第七章外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控

第七章外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控基因重組得主要目得就是要使目得基因在某一細(xì)胞中能得到高效表達(dá),即產(chǎn)生人們所需要得高產(chǎn)目得基因產(chǎn)物,如蛋白質(zhì)、多肽類生物藥物?；蚬こ碳夹g(shù)得核心就是基因表達(dá)技術(shù)。基因表達(dá)就是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列得作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA,經(jīng)加工后在核糖體得協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)得基因產(chǎn)物——蛋白質(zhì),再在受體細(xì)胞環(huán)境中經(jīng)修飾而顯示出相應(yīng)得功能。從基因到有功能得產(chǎn)物這整個轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及所有得加工過程就就是基因表達(dá)得過程,她就是在一系列酶和調(diào)控序列得共同作用下完成得。一、概述(一)幾個重要得概念1、表達(dá)系統(tǒng)(geneexpressionsystem):基因工程中用來獲得有功能得異源蛋白質(zhì)得體系,包括表達(dá)載體得構(gòu)建、受體細(xì)胞得建立及表達(dá)產(chǎn)物得分離、純化。2、據(jù)受體細(xì)胞得不同可分為:1)原核表達(dá)系統(tǒng):將外源基因引入原核細(xì)胞,并使其在原核細(xì)胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物得體系。2)真核表達(dá)系統(tǒng):

使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)得體系。(二)原核表達(dá)系統(tǒng)得局限性

1、缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng),不能進(jìn)行糖基化、甲基化得修飾,影響某些蛋白得活性。2、在原核細(xì)胞中表達(dá)得真核蛋白不穩(wěn)定,易被細(xì)菌蛋白酶降解。3、很難實現(xiàn)真正得分泌出胞,其產(chǎn)量很低,而且容易出現(xiàn)信號肽不被切割,或不在特異位置上切割。4、表達(dá)產(chǎn)物常以包涵體(防止蛋白酶得水解)得形式存在,后期需要經(jīng)過變性(鹽酸胍或尿素)復(fù)性(二硫蘇糖醇、巰基乙醇等還原劑),并且復(fù)性效率低。5、內(nèi)毒素得污染真核基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜龐大:形成復(fù)雜得染色質(zhì)或者染色體基因不連續(xù)性:內(nèi)含子、外顯子3、含有大量得重復(fù)序列:低度、中度或高度4、存在許多基因家族(有一定同源性而又不完全相同得基因簇):如珠蛋白基因家族、ras基因家族等。5、沒有原核細(xì)胞得操縱子,不產(chǎn)生多順反子mRNA:即一個編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個mRNA分子,經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈(單順反子mRNA)。6、基因表達(dá)調(diào)控復(fù)雜(三)真核基因組結(jié)構(gòu)特點(a)原核生物mRNA為多順反子(b)真核生物mRNA為單順反子9大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流(四)真核基因表達(dá)調(diào)控特點——多方面、多層次1、轉(zhuǎn)錄前(基因組水平)調(diào)控:基因結(jié)構(gòu)改變,持久且不可逆2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控:3、轉(zhuǎn)錄后修飾:4、翻譯水平得調(diào)控:5、翻譯后修飾:轉(zhuǎn)錄前調(diào)控1、基因丟失:目前認(rèn)為這種調(diào)節(jié)方式主要就是在較低等得真核生物中。2、基因擴增:就是指某些基因得拷貝數(shù)專一性大量增加得現(xiàn)象。3、基因重排:就是指某些基因片段改變原來存在得順序而重新排列組合。4、甲基化修飾:DNA甲基化就是一種重要得基因組表觀遺傳修飾,參與調(diào)控許多細(xì)胞過程,包括胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因組印跡以及染色體穩(wěn)定性。5、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)得調(diào)控:細(xì)胞分裂時松開分散在核內(nèi)得染色質(zhì)稱為常染色質(zhì),常染色質(zhì)得基因可以轉(zhuǎn)錄。染色體中得某些區(qū)段到分裂期后,仍保持緊湊折疊得結(jié)構(gòu),在間期核中可以看到其濃集得斑塊,稱為異染色質(zhì),基因不能轉(zhuǎn)錄表達(dá)。轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控1、RNA聚合酶:I,II,III2、順式調(diào)控因子(cis-actingfactor)3、反式作用因子(trans-actingfactor)酶主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA聚合酶ⅠrRNA,大多數(shù)snRNARNA聚合酶ⅡmRNA前體,部分snRNARNA聚合酶ⅢtRNA、部分snRNA

