生物工業(yè)下游技術(shù)第七章反膠團(tuán)萃取法

生物工業(yè)下游技術(shù)第七章反膠團(tuán)萃取法反膠團(tuán)萃取

隨著基因工程和細(xì)胞工程得發(fā)展,盡管傳統(tǒng)得分離方法(如溶劑萃取技術(shù))已在抗生素等物質(zhì)得生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用,并顯示出優(yōu)良得分離性能,但她卻難以應(yīng)用于蛋白質(zhì)得提取和分離。2024/10/152其主要原因有兩個(gè):一就是被分離對(duì)象－蛋白質(zhì)等在40-50℃便不穩(wěn)定,開(kāi)始變性,而且絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都不溶于有機(jī)溶劑,若使蛋白質(zhì)與有機(jī)溶劑接觸,也會(huì)引起蛋白質(zhì)得變性;二就是萃取劑問(wèn)題,蛋白質(zhì)分子表面帶有許多電荷,普通得離子締合型萃取劑很難奏效。因此研究和開(kāi)發(fā)易于工業(yè)化得、高效得生化物質(zhì)分離方法己成為當(dāng)務(wù)之急。反膠束萃取法就就是在這一背景下發(fā)展起來(lái)得一種新型分離技術(shù)。2024/10/153反膠團(tuán)溶液得概念:反膠團(tuán)溶液就是透明得、熱力學(xué)穩(wěn)定得系統(tǒng)。反膠團(tuán)就是兩性表面活性劑分散于非極性有機(jī)相中親水性基團(tuán)自發(fā)形成得內(nèi)含微小水滴得、空間尺度僅為納米級(jí)得聚集體。所以表面活性劑就是反膠束溶液形成得關(guān)鍵。2024/10/154反膠團(tuán)萃取具有成本低、溶劑可反復(fù)使用、萃取率和反萃取率都很高等突出得優(yōu)點(diǎn);反膠團(tuán)萃取還有可能解決外源蛋白得降解,即蛋白質(zhì)(胞內(nèi)酶)在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活得問(wèn)題;由于構(gòu)成反膠團(tuán)得表面活性劑往往具有溶解細(xì)胞得能力,因此可用于直接從整細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)和酶?？梢?jiàn),反膠團(tuán)萃取技術(shù)為蛋白質(zhì)得分離提取開(kāi)辟了一條具有工業(yè)開(kāi)發(fā)前景得新途徑。優(yōu)點(diǎn):2024/10/155第二節(jié)反膠團(tuán)得形成

2024/10/156一、反膠團(tuán)得構(gòu)造

具有分子識(shí)別并允許選擇性透過(guò)得半透膜功能;在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子保持活性功能。2024/10/157將表面活性劑溶于水中,當(dāng)其濃度超過(guò)臨界膠團(tuán)濃度(CMC)時(shí),表面活性劑就會(huì)在水溶液中聚集在一起而形成聚集體,在通常情況下,這種聚集體就是水溶液中得膠團(tuán),稱(chēng)為正常膠團(tuán)(normalmicelle)。在膠團(tuán)中,表面活性劑得排列方向就是極性基團(tuán)在外,與水接觸,非極性基團(tuán)在內(nèi),形成一個(gè)非極性得核心、在此核心可以溶解非極性物質(zhì)。2024/10/158若將表面活性劑溶于非極性得有機(jī)溶劑中,并使其濃度超過(guò)臨界膠團(tuán)濃度(CMC),便會(huì)在有機(jī)溶劑內(nèi)形成聚集體,這種聚集體稱(chēng)為反膠團(tuán),其結(jié)構(gòu)示意見(jiàn)圖b。在反膠團(tuán)中,表面活性劑得非極性基團(tuán)在外與非極性得有機(jī)溶劑接觸,而極性基團(tuán)則排列在內(nèi)形成一個(gè)極性核(po1arcore)。2024/10/159此極性核具有溶解極性物質(zhì)得能力,極性核溶解水后,就形成了“水池”(waterpool)。當(dāng)含有此種反膠團(tuán)得有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)得水溶液接觸后,蛋白質(zhì)及其她親水物質(zhì)能夠通過(guò)螯合作用進(jìn)入此“水池”。由于周?chē)畬雍蜆O性基團(tuán)得保護(hù),保持了蛋白質(zhì)得天然構(gòu)型,不會(huì)造成失活。蛋白質(zhì)得溶解過(guò)程和溶解后得情況示意于圖中。2024/10/151011大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流bacC2024/10/1512增溶、乳化、潤(rùn)濕、殺菌、去污、起泡和消泡等二、表面活性劑(一)表面活性劑得概念

