TGXAS-百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程編制說明

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）編制說明一、項目來源根據(jù)《關(guān)于下達(dá)2021年第十一批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目計劃的通知》（桂標(biāo)協(xié)﹝2021﹞28號）文件精神，由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、廣西鼎田農(nóng)業(yè)科技有限公司、廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所共同起草的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》(項目編號：2021-1104)。二、項目背景及目的意義百香果，又名雞蛋果、西番蓮果，因其果汁能散發(fā)出香蕉、草莓、菠蘿等多種水果香味而得名，素有“果汁之王”的美譽(yù)。百香果原產(chǎn)于美洲，現(xiàn)廣泛種植于熱帶、亞熱帶地區(qū)。近年來隨著我國消費者對百香果的認(rèn)可，鮮食市場、加工市場對百香果的需求量持續(xù)攀升，推動著百香果種植面積的不斷擴(kuò)大。百香果自1985年引進(jìn)我區(qū)，發(fā)展至今種植面積和產(chǎn)量均躍居全國第一，成為我區(qū)特色產(chǎn)業(yè)之一。廣西地處亞熱帶地區(qū)，種植百香果氣候條件優(yōu)越，自1985年初次引種以來，經(jīng)過政府引導(dǎo)和自發(fā)種植，于2012前后開始大規(guī)模發(fā)展，至2019年種植面積躍居全國第一，達(dá)到30余萬畝，種植百香果已成為廣西貧困地區(qū)農(nóng)民脫貧致富的有效途徑。目前，制約廣西百香果產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的首要問題是百香果病毒病和莖腐病，其中莖腐病可以通過種植抗莖腐病的品種做砧木的嫁接苗來解決；而百香果病毒病由于藥劑防治效果差只能通過種植無病毒苗和建立有效的綜合防控體系技術(shù)來解決。前人研究表明，可感染百香果的病毒近22種，其中對生產(chǎn)危害較大的有6種，包括東亞百香果病毒、百香果斑紋病毒、夜來香病毒、黃瓜花葉病毒、圣誕紅卷葉病毒和木瓜卷葉病毒。百香果感染病毒后葉片會出現(xiàn)嵌紋或花斑，影響百香果植株生長，果實呈現(xiàn)萎縮畸形硬化、果腔縮小和果汁減少，造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降，最終導(dǎo)致產(chǎn)量低、質(zhì)量差、收益減小，嚴(yán)重影響了廣西百香果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，百香果種苗的繁殖方式主要有3種：用種子播種繁殖；用滕蔓扦插繁殖；用接穗嫁接繁殖。其中，種子播種繁殖，浪費果實、生長周期長、用工量大；扦插繁殖，需要大量滕蔓、易傳播病害、加快品種退化；嫁接繁殖，種苗質(zhì)量好，但占地面積大、成苗周期長、種苗價格高。3種繁殖方法均存在占地、耗時、周期長、生長成本高等問題，若操作不當(dāng)會加快品種退化、種苗帶毒、病害增加致使產(chǎn)量降低，這些問題影響和制約了百香果的產(chǎn)量及品質(zhì)的形成。利用組織培養(yǎng)方法對百香果進(jìn)行種苗繁育，可以對百香果植株進(jìn)行脫毒，克服無性繁殖率低、繁殖速度慢的缺點，加上組織培養(yǎng)不受季節(jié)和氣候等因素的制約，具有節(jié)約土地資源，速度快，質(zhì)量高，技術(shù)密集，便于集約化管理和工廠化生產(chǎn)的優(yōu)點。近幾年廣西百香果生產(chǎn)技術(shù)取得了階段性研究進(jìn)展，形成了初步的配套技術(shù)，但距離標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化的要求尚有較大差距，特別是對百香果莖基腐病和病毒病防控問題仍沒有突破性進(jìn)展，至今尚未形成一套行之有效的百香果安全高效栽培技術(shù)體系，培育無毒種苗成為解決該問題的重要手段。目前廣西各地的育苗以小散戶為主，大多數(shù)育苗場地條件落后，育苗技術(shù)不規(guī)范，種苗質(zhì)量難以保證，種苗攜帶病毒、病菌和線蟲等情況非常普遍。玉林博白縣大多數(shù)農(nóng)戶自行扦插繁殖苗木，種苗質(zhì)量參差不齊，掛果后果實偏小，商品果率低，極大地降低了經(jīng)濟(jì)效益。桂林靈川縣的情況與博白縣相似，主要以農(nóng)戶自行育苗為主，種苗質(zhì)量難以保證。柳州柳江縣和百色田陽縣的百香果產(chǎn)業(yè)也同樣面臨著種苗問題，因缺乏育苗基地，需從外地引入種苗，不僅增加生產(chǎn)成本還影響種植成活率?，F(xiàn)階段，有關(guān)百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)還未形成一套標(biāo)準(zhǔn)的防控措施，健康種苗的快速繁育已成為制約廣西百香果高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。