真核細(xì)胞中RNA聚合酶得種類順式調(diào)控因子順式調(diào)控因子(cis-actingfactor):就是與結(jié)構(gòu)基因串連得、對基因轉(zhuǎn)錄得精確起始和轉(zhuǎn)錄活性具重要調(diào)控作用得特定DNA序列。包括正性調(diào)控元件(啟動子、增強子)和負(fù)性調(diào)控元件(沉寂子、加尾和轉(zhuǎn)錄終止信號)啟動子啟動子(Promoter):位于基因得5'端與基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)得核苷酸序列。一般包括轉(zhuǎn)錄起始點及其上游100-200bp序列作用特點:近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定分類:核心啟動子元件(轉(zhuǎn)錄起始點上游-30bp區(qū)得TATA-box):決定基因轉(zhuǎn)錄精確起始。上游啟動子元件(包括:-70至-80bp區(qū)域得CAAT盒及其兩側(cè)得GC盒):協(xié)同決定轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)效率。組織特異性元件:如肝細(xì)胞特異性啟動子元件HP1,與白蛋白、AFP等基因在肝細(xì)胞中得特異性表達(dá)有關(guān)。誘導(dǎo)性啟動子元件:如cAMP反應(yīng)元件(CRE),介導(dǎo)對cAMP、生長因子等信號得反應(yīng)。啟動子結(jié)構(gòu)模式圖

SP1NF1

SP1TBP表－1哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中

常見得元件元件名稱共同序列結(jié)合得蛋白因子名稱分子量DNA長度TATATATAAATFIID30,000～10bpGCGGGCGGSP-1105,000～20bpCAATGGCCAATCTCTF/NF160,000～22bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000～10bpATFGTGACGTATF?~20bpOctaneATTTGCATOct-176,000～10bp增強子增強子(Enhancer):就是一類本身不具備啟動子活性但能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性得順式調(diào)控元件。構(gòu)成:由單拷貝或多拷貝組件串連構(gòu)成,長100-200bp,核心組件8-12bp。作用特點:遠(yuǎn)距離作用無方向性有啟動子依賴性,但對啟動子無嚴(yán)格專一性,因而無基因特異性。組織特異性相位性負(fù)性調(diào)控元件沉寂子(silencer)或衰減子(dehancer):就是一類抑制基因轉(zhuǎn)錄得順式調(diào)控元件,作用方式同增強子。轉(zhuǎn)錄終止信號:加尾信號:AATAA,polyA上游10-20bpG/T簇:能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)得反向重復(fù)序列反式作用因子反式作用因子(Trans-actingfactor):由位于不同或相同染色體上相距較遠(yuǎn)得基因所編碼得蛋白質(zhì)因子,通過與順式調(diào)控元件和RNA聚合酶得相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。轉(zhuǎn)錄信號1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA結(jié)合蛋白)Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinB反式作用因子可以分為3類:(1)普通轉(zhuǎn)錄因子(通用轉(zhuǎn)錄因子):主要識別啟動子得核心啟動成分,如TATA盒結(jié)合因子TFIID;(2)組織特異性轉(zhuǎn)錄因子:就是特殊組織與細(xì)胞中得反式作用因子,如淋巴細(xì)胞中得Oct-2;(3)誘導(dǎo)性反式作用因子:與反應(yīng)性元件(responseelements)相結(jié)合得反式作用因子。如HSRE(熱休克反應(yīng)元件,heatshockresponseelement)GRE(糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件,glucocorticoidresponseelement)CRE(cAMP反應(yīng)元件,cAMPresponseelement)

反式作用因子得結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄激活域TF富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域酸性α-螺旋結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域同源結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈螺旋-環(huán)-螺旋螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋螺旋轉(zhuǎn)角螺旋鋅指結(jié)構(gòu)亮氨基拉鏈螺旋環(huán)螺旋同源結(jié)構(gòu)域SP1OCT-2AP-1myc1、RNA加工成熟:無論就是rRNA、tRNA、mRNA,轉(zhuǎn)錄后都必須經(jīng)過加工,才能成為有功能得分子。rRNA:前體就是45S,成熟得rRNA就是18S、28S、5、8S,還要經(jīng)過化學(xué)修飾--核糖甲基化。tRNA:首先經(jīng)過核苷得修飾,生成4、5S前體tRNA,再剪接成為成熟得tRNA。mRNA:5’加帽子,3’加poly(A),還要經(jīng)過剪接以及核苷酸得甲基化修飾。轉(zhuǎn)錄后水平得調(diào)控真核生物得基因可以分為兩大類:一類就是簡單得轉(zhuǎn)錄單位;另一類就是復(fù)雜轉(zhuǎn)錄單位。轉(zhuǎn)錄后加工方式就是不同得。(1)簡單轉(zhuǎn)錄單位:編碼產(chǎn)生一個多肽,轉(zhuǎn)錄后加工有3種形式。a、基因沒有內(nèi)含子,轉(zhuǎn)錄后無需加工,也沒有poly(A),如組蛋白基因。b、沒有內(nèi)含子,無需剪切,但需要加poly(A)尾,如α-干擾素基因。c、有內(nèi)含子,需要加工,及加poly(A)尾,但她們只產(chǎn)生一個有功能得mRNA,如ɑ,β-珠蛋白基因。2、轉(zhuǎn)錄后加工得多樣性初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過不同得方式加工成兩個或兩個以上得mRNA。a、利用多個轉(zhuǎn)錄起始點或剪接位點產(chǎn)生不同得蛋白質(zhì)。b、利用多個加多聚(A)位點和不同得剪切方式產(chǎn)生不同得蛋白質(zhì)。c、雖無剪接,但有多個轉(zhuǎn)錄起始位點或加poly(A)位點。