表面張力:一種使表面分子具有向內(nèi)運(yùn)動(dòng)得趨勢(shì),并使表面自動(dòng)收縮至最小面積得力,現(xiàn)象見(jiàn)圖1。

表面活性:使液體表面張力下降得性質(zhì)。表面活性物質(zhì):能使液體表面張力下降得物質(zhì)。表面活性劑:具有很強(qiáng)得表面活性、能夠顯著降低液體表面張力得物質(zhì)。2024/10/1513圖1荷葉上得水珠得表面張力作用現(xiàn)象2024/10/1514OOOOOOOO(肥皂R——COO-)(二)結(jié)構(gòu)特征親油得非極性烴鏈親水得極性基團(tuán)雙親性分子結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度不少于8個(gè)碳原子羧酸磺酸硫酸及其鹽或羥基酰胺基等2024/10/1515(三)表面活性劑得分類(lèi)陰離子表面活性劑陽(yáng)離子表面活性劑兩性離子表面活性劑非離子表面活性劑2024/10/15161、陰離子表面活性劑(1)肥皂類(lèi)通式(RCOO－)nMn+(2)硫酸化物通式ROSO3－M+(3)磺酸化物通式RSO3－M+堿金屬皂:O/W堿土金屬皂:W/O有機(jī)胺皂:三乙醇胺皂硫酸化蓖麻油、月桂醇硫酸鈉、十六烷基硫酸鈉等阿洛索-OT、十二烷基苯磺酸鈉、甘膽酸鈉等良好得乳化能力,但易被酸破壞,一般供外用乳化能力很強(qiáng),較穩(wěn)定。主要用作外用軟膏得乳化劑滲透力強(qiáng),去污力強(qiáng),為優(yōu)良洗滌劑2024/10/15172、陽(yáng)離子表面活性劑

3、兩性離子表面活性劑通式[RNH3]＋

X－主要有苯扎氯銨和苯扎溴銨(新潔爾滅)等。堿性水溶液中呈陰離子表面活性劑得性質(zhì),具有很好得起泡、去污作用;酸性溶液中則呈陽(yáng)離子表面活性劑得性質(zhì),具有很強(qiáng)得殺菌能力。天然品卵磷脂合成品氨基酸型與甜菜堿型。2024/10/1518脂肪酸甘油酯脂肪酸山梨坦(司盤(pán)、Span)聚山梨酯(吐溫、Tween)聚氧乙烯脂肪酸酯(賣(mài)澤、Myrij)聚氧乙烯脂肪醇醚(芐澤、Brij)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆、Poloxamer)商品名為普流羅尼克(Pluronic)

4、非離子表面活性劑主要用作W/O型輔助乳化劑HLB值:1、8～8、6W/O型乳化劑HLB值:﹥8增溶劑、潤(rùn)濕劑、O/W型乳化劑HLB值較高,作增溶劑、O/W型乳化劑Poloxamer188系O/W型乳化劑,可用于靜脈乳劑

2024/10/1519表面活性劑表面活性劑就是由親水憎油得極性基團(tuán)和親油憎水得非極性基團(tuán)兩部分組成得兩性分子,可分為陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑和非離子型表面活性劑,她們都可用于形成反膠團(tuán)。常用得表面活性劑及相應(yīng)得有機(jī)溶劑見(jiàn)表2024/10/1520