制定團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》是一種科學(xué)管理的有效手段，通過對育苗環(huán)境及設(shè)施、生產(chǎn)管理、組織培養(yǎng)、移栽和出圃等階段進(jìn)行規(guī)定，規(guī)范指導(dǎo)百香果組培苗的生產(chǎn)，旨在獲得健康脫毒的百香果種苗，解決當(dāng)下脫毒百香果苗短缺問題，彌補(bǔ)當(dāng)下百香果組培苗生產(chǎn)領(lǐng)域的空白，促進(jìn)廣西百香果產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。三、標(biāo)準(zhǔn)編制過程（一）成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》項目任務(wù)下達(dá)后，成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，制定了標(biāo)準(zhǔn)編寫方案，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標(biāo)準(zhǔn)研制工作，具體標(biāo)準(zhǔn)編制工作由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)究所等單位相關(guān)人員配合。（二）收集整理文獻(xiàn)資料目前國內(nèi)關(guān)于百香果組培苗生產(chǎn)的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)具體列出如下：DB45/T2094-2019黃金百香果栽培技術(shù)規(guī)程DB45/T2306-2021百香果無病毒健康種苗栽培技術(shù)規(guī)程（三）研討確定標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在對收集的資料進(jìn)行整理研究后，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組召開了標(biāo)準(zhǔn)編制會議，對標(biāo)準(zhǔn)的整體框架進(jìn)行了研究，并對標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵性問題進(jìn)行了初步探討。經(jīng)過研究，標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容包括術(shù)語和定義、外植體選擇與處理、初代培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、組培苗移栽。形成文本草案、征求意見稿2021年5月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組進(jìn)行了廣泛實地調(diào)研工作，查閱了大量的國內(nèi)外文獻(xiàn)資料，對百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，并于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所、玉林市、柳州市、桂林市、白色市等地建立百香果生產(chǎn)的種植示范園。經(jīng)編制組反復(fù)討論，形成了標(biāo)準(zhǔn)的基本構(gòu)架，對主要內(nèi)容進(jìn)行了討論并對項目的工作進(jìn)行了部署和安排。在前期工作的基礎(chǔ)之上，通過理清邏輯脈絡(luò)，整合已有的參考資料中有關(guān)百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)，并結(jié)合百香果生產(chǎn)實際要求的基礎(chǔ)上，按照簡化、統(tǒng)一等原則編制完成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》（草案）。2021年6月～2021年9月，編制組再次深入玉林市、柳州市、桂林市、白色市等百香果產(chǎn)區(qū)進(jìn)行分組調(diào)研，并向百香果組培苗生產(chǎn)科研單位、企業(yè)征求生產(chǎn)技術(shù)意見。針對百香果組培苗在栽培過程中出現(xiàn)的不同公司生產(chǎn)組培苗的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和質(zhì)量參差不齊等問題，本課題組對外植體選擇與處理、組培苗培育、移栽等生產(chǎn)過程進(jìn)行大量試驗，以生根組培苗質(zhì)量及移栽成活率為評價指標(biāo)，取得階段性進(jìn)展，確立了百香果組培苗生產(chǎn)程序。根據(jù)反饋意見及試驗成果，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組多次召開會議，對標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行反復(fù)修改和研究討論，形成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）和（征求意見稿）編制說明。四、標(biāo)準(zhǔn)制定原則1、實用性原則本文件是在充分收集相關(guān)資料和文獻(xiàn)，分析廣西百香果組培苗生產(chǎn)特點，在現(xiàn)有國家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)組培苗成產(chǎn)要求的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年實踐而總結(jié)起草的。