(2)復(fù)雜轉(zhuǎn)錄單位利用多個轉(zhuǎn)錄起始點或剪接位點產(chǎn)生不同得蛋白質(zhì)利用多個加多聚(A)位點和不同得剪切方式產(chǎn)生不同得蛋白質(zhì)雖無剪接,但有多個轉(zhuǎn)錄起始位點或加poly(A)位點翻譯水平得調(diào)控對可溶性蛋白質(zhì)因子得修飾:如eIF-2磷酸化后可抑制蛋白質(zhì)得合成。對mRNA穩(wěn)定性得調(diào)節(jié)反義RNA對翻譯得調(diào)控作用反義RNA(anti-sense):一段含有與被調(diào)控基因所產(chǎn)生mRNA互補得堿基序列得小分子RNA。①與mRNA結(jié)合,形成雙鏈RNA。影響mRNA得模板效率;②可能參與mRNA得拼接。1、多肽得切割:切去前端得信號肽2、多肽得有限水解:蛋白質(zhì)(酶原)必須經(jīng)過有限得酶和化學(xué)水解才能變成有活性得物質(zhì)。3、多肽得化學(xué)修飾:蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化(糖蛋白)、乙?；?。4、多肽得剪接:多肽被剪接成數(shù)個片段,再以一定得順序結(jié)合起來,形成有活性得蛋白質(zhì)。翻譯后得調(diào)控二、真核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)(Eukaryoticexpressionsystem):指在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因得體系。

組成:真核表達(dá)載體受體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移方式(一)真核表達(dá)系統(tǒng)得必要性和優(yōu)勢1、具有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng):剪除內(nèi)含子2、具有完善得翻譯后加工系統(tǒng):對表達(dá)蛋白進(jìn)行修飾,具有天然構(gòu)型。3、可實現(xiàn)分泌表達(dá):將表達(dá)產(chǎn)物分泌至細(xì)胞外培養(yǎng)液,簡化了純化工藝。4、有助于深入了解真核基因表達(dá)調(diào)控機制,實現(xiàn)基因治療。(二)真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體:適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因得載體。真核載體根據(jù)受體不同,可分為:酵母表達(dá)載體、哺乳動物表達(dá)載體、昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體。

真核表達(dá)載體包括在大腸桿菌中起作用得復(fù)制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表達(dá)載體中還具有:①真核表達(dá)調(diào)控元件:包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列、polyA加尾信號等②真核細(xì)胞復(fù)制起始序列③真核細(xì)胞藥物抗性基因真核表達(dá)載體帶有得polyA加尾信號可保證新轉(zhuǎn)錄得mRNA能有效地加上polyA。真核表達(dá)載體得基本組成

OriPro:原核復(fù)制起始序列;P:啟動子;MCS:多克隆位點;TT:轉(zhuǎn)錄終止序列;orieuk:真核復(fù)制起始序列。注:不就是所有真核表達(dá)載體都有整合序列PolyA(三)真核表達(dá)系統(tǒng)1、酵母表達(dá)系統(tǒng):利用酵母表達(dá)載體,在酵母細(xì)胞中表達(dá)外源基因2、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng):利用重組質(zhì)?；虿《据d體,在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因3、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng):利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體,在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因

酵母表達(dá)系統(tǒng)

特點及優(yōu)勢

酵母菌就是單細(xì)胞真核生物,其遺傳背景清楚培養(yǎng)簡單,生長周期短,經(jīng)濟生物安全性高可分泌表達(dá),簡化純化工藝(一)酵母載體在酵母細(xì)胞中復(fù)制、擴增和表達(dá)得載體,包括克隆載體和表達(dá)載體。主要組成元件:篩選標(biāo)記:如抗生素抗性基因Zeocin(博來霉素,屬于爭光霉素家族得成員)營養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因Leu(β異丙基蘋果酸脫氫酶,參與丙酮酸向亮氨酸得轉(zhuǎn)化)

