DB34T 1938-2013 鴨黃病毒感染診斷技術(shù)規(guī)程　

DB34DB34/T1938—2013鴨黃病毒感染診斷技術(shù)規(guī)程TechnicalregulationforDiagnosisofduckflavivirusinfection安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨黃病毒感染臨床診斷和PCR檢測的技術(shù)規(guī)程，其中包括流行病學(xué)、臨床診斷、實(shí)等地的蛋鴨和種鴨由于鴨黃病毒感染而引起聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechaPCR技術(shù)是一種在體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等——上游引物R1：5'-CGCGGATCCTCTGGGAACGACGAGAAG-3'——下游引物R2：5'-CCGGAATTCTCGGCATTGACATTTACT-3'2該病一年四季均可發(fā)生。病鴨開始出現(xiàn)采食量減少和產(chǎn)蛋量下降。產(chǎn)蛋率從產(chǎn)蛋高峰下降到10%以下，種蛋受精率降低10％左右。病鴨產(chǎn)蛋多為畸形蛋和軟殼蛋，病死率0～15％。沒有繼發(fā)感況下，病程持續(xù)10～30d，鴨群會自然康復(fù)，產(chǎn)蛋率也隨之恢復(fù)，但一般最多可恢復(fù)到發(fā)病前的70%。有飲、食欲，但多數(shù)因飲水、采食困難衰竭而死，死在10℃以下進(jìn)行樣品處理。用無菌PBS緩沖液與樣品按體積質(zhì)量比5:1將樣在含有樣品的塑料離心管中加入600μL抽提液A（1mol/LTris水溶液飽和酚:三氯甲烷:異戊醇按照25:24:1的混合液用力混合至少30s,12000r/min離心5min,小心取上層水相(約800μL)，再加入700μL抽提液B(三氯甲烷/異戊醇按24:1的比例混合液)，用力混合至少30s,12000r/min離心5min，小心取上層水相(約600μL)。再加入-20℃預(yù)冷的1.5倍體積的無水乙在上述反應(yīng)管中繼續(xù)加入5μL的5倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩酶抑制劑(20U),1μL逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(10U)和1.——雙蒸滅菌水37.5μL——反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4μL——上游引物0.5μL——下游引物0.5μL——10×PCRBuffer5μL5.7.4蓋好電泳儀，插好電極，將電壓調(diào)至90V左5.8.1從樣品處理開始設(shè)立陽性對照、陰性5.8.2取含有鴨黃病毒AH-F10株（中國典5.8.4取等體積水代替樣品為模板作5.9.2結(jié)果出現(xiàn)大小約260bp擴(kuò)增片段時(shí)，初步判定為鴨6.1臨床診斷符合4.1、4.2、4.3、4.4，初步判定為6.3診斷結(jié)果符合6.1、6.2，______________