符合當(dāng)前百香果栽培的要求，有利于行業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展，具有較強(qiáng)的實用性和可操作性。2、協(xié)調(diào)性原則本文件編寫過程中注意了與廣西百香果組培苗生產(chǎn)相關(guān)法律法規(guī)的協(xié)調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。3、規(guī)范性原則本文件嚴(yán)格按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的要求和規(guī)定編寫本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫質(zhì)量。4、前瞻性原則本文件根據(jù)當(dāng)前廣西區(qū)內(nèi)百香果生產(chǎn)單位，種苗質(zhì)量參差不齊，掛果后果實偏小，商品果率低、經(jīng)濟(jì)效益差的現(xiàn)狀，同時考慮百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)的需求，在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)了個別特色性、前瞻性和先進(jìn)性條款，作為對百香果組培苗生產(chǎn)的指導(dǎo)。五、標(biāo)準(zhǔn)主要章節(jié)內(nèi)容及確定依據(jù)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《百香果組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》主要內(nèi)容包括外植體選擇與處理、初代培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、組培苗移栽。1術(shù)語和定義變異率：形態(tài)、遺傳特性顯著有別于原品種的變異株數(shù)與植株總數(shù)的比率。2百香果組培苗生產(chǎn)（1）外植體的選擇是組培瓶苗培育的重要步驟，外植體品質(zhì)的優(yōu)劣關(guān)系到組培瓶苗品質(zhì)的優(yōu)劣。在外植體選擇時，需要選取植株健壯、無病蟲害、新抽生3d～7d的枝條，以確保外植體在培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和組培苗的品質(zhì)優(yōu)良。（2）外植體清洗是百香果組培苗技術(shù)體系建立關(guān)鍵的第一步。首先1％～2％的堿性洗滌劑浸泡20min～30min（清洗莖段表面的灰塵和附著物），流水沖洗30min～40min，將枝條剪成3cm～8cm含一個節(jié)的小段。（因為百香果品種多為雜交種，如果用種子作為外植體后代會出行性狀分離，用莖段繁殖能確保后代的生物學(xué)特性和親本保持一致）（3）外植體滅菌，在超凈工作臺上，將外植體利用升汞加“Tween-80”表面活性劑滅菌6～8min，無菌水沖洗3～5次，再用無菌紙吸干表面水分，污染率控制在5%以下。（4）培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度20℃～30℃，濕度40％～60％，光照強(qiáng)度2000Lx～3000Lx，每d光照時間10h～12h。不同的百香果品種對溫度的要求存在差異，紫果種和黃金百香果適宜溫度為24℃～30℃，哥倫比亞熱情果等喜冷涼的品種適宜溫度為20～24℃。適當(dāng)增加光照強(qiáng)度及時長有利于百香果組培苗生長，光照太弱、時長過短植株生長緩慢，且易出現(xiàn)玻璃化植株。（5）初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。接種時應(yīng)及時清除污染材料，避免污染整個培養(yǎng)瓶，導(dǎo)致失敗。（6）繼代增殖培養(yǎng)繼代增殖培養(yǎng)是組培苗生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，增殖系數(shù)大小直接決定生產(chǎn)的成本高低，培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比和培養(yǎng)條件對組培苗增殖系數(shù)起著決定性的作用。在超凈工作臺上，切割初代或繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)的幼芽，切割成含1～2個節(jié)的小段，轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種5～8段，培養(yǎng)20d～30d。（7）生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)是組培瓶苗培育的最后一個環(huán)節(jié)，也是組培瓶苗培育成功與否的關(guān)鍵步驟，百香果經(jīng)過壯苗后的芽在不同的培養(yǎng)基的根系大小、根的數(shù)量、須根上是否有根毛等指標(biāo)和生長情況都受培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑影響。組培生根苗培養(yǎng)時間在25～40d，符合標(biāo)準(zhǔn)后判定合格。