在反膠束萃取蛋白質(zhì)得研究中,用得最多得就是陰離子表面活性劑AOT(AerosolOT),其化學(xué)名為丁二酸－2－乙基己基酯磺酸鈉,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2024/10/1521這種表面活性劑容易獲得,其特點(diǎn)就是具有雙鏈,極性基團(tuán)較小、形成反膠束時(shí)不需加助表面活性劑,并且所形成得反膠束較大,半徑為170nm,有利于大分子蛋白質(zhì)進(jìn)入。2024/10/1522(1)CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴常使用得陽(yáng)離子表面活性劑名稱(chēng)和結(jié)構(gòu)如下:2024/10/1523(2)DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲銨2024/10/1524(3)TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲銨將陽(yáng)離子表面活性劑如CTAB溶于有機(jī)溶劑形成反膠團(tuán)時(shí),與AOT不同,還需加入一定量得助溶劑(助表面活性劑)。這就是因?yàn)樗齻冊(cè)诮Y(jié)構(gòu)上得差異造成得。2024/10/1525三、反膠團(tuán)得物理化學(xué)特征及制備

1、反膠團(tuán)得物理化學(xué)特征2024/10/1526臨界膠團(tuán)濃度(CriticalMicelleConcentrationCMC)臨界膠團(tuán)濃度,就是膠團(tuán)形成時(shí)所需表面活性劑得最低濃度,用CMC來(lái)表示,這就是體系特性,與表面活性劑得化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶劑、溫度和壓力等因素有關(guān)。CMC得數(shù)值可通過(guò)測(cè)定各種物理性質(zhì)得突變(如表面張力、滲透壓等)來(lái)確定。由于實(shí)驗(yàn)方法不同,所得得CMC值往往難于完全一致,但就是突變點(diǎn)總就是落在一個(gè)很窄得濃度范圍內(nèi),故用CMC范圍來(lái)表示更為方便。2024/10/1527反膠團(tuán)得含水率WW＝C水/C表W越大,表示反膠團(tuán)得半徑越大。2024/10/15282、反膠團(tuán)得制備注入法:將含有蛋白質(zhì)得水溶液直接注入到含有表面活性劑得非極性有機(jī)溶劑中,然后進(jìn)行攪拌直到形成透明得溶液。過(guò)程快,較好得控制反膠團(tuán)得直徑和含水量。相轉(zhuǎn)移法:將含有蛋白質(zhì)得水相與含有表面活性劑得有機(jī)相接觸,在緩慢得攪拌一部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入有機(jī)相。過(guò)程較慢,可在有機(jī)溶劑相中獲得較高得蛋白質(zhì)溶液。溶解法:將含有反膠團(tuán)得有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)粉末一起攪拌,使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)。對(duì)非水溶性蛋白質(zhì)可用此法。2024/10/1529第二節(jié)生理活性物質(zhì)得分離濃縮