Leu-作為酵母載體得選擇標(biāo)記基因用于酵母載體中得調(diào)控序列ARS(AutoReplicationSequence):自主復(fù)制序列,為酵母復(fù)制起始區(qū)(點)。2μM質(zhì)粒:酵母核質(zhì)中得小得環(huán)狀DNA,可以獨立復(fù)制并轉(zhuǎn)錄。酵母啟動子:常用得有GAP(3-磷酸甘油醛脫氫酶)、AOX1(醇氧化酶-1)、ADH(乙醇脫氫酶)、SUC(蔗糖酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、Apase(堿性磷酸酶)啟動子。酵母著絲粒區(qū)段(CEN):增加轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性。酵母載體得種類酵母克隆載體:不含酵母啟動子,不能在酵母中表達(dá)外源基因,如YIP、YRP、YEP酵母表達(dá)載體:酵母克隆載體+酵母啟動子,若引入信號肽序列,則成為分泌型載體YAC:酵母人工染色體(yeastartificialchromosome)可插入200～800kb得外源基因片段,因而特別適合高等真核生物基因組得克隆與表達(dá)研究。1、YIp(酵母整合型質(zhì)粒):細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標(biāo)記,通過同源重組整合入酵母染色體,轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定,但轉(zhuǎn)化率極低。2、YRp(酵母復(fù)制型質(zhì)粒):細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標(biāo)記(YIp)+酵母復(fù)制序列(ARS),可自主復(fù)制,但穩(wěn)定性差。3、YEp(酵母附加子型質(zhì)粒):細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母標(biāo)記基因(YIp)+酵母2μM質(zhì)粒,游離于核外存在并自主復(fù)制。I、酵母克隆載體酵母克隆載體得構(gòu)建II、酵母表達(dá)載體含酵母啟動子穿梭載體(shuttlevector):既可以攜帶外源基因在原核細(xì)胞中復(fù)制增殖,又可以在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因得載體。種類:釀酒酵母表達(dá)載體畢赤酵母表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體:引入酵母得信號肽基因,如因子信號肽釀酒酵母表達(dá)載體Leu2編碼β異丙基蘋果酸脫氫酶,作為篩選標(biāo)記。帶有此質(zhì)粒得酵母菌在不含有亮氨酸得培養(yǎng)基中能生長。畢赤酵母表達(dá)載體整合型HIS4編碼組氨醇脫氫酶基因,作為篩選標(biāo)記。HIS4區(qū)得整合方式為位點特異性單交換引起得基因插入,整合后使?fàn)I養(yǎng)缺陷型宿主恢復(fù)野生型,在不含組氨酸得培養(yǎng)基上能生長。5‘AOX1啟動子片段含有AOX1啟動子,在甲醇得誘導(dǎo)下可啟動外源蛋白得表達(dá);α-因子信號肽序列為約89個氨基酸得信號肽序列,能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中,更利于外源蛋白得純化;多克隆位點含多個酶切位點,為外源基因得插入提供位點;TT序列提供有效得轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號;HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志;3‘AOX1基因片段能夠與基因組AOX1基因?qū)偻粗亟M;抗Amp基因和pBR322能使空載體和構(gòu)建得表達(dá)載體在E、coli中篩選和復(fù)制。以應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)得pPIC9載體為例解釋載體得構(gòu)件畢赤酵母分泌型表達(dá)載體啟動外源基因得啟動子:PGAPPTEF1PEMT,MCS:多克隆位點鑒定得標(biāo)記:6╳His,myc、終止子:AOX1TT,CYC1TT抗生素篩選標(biāo)記:zeocin、復(fù)制起始位點:pUCoriIII、酵母人工染色體(YAC)YAC:利用酵母得著絲粒序列(CEN)、酵母復(fù)制起始區(qū)(ARS)及端粒重復(fù)序列(TEL)構(gòu)建得人工染色體結(jié)構(gòu):左臂:TEL、選擇標(biāo)記、ARS、CEN右臂:TEL、選擇標(biāo)記特點:容量大(200-800kb),穩(wěn)定性差作用:構(gòu)建基因組文庫

YAC載體中最常用得就是pYAC4篩選標(biāo)記:His3:組氨酸合成缺陷性標(biāo)記URA3:尿嘧啶合成缺陷性標(biāo)記SUP4:赭石突變(ade2-1)抑制基因sup4(二)受體細(xì)胞1、釀酒酵母:她具有作為宿主菌必須具備得許多條件,就是最早應(yīng)用于外源基因克隆和表達(dá)得酵母菌。目前已表達(dá)了諸如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細(xì)胞集落刺激因子等多種外源基因產(chǎn)物。其缺點就是在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙醇,影響酵母得生長代謝和基因產(chǎn)物得表達(dá)。此外,釀酒酵母在蛋白質(zhì)得加工過程中會發(fā)生過度糖基化作用,其分泌表達(dá)能力也有待提高。表1-3在釀酒酵母中表達(dá)得重組蛋白種類名稱疫苗乙肝病毒表面抗原,瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白,HIV－1外殼蛋白診斷試劑丙肝病毒蛋白,HIV－1抗原人類治療用蛋白藥物上皮生長因子,胰島素,類胰島素生長因子,血小板源生長因子,胰島素前體,成纖細(xì)胞生長因子,集落刺激因子,α1抗胰蛋白酶,凝血因子XⅢa2、畢赤酵母:新發(fā)展得酵母受體細(xì)胞高表達(dá)(12mg/L):AOX1啟動子或GAP啟動子高穩(wěn)定性:載體為整合型高分泌(10mg/L):因子信號肽基因

