乙肝病毒外殼蛋白(3)多聚酶鏈式反應Ca2+(4)青霉素

和X-gal白色(5)研制血源性疫苗需滅活破壞乙肝病毒的核酸結構，滅活不成功則會導

致接種者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白質，不會引發(fā)病毒增殖和

感染

3.(2018?河南名校一聯(lián))胰島素是治療糖尿病的重要藥物。現利用基因工不毀術讓大腸

桿菌生產人胰島素，下圖為大腸桿菌質粒，請據圖作答：

補充說明：〃/力加、8amHI、&oRI是限制酶切位點和廣、az*是抗生素抗性

基因

Q)獲取目的基因時，應從人的