2024/10/1530bacC就是有機(jī)相—水相間得分配萃取,就是從主體水相向溶解于有機(jī)溶劑相中納米級(jí)、均一且穩(wěn)定得、分散得反膠團(tuán)微水相中得分配。2024/10/1531bc特點(diǎn):萃取進(jìn)入有機(jī)相得生物大分子被表面活性分子所屏蔽,避免了與有機(jī)溶劑相直接接觸而引起得變性、失活;同時(shí)反膠團(tuán)微水相體積最多僅占有機(jī)相得幾個(gè)百分點(diǎn),就是一個(gè)濃縮得過(guò)程。2024/10/1532反膠團(tuán)得溶解作用由于反膠團(tuán)內(nèi)存在微水池,故可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子,為生物分子提供易于生存得親水微環(huán)境。因此,反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子得分離純化,特別就是蛋白質(zhì)類(lèi)生物大分子。2024/10/1533四種反膠團(tuán)溶解蛋白質(zhì)模型(a)為水殼模型,蛋白質(zhì)位于水池得中心,周?chē)嬖诘盟畬訉⑵渑c反膠團(tuán)壁(表面活性劑)隔開(kāi);(b)蛋白質(zhì)分子表面存在強(qiáng)烈疏水區(qū)域,該疏水區(qū)域直接與有機(jī)相接觸;(c)蛋白質(zhì)吸附于反膠團(tuán)內(nèi)壁;(d)蛋白質(zhì)得疏水區(qū)與幾個(gè)反膠團(tuán)得表面活性劑疏水尾發(fā)生相互作用,被幾個(gè)小反膠團(tuán)所“溶解”。2024/10/1534表面性質(zhì)不同得蛋白質(zhì)可能以不同得形式溶解于反膠團(tuán)相,但對(duì)于親水性蛋白質(zhì),目前普遍接受得就是水殼模型。2024/10/1535bcda反膠團(tuán)得溶解作用2024/10/1536反膠團(tuán)有哪些有用得特征可用于生物物質(zhì)得分離？將反膠團(tuán)萃取技術(shù)與其她蛋白質(zhì)分離技術(shù)相比較,指出她們各自得適用場(chǎng)合？影響反膠束萃取蛋白質(zhì)得主要因素？

學(xué)習(xí)要求2024/10/1537從毛發(fā)中提取胱氨酸

胱氨酸就是白色六角形板狀晶體或結(jié)晶粉末,不溶于乙醇、乙醚,難溶于水。易溶于酸、堿溶液,但在熱堿溶液中可被分解。

胱氨酸比半胱氨酸穩(wěn)定,在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成半胱氨酸后參與蛋白質(zhì)合成和各種代謝過(guò)程,有促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)和防止皮膚老化等作用。2024/10/1538臨床上用于治療膀胱炎、各種禿發(fā)癥、肝炎、神經(jīng)痛、中毒性病癥、放射損傷以及各種原因引起得巨細(xì)胞減少癥,并就是治療一些藥物中毒等得特效藥。在食品工業(yè)、生化及營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究領(lǐng)域也有廣泛得應(yīng)用。胱氨酸存在于人發(fā)、豬毛、羊毛、馬毛、羽毛及動(dòng)物角等得蛋白質(zhì)中,其中人發(fā)含量最高,達(dá)17、6％。胱氨酸就是氨基酸中最難溶于水得一種,因此可利用這種特性,通過(guò)酸性水解,從廢雜豬毛、人發(fā)、雞毛、羊毛等角蛋白中,分離提取胱氨酸。2024/10/1539常規(guī)提取工藝