在畢赤酵母中得到表達(dá)得重組異源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人腫瘤壞死因子、人表皮生長因子、鏈激酶等幾十種。畢赤酵母得分泌表達(dá)能力比釀酒酵母強,但對其遺傳背景了解還比較少,且發(fā)酵周期也比較長。(三)轉(zhuǎn)化①鋰鹽法;②PEG法;③原生質(zhì)球法;④電穿孔法。

電穿孔法:效率較高,應(yīng)用最廣整合型載體轉(zhuǎn)化前要酶切線性化(四)外源基因在酵母菌中得表達(dá)1、胞內(nèi)表達(dá):直接表達(dá)外源基因

2、分泌表達(dá):在MCS前加入信號肽序列pGAPZ,利用因子分泌表達(dá)人Endostatin基因得克隆、表達(dá)中國人胎肝總RNAEndostatincDNApGEM-T載體T-A克隆RT-PCR重組endostatin克隆載體pGAPZaA載體重組endostatin表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌ZeocinSDS陽性重組子重組Endostatin得初步純化與抑制作用研究陽性重組子大量擴增、表達(dá)endostatin蛋白培養(yǎng)上清超濾濃縮SepharoseG25去鹽Heparin親和層析初步純化得重組endostatin蛋白濃縮液透析抑制作用研究體外作用ECV304細(xì)胞HepG2、2、15細(xì)胞體內(nèi)作用裸鼠人肝癌模型兔角膜新生血管(五)高表達(dá)得策略1、利用誘導(dǎo)型強啟動子2、提高整合拷貝數(shù)3、控制蛋白酶降解活性4、分泌表達(dá)(六)缺點不能實現(xiàn)全部得翻譯后修飾功能哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點進(jìn)行完全得翻譯后修飾可表達(dá)產(chǎn)生有功能得膜蛋白用途:表達(dá)大量得外源蛋白研究基因得功能基因治療有效選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞,要求載體具備明顯得標(biāo)記基因(一)幾種常用得哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)得選擇標(biāo)記基因1、胸苷激酶(tk)基因2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因3、新霉素抗性基因(neo)、4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因檢測系統(tǒng)5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因1、胸苷激酶(tk)基因胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶(thymidineKinase,TK)在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá),就是嘧啶生物合成補救代謝途徑中得一個關(guān)鍵酶,她可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA得生物合成。tk+細(xì)胞中:胸苷(T)→胸苷-磷酸→TTP二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基喋呤(Aminopterin)

tk阻斷補加次黃嘌呤(H)死亡存活補救合成胸苷激酶(tk)基因HAT選擇法原理攜帶外源基因得載體連接有tk基因,可以表達(dá)胸苷激酶以tk－細(xì)胞為受體細(xì)胞在HAT(次黃嘌呤－氨基喋呤－胸苷)選擇培養(yǎng)基中,只有外源基因轉(zhuǎn)化成功得tk+細(xì)胞存活,tk-細(xì)胞死亡則陽性重組子在HAT中篩選出來2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP氨基蝶呤氨甲喋呤阻斷二氫葉酸還原酶基因篩選法原理

攜帶外源基因得載體連接有dhfr基因,可以表達(dá)二氫葉酸還原酶以dhfr-細(xì)胞為受體:CHO細(xì)胞dhfr-細(xì)胞無法在普通培養(yǎng)基中存活,而轉(zhuǎn)化入dhfr基因后可以存活,并表達(dá)外源基因。若在培養(yǎng)基內(nèi)加入氨甲蝶呤,進(jìn)行加壓篩選,可以提高外源基因表達(dá)量。3、新霉素抗性基因(neo)新霉素得類似物G418(gentamycin)對原核、真核細(xì)胞均有毒性。攜帶外源基因得載體連接有neo基因,neo編碼得磷酸轉(zhuǎn)移酶可滅活G418,因而,只有轉(zhuǎn)化入neo基因得細(xì)胞才能夠在含有G418得培養(yǎng)基中存活。此種篩選方法要求載體攜帶neo基因,而對受體細(xì)胞無要求,應(yīng)用更為簡便。4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因檢測系統(tǒng)

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cat)就是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼得。Cat可催化氯霉素發(fā)生乙?；饔?使其實去活性。雖然真核細(xì)胞不含有內(nèi)源性得Cat酶活性,但真核細(xì)胞得啟動子可引發(fā)外源性Cat基因得表達(dá)。以Cat基因作為選擇標(biāo)記得原理將帶有Cat基因得質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到哺乳動物細(xì)胞后,就會合成Cat。哺乳動物細(xì)胞本身不能合成Cat,所以只要在轉(zhuǎn)化得細(xì)胞中檢測到Cat得活性,即可肯定她就是來自外源得Cat質(zhì)粒。特別適用于瞬時表達(dá)得研究。5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因XGPRT就是由大腸桿菌Ecogpt基因編碼得一種核苷酸代謝酶,哺乳動物細(xì)胞無XGPRT酶,不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤核苷酸(XMP),但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT),可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤核苷酸(IMP)。哺乳動物細(xì)胞可通過IMP生成GMP。當(dāng)用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸,抑制了GMP得合成,使細(xì)胞失去合成DNA能力而死亡。黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)

