DB6521∕T 074-2024 SSR分子標(biāo)記鑒定甜瓜雜交種純度技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSB216521IDB6521/T074—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容有可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所提出。本文件由吐魯番市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局歸口。本文件起草單位：新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所、新疆葡萄瓜果技術(shù)開發(fā)服務(wù)公司、新疆維吾爾自治區(qū)種業(yè)發(fā)展中心、新疆農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校。本文件主要起草人：李超、楊英、陳偉、楊咪、孫玉萍、楊軍、耿新麗、徐暢、趙文霞、李婧、程曉宇、張銀歡。本文件實(shí)施應(yīng)用中的疑問，請咨詢新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所。對本文件的修改意見、建議，請反饋至新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所（鄯善縣苗園路4號）、吐魯番市市場監(jiān)督管理局（吐魯番市高昌區(qū)西環(huán)北路2712號）。新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所（鄯善縣苗園路4號聯(lián)系電話郵編：838200。吐魯番市市場監(jiān)督管理局（吐魯番市高昌區(qū)西環(huán)北路2712號聯(lián)系電話（傳郵編：838000。1DB6521/T074—2024SSR分子標(biāo)記鑒定甜瓜雜交種純度技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了甜瓜品種純度SSR（simplesequencerepeat，SSR）分子標(biāo)記鑒定的原理、儀器設(shè)備和PCR反應(yīng)相關(guān)試劑、方法步驟和純度計算的要求。本文件適用于甜瓜雜交種純度鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.1農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1品種純度purityofvariety指品種在特征方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)占供檢作物種子數(shù)的百分率表示。3.2簡單重復(fù)序列simplesequencerepeat(SSR)由幾個核苷酸（1～6個）為重復(fù)單位聚集而成的長達(dá)幾十個至幾百個bp（一般為100～200）的串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。3.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction(PCR)利用DNA在體外95℃高溫變性成單鏈，低溫（通常是55℃~60℃)時引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，溫度再調(diào)至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72℃),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5′~3′)的方向合成互補(bǔ)鏈。3.4引物primer2DB6521/T074—2024人工合成的兩段寡核酸序列。一個引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。4原理品種的不同本質(zhì)上是由于其遺傳物質(zhì)DNA核苷酸序列不同所致。SSR廣泛分布于甜瓜整個基因組中，根據(jù)微衛(wèi)星序列兩段互補(bǔ)序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段。由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同造成了品種間的多態(tài)性，通過PCR的方法擴(kuò)增出不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，在電場作用下由于分子量大小不同而分離，再經(jīng)硝酸銀染色，可辨別SSR電泳圖譜。SSR分子標(biāo)記呈共顯性，選用品種間具有多態(tài)性的SSR引物，雜交種F1代種子的DNA-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物譜帶中應(yīng)具有雙親譜帶，以此鑒定甜瓜雜交種種子純度。