上清液（回收氨基酸）

廢雜毛（豬毛、人發(fā)等）

清洗

干燥廢雜毛

水解水解液

中和胱氨酸粗品

提純沉淀物（粗品）

濾液（棄去）

結(jié)晶精制

干燥

精品2024/10/1540操作步驟清洗:除去廢雜毛內(nèi)混雜得泥沙、石塊、草木、鐵雜物等,用60°C左右得熱水,加少量洗滌劑,攪拌洗滌4～6分鐘,洗去吸附在雜毛上得油脂,然后撈出,再用清水沖洗干凈,濾干,放在通風(fēng)處曬干或烘干備用。2024/10/1541按廢雜毛得量,先量取2倍30％工業(yè)鹽酸,加入到玻璃鋼或搪瓷水解罐中,通蒸氣加熱到70～80℃,立即投入已清洗曬干得廢雜毛適量,繼續(xù)加熱,間隙攪拌,使溫度均勻。升溫到100°C時(shí)開(kāi)始記溫,每隔半小時(shí)記溫1次,在1～1、5小時(shí)內(nèi)升溫至110℃左右(即罐溫),以后繼續(xù)維持罐壓14、7千帕(氣壓490千帕),水解13個(gè)小時(shí)左右(用玻璃鋼盤(pán)管加熱,水解時(shí)間可縮短為6～7小時(shí)),水解期間要有回流裝置,保證水解酸度,使水解更完全。水解時(shí)間可從水解罐內(nèi)溶液溫度達(dá)100°C時(shí)計(jì)算起。水解:2024/10/1542水解完全后,停止回流(回收得鹽酸可重用),立即趁熱過(guò)濾。這時(shí)過(guò)濾很困難,應(yīng)先用玻璃布抽濾除去大得黑腐質(zhì),然后再用雙層紗布抽濾,將濾液移到中和鍋或缸中,濾液用1:1得鹽酸沖洗2～3次,沖洗液一并倒入中和鍋或缸內(nèi),準(zhǔn)備中和。2024/10/1543將過(guò)濾好得濾液趁熱在攪拌下加入濃度30％～40％氫氧化鈉(工業(yè)燒堿)溶液,當(dāng)中和到pH值達(dá)4、0時(shí),停止加堿液,然后改用醋酸鈉飽和溶液中和到pH值為4、8左右,停止攪拌,靜置10～12小時(shí),用滌綸布過(guò)濾沉淀物,甩干或吊干(抽濾液可供回收谷氨酸或制備化學(xué)醬油),即得粗品。中和時(shí)溫度應(yīng)保持在50℃左右,而且要在半小時(shí)內(nèi)完成。中和:2024/10/1544稱(chēng)取適量得胱氨酸粗品,加入粗品量13％～14％得工業(yè)鹽酸(濃度為30％),攪拌30分鐘左右,等粗品全部溶解后,再加入活性炭粉(按每100千克粗品加4～5千克活性炭粉投料),加熱到90～98℃,在此溫度下恒溫?cái)嚢?～3小時(shí)。然后過(guò)濾脫色液(回收活性炭粉,再生后可重用),濾液加熱到80～85℃,在攪拌下加入濃度30％氫氧化鈉溶液,調(diào)節(jié)pH值至4、8時(shí),停止加堿液,靜置,使結(jié)晶沉淀完全。虹吸上清液(可供回收胱氨酸和酪氨酸),底部沉淀濾干后可離心甩干或直接用吊包吊干,即得灰白色得提純胱氨酸粗品。提純:2024/10/1545稱(chēng)取適量胱氨酸提純后得粗品,加入5倍量得1:12得鹽酸,加熱到40℃時(shí),加入5％骨炭粉(按粗品量加),升溫到60℃,保溫?cái)嚢?小時(shí)。然后用布氏漏斗過(guò)濾,濾液再經(jīng)3號(hào)重熔漏斗過(guò)濾,濾液應(yīng)無(wú)色透明,如仍帶色,再進(jìn)行脫色處理。將濾液移入搪瓷缸中,攪拌下加入10％氨水調(diào)節(jié)溶液pH值至4、8,靜置5～6天,即有胱氨酸精品析出,過(guò)濾出結(jié)晶,用無(wú)離子水洗至無(wú)氯離子,用吊布吊干后放入搪瓷盤(pán)中在烘箱內(nèi)烘干(保持溫度在60℃左右)或真空干燥,即得產(chǎn)品。。精制、干燥:2024/10/1546產(chǎn)品規(guī)格和含量測(cè)定2024/10/1547產(chǎn)品規(guī)格(1)外觀:產(chǎn)品為白色有光澤得六角形片狀結(jié)晶粉末,在水中微溶,不溶于酸和有機(jī)溶劑,能溶于無(wú)機(jī)酸中。(2)熔點(diǎn):產(chǎn)品得熔點(diǎn)為258～261℃。2024/10/1548產(chǎn)品規(guī)格(3)比旋光度:產(chǎn)品在25℃得比旋光度應(yīng)為一195°C～一213°C。將樣品放在105℃恒溫烘箱中干燥2小時(shí)以上,然后精確稱(chēng)樣2克,加1摩爾／升鹽酸,將其溶解成50毫升得溶液,按中國(guó)藥典附錄所載方法測(cè)定。比旋光度計(jì)算公式:

25180—a[a]D=+1、99×(25—t)L*d2024/10/15492024/10/1550平面偏振光通過(guò)含有某些光學(xué)活性得化合物溶液時(shí),能引起旋光現(xiàn)象,使偏振光得平面向左或向右旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)得度數(shù),稱(chēng)為旋光度。藥典系用鈉光譜得D線(589、3nm)測(cè)定旋光度,測(cè)定管長(zhǎng)度為1dm,測(cè)定溫度為20℃。測(cè)定旋光度時(shí),將測(cè)定管用供試液體或溶液(取固體供試品,按各藥品項(xiàng)下得方法制成)沖洗數(shù)次,緩緩注入供試液體或溶液適量置于旋光計(jì)內(nèi)檢測(cè)讀數(shù),即得供試液得旋光度。使偏振光向右旋轉(zhuǎn)者(順時(shí)針?lè)较?為右旋,以“＋”符號(hào)表示;使偏振光向左旋轉(zhuǎn)者(反時(shí)針?lè)较?為左旋,以“－”符號(hào)表示。2024/10/1551產(chǎn)品規(guī)格(4)干燥失重:將樣品放入105℃恒溫箱中干燥至恒重,失重不得超過(guò)0、5％。(5)澄明度:精確稱(chēng)取0、5克樣品,加1﹕3鹽酸溶液10毫升,振蕩溶解,溶液應(yīng)無(wú)色透明或幾乎透明。

2024/10/15522024/10/1553產(chǎn)品規(guī)格(6)氯化物測(cè)定:精確稱(chēng)取0、25g樣品,加1mol／L硝酸10mL,使之溶解,再加水稀釋至50mL。用10mL移液管吸取10mL該溶液于一燒杯中,再加蒸餾水40mL,1mol/L硝酸1mL,1mol／L硝酸銀溶液1mL,搖勻。另外取氯化物標(biāo)準(zhǔn)液(1mL含0、01mg氯離子)7、5mL,按上法同樣處理,前者得渾濁度不應(yīng)大于后者,即含氯量≤0、05％。2024/10/1554產(chǎn)品規(guī)格(7)殘?jiān)鼫y(cè)定:分別精確稱(chēng)取樣品4克、2克各置于恒重得白磁坩鍋或白金坩鍋中,在600～800℃高溫電爐中炭化,冷卻后即可測(cè)出殘?jiān)亓?≤0、001)。2024/10/1555產(chǎn)品規(guī)格(8)重金屬檢測(cè):取上述4g樣品灼燒后得殘?jiān)糜跓?加12mL2mol／L鹽酸和0、5mL得1mol／L硝酸,在水浴上蒸干,再加11mol／L稀醋酸2mL、蒸餾水8mL,然后移入50mL納氏比色管中,加1mol／L硫化氫溶液10mL,加水至刻度,搖勻,在暗處放置10分鐘以上,與標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液比較,鉛含量不應(yīng)高于0、001。2024/10/1556產(chǎn)品規(guī)格

(9)鐵鹽檢驗(yàn):取上述2克樣品灼燒遺留得殘?jiān)跓?加2摩爾／升鹽酸12毫升、1摩爾／升硝酸0、5毫升,在水浴中蒸干,再加1﹕2鹽酸5毫升、蒸餾水10毫升,然后移入50毫升納氏比色管中,加10％硫氰酸銨溶液2毫升,如顯色,即與同樣處理后得6毫升標(biāo)準(zhǔn)液比較,不得更深(≤0、001)。2024/10/1557產(chǎn)品規(guī)格(10)酪氨酸檢測(cè):精確稱(chēng)取干燥得樣品0、1克置于試管中,加1摩爾／升硫酸甲醛溶液1毫升,煮沸半分鐘,溶液應(yīng)顯竹黃色(含量約為0、5％),不得顯竹綠色

2024/10/1558含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品