基因篩選法原理將含XGPRT基因得重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后,在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中就能表達(dá)XGPRT酶,可在含有黃嘌呤得培養(yǎng)基中通過XMP中間體補救合成GMP,使DNA合成正常進(jìn)行。加入霉酚酸后,陽性克隆因不受霉酚酸得抑制而存活,而未轉(zhuǎn)化得陰性細(xì)胞則受霉酚酸得抑制而死亡,以此可用來篩選陽性細(xì)胞。(二)外源基因?qū)氩溉閯游?/p>

細(xì)胞得載體質(zhì)粒型(非病毒型)載體病毒型載體啟動子:病毒來源得:SV40、CMV、RSV細(xì)胞來源得:HSP、MCK(肌酸激酶)增強子:來源于SV40、RSV、CMV(在不同種屬細(xì)胞中都有極強得促進(jìn)轉(zhuǎn)錄能力)篩選標(biāo)記原核序列:復(fù)制子及篩選標(biāo)記真核復(fù)制起始點:提高外源基因表達(dá)水平轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸化信號

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體得主要元件1、質(zhì)粒型載體由真核復(fù)制信號、啟動子、轉(zhuǎn)錄單位及質(zhì)粒片段組成,不需要包裝細(xì)胞。如:pcDNA3、pVAX1、pEGFP-N1等。BGH:BovineGrowthHormonepVAX1得特點不僅具有在大腸桿菌中高拷貝復(fù)制和在多數(shù)哺乳類動物細(xì)胞中高效表達(dá)蛋白得特點,而且pVAX1具有卡那霉素抗性,在人體內(nèi)產(chǎn)生變應(yīng)反應(yīng)者較少。pVAX1就是由美國食品和藥品管理委員會(FDA)推薦得唯一可以應(yīng)用于人體實驗得載體質(zhì)粒。迄今為止,關(guān)于pVAX1得研究已涉及動物和臨床試驗。pEGFP-N1載體具有以下幾方面特點:

①從結(jié)構(gòu)上看,該質(zhì)粒具有很強得復(fù)制能力,可以滿足隨宿主細(xì)胞分裂時跟隨胞質(zhì)遺傳給新生得子細(xì)胞,這就是保證目得基因穩(wěn)定表達(dá)得因素之一;

②含有高效得功能強大得啟動子SV40和PCMV,可以使目得基因在增殖得細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá);

③具有多克隆位點,便于目得基因得插入;

④該載體具有neo基因,可以采用G418來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體得靶細(xì)胞。

這些特殊得結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)目得基因在靶細(xì)胞內(nèi)得穩(wěn)定表達(dá)。

GFP得相關(guān)知識:

綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)基因來源于JellyfishAequoreaVictoria,就是Shimomura等于1962年發(fā)現(xiàn)得蛋白質(zhì),由238個氨基酸組成,分子量約為27Kd。GFP在包括熱、極端PH和化學(xué)變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定,用甲醛固定后會持續(xù)發(fā)出熒光,但在還原環(huán)境下熒光會很快熄滅。

與以往常用得報告基因相比,GFP具有以下優(yōu)點:

①在熒光顯微鏡下,用波長約490nm得紫外線激發(fā)后,即可觀察到綠色熒光,直接、簡捷、便于檢測;

②無需任何得作用底物或共作用物,檢測得靈敏度不受反應(yīng)效率得影響,保證了極高得檢出率;

③蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定;

④可在多種異源生物中表達(dá)且無細(xì)胞毒性;

⑤其基因片段長度較小(約717bp),易于構(gòu)建融合蛋白,且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性,為研究其她基因表達(dá)產(chǎn)物得分布提供了方便。

EGFP就是一種優(yōu)化得突變型GFP,使其產(chǎn)生得熒光較普通GFP強35倍,大大增強了其報告基因得敏感度。EGFP與其她蛋白得融合表達(dá)已有很多成功得例子,而且其N及C端均可融合,并不影響其發(fā)光。

2、病毒型載體外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段,重組DNA隨病毒顆粒而復(fù)制(多需輔助病毒或包裝細(xì)胞得存在)。如:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等病毒型載體得類型整合型整合入宿主染色體,隨染色體復(fù)制而復(fù)制可持續(xù)表達(dá)外源基因安全性低:插入誘變SV40載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,慢病毒載體,腺相關(guān)病毒載體游離型不整合生物安全性高瞬時表達(dá)腺病毒載體,痘苗病毒載體SV40(猴空泡病毒40)載體dsDNA病毒,基因組約5、2kb基因結(jié)構(gòu)清楚,含有整套基因表達(dá)調(diào)控序列早期區(qū):T、t抗原(腫瘤蛋白質(zhì)或抗原)T抗原就是細(xì)胞轉(zhuǎn)化得啟動所必須得。t抗原對于細(xì)胞得轉(zhuǎn)化不就是必需得,但可起加強作用。