5儀器設(shè)備及試劑儀器設(shè)備及試劑見附錄A。6溶液配制溶液配制方法見附錄B。引物相關(guān)信息見附錄C。8操作程序8.1樣品準(zhǔn)備取200粒種子，催芽。8.2DNA提取8.2.1總則DNA提取方法應(yīng)保證提取的DNA質(zhì)量符合PCR擴(kuò)增的要求，DNA溶解液的紫外光吸光度OD260與OD280的比值應(yīng)介于1.8～2.0之間。DNA提取可任選8.2.2與8.2.3中的一種方法。其中改良CTAB法提取量大，質(zhì)量好，可長期保存；堿裂解法簡單快速，但提取量小，質(zhì)量一般，不宜保存。8.2.2改良CTAB法提取DNA：a)將樣品置于2.0mL離心管，液氮冷凍后，迅速研磨成粉末；b)加入800μL2%的CTAB，混合均勻后，65oC水浴30min，每10min輕輕上下?lián)u晃5～10次；3DB6521/T074—2024d)8,000rpm離心10min，抽取上清液到一個新的離心管中；e)加入2/3體積的異丙醇，上下顛倒200次，混勻；f)12,000rpm離心10min，此時DNA成白色團(tuán)裝聚于管底，棄去上清；g)用75%乙醇洗滌2次，最后一次用移液槍吸干管底的多余酒精，然后放置在超凈臺中吹干水h)加入50μL含有RNase的ddH2O溶解DNA，放置在4oC備用。8.2.3堿裂解法提取DNAa)將種子嫩芽取下，裝入2mL離心管，同時放2顆小鋼珠；；b)加100μLNaOH（0.1mol/L）溶液，用高通量組織研磨器打碎樣品；c)然后將離心管置于沸水中1min，冷卻后加入100μLTris緩沖液（100mmol/L，pH8.0），充分混勻備用。取1.5～3μL作為PCR反應(yīng)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。注：嫩葉DNA提取用CTAB法；種芽DNA提取采用堿裂解法。8.3PCR擴(kuò)增8.3.1反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系（共20μl）：6.4μLddH2O；10μLMixforPAGE；0.6μL上下游混合引物（10μmol/L）；3μL模板DNA。8.3.2反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55～60℃退火15s，72℃延伸15s，36個循環(huán)；72℃延伸4min；4℃保存。8.4PCR產(chǎn)物檢測SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。電泳分離的SSR-PCR擴(kuò)增片段用銀染法染色。8.4.1凝膠制備蘸取洗潔精用清水將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，再用去離子水沖洗后晾干；將前后兩塊玻璃板用鐵夾固定好，將一定體積的8%非變性聚丙烯酰胺溶液中加入0.5%體積的10%過硫酸銨溶液和0.1%體積的TEMED，充分混勻后，立即灌膠至玻璃膠室，灌膠過程防止氣泡產(chǎn)生。灌滿膠后，及時將樣品梳插入其中，待膠凝固后使用。8.4.2電泳待凝膠凝固后，將玻璃板用鐵夾固定到電泳槽上，加入0.5×TBE電泳緩沖液，中間的液面應(yīng)沒過4DB6521/T074—2024內(nèi)側(cè)的導(dǎo)電絲，底部的液面應(yīng)超過電泳槽的1/2（電泳緩沖液可反復(fù)使用多次，一般一周更換一次拔出樣品梳。每一個加樣孔點(diǎn)入2～5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣品，連接電極，設(shè)置電壓150V，電流500mA，一般電泳1h左右（指示劑到達(dá)膠板中下部即可）停止電泳，關(guān)閉電源。8.4.3染色取下玻璃板，輕輕撬開，將凝膠從玻璃板上剝離，浸入固定液中，置于搖床上搖動兩次，每次6min；固定結(jié)束后，倒掉固定液，加入0.2%硝酸銀染色液，置于搖床輕輕搖動，染色12min；倒去染色液后，先加入適量的硫代硫酸鈉溶液（或去離子水）清洗30s，倒掉后再用適量去離子水漂洗30s后倒掉；在新配制的顯影液中搖動至出現(xiàn)清晰的條帶；可在膠片燈上直接記錄或用相機(jī)拍照保存。注：固定液、染色液，去離子水和顯影液的用量，可依據(jù)膠板數(shù)量進(jìn)行調(diào)整，以沒過膠面為準(zhǔn)。8.5SSR擴(kuò)增圖譜的判讀對甜瓜SSR圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄時，采用每對引物在不同品種中擴(kuò)增的整體帶型為單位進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。在進(jìn)行甜瓜品種純度鑒定時，可根據(jù)每個單株材料擴(kuò)增出的整體帶型，比對200個單株整體帶型差異。