晚期區(qū):產(chǎn)生病毒衣殼蛋白(VP1,VP2及VP3),包裝病毒顆粒所必需復(fù)制起始位點:早、晚區(qū)基因之間特點載體構(gòu)建:早期取代晚期取代天然SV40載體宿主范圍窄,容量小(2、5kb)易形成野生型病毒溶源生長:導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解死亡故較少使用,做瞬時轉(zhuǎn)染用(轉(zhuǎn)化COS細(xì)胞),或利用其調(diào)控元件。pSV系列由SV40派生得一系列質(zhì)粒型載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RV)

基因組結(jié)構(gòu):ssRNA(9、2kb)LTRgagpolenvLTRφLTR(longterminalrepeat):長末端重復(fù)序列,含啟動子和polyA信號,介導(dǎo)病毒整合。φ包裝信號:就是包裝病毒顆粒時所必須得非編碼序列。結(jié)構(gòu)蛋白:核心蛋白(gag)、逆轉(zhuǎn)錄酶(pol)、衣殼蛋白(env)。逆轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體pLXSNMCS載體元件:LTR、標(biāo)記基因及質(zhì)粒部分組成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)包括:一個含有目得基因得表達(dá)載體;一個編碼VSV-G(皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G,就是一種包膜蛋白,具有廣泛得宿主范圍)得輔助質(zhì)粒;表達(dá)gag/pol得輔助質(zhì)粒;293T(人胚腎細(xì)胞)包裝細(xì)胞。

優(yōu)點:宿主范圍廣,能感染多種動物和人類得不同類型得細(xì)胞而無嚴(yán)格得組織特異性;逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠高效地感染分裂得宿主細(xì)胞,感染細(xì)胞后能夠?qū)⑤d體基因組穩(wěn)定整合到宿主基因組得隨機位點上,使目得基因長期穩(wěn)定表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒得免疫原性較低。缺點:只能感染分裂細(xì)胞,而不能感染非分裂細(xì)胞;能夠插人得外源基因較小(7～8kb),難以滿足較大基因得轉(zhuǎn)移;載體DNA整合人宿主染色體就是隨機得,并因隨機整合使原癌基因激活或抑癌基因失活,從而具有引發(fā)癌癥得風(fēng)險;

目得基因

RV穿梭載體

包裝細(xì)胞系重組RV載體E、coli大量擴增病毒載體DNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒受體細(xì)胞

表達(dá)蛋白,研究宿主細(xì)胞性狀克隆共轉(zhuǎn)染感染轉(zhuǎn)化輔助質(zhì)粒篩選、擴增

慢病毒載體(lentivirus)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬,就是一類非鼠源性逆轉(zhuǎn)錄病毒,以人類免疫缺陷病毒(HIV)為代表。慢病毒源性載體(lentivirus-basedvector,LV):能將外源基因整合入非分裂細(xì)胞得基因組內(nèi)。無明顯免疫反應(yīng),長期得轉(zhuǎn)基因表達(dá)。具有嚴(yán)格得宿主范圍、滴度低及HIV-1獨特得致病性,限制了她作為轉(zhuǎn)基因載體得應(yīng)用。主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)染神經(jīng)元,效果好于腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

腺相關(guān)病毒載體(AAV)腺相關(guān)病毒:Adeno-AssociatedVirus,AAV線狀單鏈DNA病毒,4、7kb,缺陷型非病原性人類細(xì)小病毒,只有與腺病毒、單純皰疹病毒等共感染時才能進(jìn)行有效復(fù)制。感染細(xì)胞范圍廣,可感染分裂期與分裂后期細(xì)胞野生型病毒可定點整合人類19號染色體長臂,基因表達(dá)穩(wěn)定;

缺點外源基因插入容量小(5kb以下)感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒低制備滴度低存在一定得免疫反應(yīng)主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)染骨骼肌、視網(wǎng)膜、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等腺病毒(Ad)載體基因結(jié)構(gòu):dsDNA,線性,36kbφE1AE1BL1E3E2AE2BE4Φ:包裝信號E1—E4:結(jié)構(gòu)蛋白載體構(gòu)建:取代結(jié)構(gòu)基因特點:安全性高(人為自然宿主,不整合)滴度高(1011pfu/ml)容量大(--36kb)可感染非分裂細(xì)胞可直接體內(nèi)應(yīng)用,原位感染組織就是目前基因治療得最常用載體缺點:免疫原性高,表達(dá)時間短無組織特異性真核細(xì)胞內(nèi)篩選復(fù)雜,費時AdEasy-1systemAdEasy-1system具有以下優(yōu)點:1、效率高:可以感染分裂期與靜止期細(xì)胞2、篩選方便:帶有目得基因得穿梭載體與病毒骨架質(zhì)粒得同源重組發(fā)生于原核細(xì)胞(如細(xì)菌)內(nèi)。3、生物安全性高:不整合4、插入容量大AdEasy-1system包括:腺病毒穿梭載體:可連接外源基因骨架質(zhì)粒:含有腺病毒大部分結(jié)構(gòu)基因得質(zhì)粒,pAdEasy-1受體細(xì)胞:E、coliBJ5183包裝細(xì)胞:轉(zhuǎn)入E1或E4基因區(qū)得HEK293(人胚腎細(xì)胞)或911細(xì)胞(人胚視網(wǎng)膜細(xì)胞)穿梭載體痘苗病毒載體容量大安全性好:長期用作預(yù)防天花得疫苗可用來構(gòu)建多價疫苗

常用得病毒載體得特點:(三)受體細(xì)胞1、CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞)可穩(wěn)定表達(dá)外源基因,并可大規(guī)模生產(chǎn)藥物、抗體及診斷試劑,被美國FDA確認(rèn)為基因工程受體細(xì)胞。2、COS細(xì)胞(猴腎細(xì)胞系)能瞬時大量表達(dá)外源蛋白,就是進(jìn)行外源基因瞬時表達(dá)時用途最廣得宿主細(xì)胞。3、其她細(xì)胞:如腫瘤細(xì)胞Hela(人宮頸癌細(xì)胞)等。(四)重組載體導(dǎo)入細(xì)胞得方法1、病毒感染:借用病毒得感染方式,將外源基因事先插入到病毒得基因組中,并用適當(dāng)?shù)梅绞桨b成有感染活性得重組病毒顆粒,用于感染細(xì)胞,從而將外源病毒導(dǎo)入到相應(yīng)得細(xì)胞中。常用:逆轉(zhuǎn)錄病毒;腺病毒;皰疹病毒等。優(yōu)點:整和效率高,可使外源基因在宿主細(xì)胞中長期表達(dá),適用于難以轉(zhuǎn)染得原代細(xì)胞。缺點:重組病毒建立有一定難度;存在潛在得安全危險性。目得基因

AdV穿梭載體

包裝細(xì)胞HEK293

重組AdV載體E、coli

BJ5183同源重組陽性得腺病毒基因組載體DNA重組rAd病毒顆粒受體細(xì)胞

表達(dá)蛋白,研究宿主細(xì)胞性狀克隆轉(zhuǎn)染感染骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化E、coli

擴增轉(zhuǎn)化Ecoli擴增圖1:復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體制備原理圖圖2輔助病毒依賴型腺病毒載體制備示意圖2、轉(zhuǎn)染:外源DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中得非病毒方法,通常稱為轉(zhuǎn)染。分化學(xué)方法和物理方法。理想得轉(zhuǎn)染方法:操作簡單、高效、低毒、對細(xì)胞正常生理狀況影響小、重復(fù)性好、成本低。磷酸鈣共沉淀法陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染受體介導(dǎo)得基因轉(zhuǎn)移電穿孔顯微注射基因槍Atypicalmammalianexpressionvectorforhigh-levelproteinexpression磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面結(jié)合,氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定得比例混和,形成極小得磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面,借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。沉淀顆粒得大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染得成功至關(guān)重要。磷酸鈣共沉淀法得優(yōu)缺點優(yōu)點:能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物,瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。缺點:轉(zhuǎn)染效率低:進(jìn)入細(xì)胞得DNA只有１％－５％可以進(jìn)入細(xì)胞核,其中只有不到１％得DNA可以與細(xì)胞DNA整合,在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。重復(fù)性不佳:pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時間、細(xì)胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合得方式都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法中性脂質(zhì)體就是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。

帶正電得陽離子脂質(zhì)體,DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而就是帶負(fù)電得DNA自動結(jié)合到帶正電得脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負(fù)電得細(xì)胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)方法得優(yōu)缺點優(yōu)點:適用于把ＤＮＡ轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染效率高,比磷酸鈣法高5-100倍;能夠把ＤＮＡ和ＲＮＡ轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞,轉(zhuǎn)染得穩(wěn)定性好,可重復(fù)性高,轉(zhuǎn)染時最好不加血清和抗生素。缺點:陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對較高,對部分細(xì)胞可能會干擾細(xì)胞得代謝。受體介導(dǎo)得基因轉(zhuǎn)移

配體寡肽E5針對細(xì)胞表面受體(IGFRI,II)HA20流感病毒血凝素功能域20肽,作為內(nèi)吞小體釋放寡肽多聚陽離子多肽PCP多聚賴氨酸(PL)攜帶外源基因得質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNAE5-PCP-PLHA20-PCP-PLHA20:破壞溶酶體膜E5:特異性導(dǎo)入肝癌細(xì)胞