由于SSR引物呈共顯性，合適的SSR引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物譜帶具有雙親的條帶。9甜瓜雜交種純度計算以合適的SSR引物擴(kuò)增送檢樣品的DNA，通過帶型統(tǒng)計，用具有本品種特異帶型的送檢樣品數(shù)占總檢測樣品數(shù)的百分率表示純度，計算公式如下：（1）式中：C——品種純度，單位為%；T——供檢樣品總數(shù)，單位為個；N——非本品種供檢樣品數(shù)，單位為個。10記錄與檔案應(yīng)對整個試驗(yàn)過程進(jìn)行詳實(shí)記錄，記錄檔案至少保存兩年，做到可追溯。5DB6521/T074—2024（規(guī)范性附錄）主要儀器設(shè)備及試劑A.1主要儀器設(shè)備A.1.1水浴鍋A.1.2PCR儀A.1.3電泳儀A.1.4垂直電泳槽及配套的制膠附件A.1.5高速冷凍離心機(jī)A.1.6水平搖床A.1.7電子天平A.1.8制冰機(jī)A.1.9磁力攪拌器A.1.10冰箱A.1.11紫外分光光度計A.1.12高通量組織研磨儀A.1.13通風(fēng)櫥A.1.14微波爐A.1.15凝膠成像儀A.1.16pH計A.1.17移液槍A.1.18膠片觀察燈A.2主要試劑A.2.1無水乙醇A.2.2三氯甲烷A.2.3氫氧化鈉A.2.4丙烯酰胺A.2.5過硫酸銨（APS）A.2.6冰醋酸A.2.7硝酸銀A.2.8瓊脂糖A.2.9MixforPAGEA.2.10去離子水A.2.11ddH2OA.2.12硼酸A.2.13引物A.2.14十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）A.2.15異丙醇A.2.16甲叉丙烯酰胺6DB6521/T074—2024A.2.17硫代硫酸鈉（Na2S2O3）A.2.18甲醛A.2.19四甲基二乙胺（TEMED）A.2.20DNAMarkerA.2.21異戊醇A.2.22氯化鈉A.2.23Tris堿A.2.2440%Acr-BisA.2.25Tris-HCl7DB6521/T074—2024（規(guī)范性附錄）溶液配制B.1DNA提取B.1.10.5mol/LEDTA溶液稱取18.61gNa2EDTA?H2O，溶解于70mLddH2O中，定容至100mL，pH調(diào)至8.0，高溫滅菌。B.1.21mol/LTris-HCl溶液稱取12.1gTris堿溶解于80mlddH2O中，ddH2O定容至100mL，調(diào)節(jié)pH至8.0。B.1.3CTAB提取液稱取4.0gCTAB、16.364gNaCl、量取20mL的1mol/LTris-HCl（pH=8.0）、8mL的0.5mol/LEDTA、70mL的ddH2O震蕩搖勻，定容至200mL，高溫高壓滅菌30min，冷卻后置于陰涼干燥處備用。B.1.40.1mol/LNaOH2gNaOH，加ddH2O定容至500mL。B.1.50.1mol/LTris緩沖液12.1gTris，加ddH2O定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH至8.0。B.2PCR擴(kuò)增B.2.1MixforPAGE成品（MixforPAGE）。B.2.2引物用ddH2O按照說明分別配制正向引物、反向引物使其終濃度均為20μmol/L的儲存液，等體積混合成10μmol/L的工作液。B.3電泳B.3.150×TAE（500mL）8DB6521/T074—2024121gTris、Na2EDTA?H2O18.6g或0.5mol/LEDTA（50mL）、400mL去離子水、28.55mL冰乙酸，調(diào)pH=8.3，定容至500mL。B.3.210×TBE（1000mL）108gTris、55g硼酸、37.25mLEDTANa2，ddH2O定容至1000mL。B.3.340%Acr-Bis丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺按質(zhì)量比19:1配制。B.3.4TEMED成品（四甲基二乙胺）。B.3.510%APS20g過硫酸銨加ddH2O定容至200mL（400μL分裝20℃保存）。B.3.6聚丙烯酰胺凝膠每塊膠的配制（總體積：40mL28mLddH2O、4mL10×TBE、8mL40%Acr-Bis、40μLTEMED、400μL10%APS。B.4染色B.4.1固定液50mL無水乙醇、2.5mL冰醋酸，加ddH2O至500mL。B.4.2染色液1gAgNO3，加ddH2O至500mL。B.4.3清洗液120μL10%Na2S2O3，加ddH2O至500mL。B.4.4顯影液7.5gNaOH、1.5mL甲醛，加ddH2O至500mL。9DB6521/T074—2024（規(guī)范性附錄）核心引物表C.1核心引物序號名稱正向引物(5′-3′)反向引物(5′-3′)1SSR12083GAATTGGCCCATCCTTCATTGCCATTCCAAAAACTTTTCAAC2MU5554-1CCTTCATGATCCTCTACTAAACCCTCTTCCATGCTTTTCTCGCT3TJ10ACGAGGAAAACGCAAAATCATGAACGTGGACGACATTTTT4PM3