3初代培養(yǎng)（1）不同莖段處理：大田莖段、大棚內(nèi)莖段、莖尖、不同成熟度的莖段、不同莖段長度；（2）不同消毒時間處理：以0.1％HgCl2為消毒劑，設(shè)置了4、6、8、10min時間處理。（3）不同初代培養(yǎng)基配方處理經(jīng)統(tǒng)計，試驗過的培養(yǎng)基配方有99種，激素包括：6-BA、NAA、KT、IBA、CPPU、TDZ、IAA、AS、生物素D、GA3；培養(yǎng)基包括：MS、1/2MS、3/2MS、2MS、MS改良；糖25g/L、30g/L，以及添加谷氨酸、活性炭、瓊脂或者卡拉膠等。（4）試驗效果1）將莖段材料扦插于大棚中用于組培外植體取材，這樣可提高外植體潔凈度，減少污染及病毒攜帶。2）目前外植體材料的處理步驟為：從大棚中選取健壯的莖段作為外植體，以帶芽的為最佳，剪去葉片，在洗潔精溶液中浸泡15min，流水沖洗30min，在超凈工作臺上剪成小段后，0.01%HgCl2中浸泡6～8min，無菌水沖洗3～5遍后接入初代培養(yǎng)基。3）接種要求莖段的腋芽基部要與培養(yǎng)基接觸，有助于腋芽吸收培養(yǎng)基養(yǎng)分。外植體盡量接長一點，一般在3～8cm，在芽沒辦法吸收培養(yǎng)基營養(yǎng)之前，長莖段可為其提供更多營養(yǎng)。用250mL的三角瓶作為培養(yǎng)容器，瓶口塞棉塞，包牛皮紙?；蛘邘笟馄可w的廣口瓶。目前三角瓶和廣口瓶都有用于材料培養(yǎng)，材料生長效果差異不明顯，生長效果依次為三角瓶＞帶透氣瓶蓋廣口瓶＞帶不透氣瓶蓋廣口瓶。5繼代增殖培養(yǎng)基篩選試驗經(jīng)試驗多種不同配方后，篩選出10個繼代增殖培養(yǎng)基配方進(jìn)行連續(xù)多代觀察，同時對比組培苗在不透氣廣口瓶、透氣廣口瓶、三角瓶中的生長情況。試驗效果：不同品種對激素濃度的要求存在差異，臺農(nóng)1號需6-BA、IBA濃度高于大黃金、小黃金、和砧木黃果，小黃金需6-BA、IBA濃度最低，各品種增殖系數(shù)在3～5倍，苗莖段較粗壯，葉片翠綠。繼代增殖過程中若激素濃度過高，組培苗會出現(xiàn)葉片卷曲，植株較矮的癥狀，更嚴(yán)重的會出現(xiàn)玻璃化。6生根培養(yǎng)基篩選采用生長素IAA、NAA、IBA及其中兩者的組合開展生根試驗，一共做了13個配方。試驗效果：各處理的生根率在40-100%，MS+IBA0.5mg/L糖30g/L+瓊脂6g/L處理生根率100%。7以‘臺農(nóng)1號’百香果為例，培養(yǎng)基篩選實驗（1）初代培養(yǎng)基篩選取臺農(nóng)1號生長健壯枝條，剪去葉片，在2%的洗潔精溶液中浸泡20min，流水沖洗30min，將枝條剪成6-8的小段，腋芽位于莖段中部，在超凈工作臺上用0.1%HgCl2浸泡6min，無菌水沖洗4次。在超凈工作臺上切去莖段切口處0.3-1cm左右，將莖段接種在初代培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH至5.8-6.0，每個三角瓶內(nèi)接種一個莖段，接種20d時，統(tǒng)計腋芽長度。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖30g/L、瓊脂6g/L。從表1可知，MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+谷氨酸50mg/L培養(yǎng)基配方莖段的腋芽生長速度最快。重復(fù)試驗得出：小黃金百香果適宜的初代培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+谷氨酸50mg/L。大黃金百香果適宜的初代培養(yǎng)基為：MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+谷氨酸50mg/L。表1‘臺農(nóng)1號’百香果初代培養(yǎng)基篩選6-BA（mg/L）IBA（mg/L）谷氨酸（mg/L）腋芽長度（cm）1.00303.511.00.1504.521.00.201.961.00.3201.772.00.1303.822.00.2202.43（2）繼代增殖培養(yǎng)基篩選將臺農(nóng)1號初代培養(yǎng)組培莖段轉(zhuǎn)入不同的繼代培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計芽增值倍數(shù)及植株生長情況。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，谷氨酸20mg/L，蔗糖30g/L、瓊脂6g/L。由表2可知，MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+谷氨酸20mg/L培養(yǎng)基配方組培苗增值倍數(shù)較高，且植株生長情況較好。經(jīng)重復(fù)試驗得出：小黃金百香果適宜的繼代增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+谷氨酸20mg/L。大黃金百香果適宜的繼代增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+谷氨酸20mg/L。表2‘臺農(nóng)1號’百香果繼代培養(yǎng)基篩選6-BA（mg/L）IBA（mg/L）芽增殖倍數(shù)植株生長情況株高較高，生長勢中株高較高，生長勢強(qiáng)1.00.24.2株高中下，生長勢弱株高中等，生長勢中株高中下，生長勢中1.00.33.5株高較矮，生長勢弱（3）生根培養(yǎng)基篩選將‘臺農(nóng)1號’組培苗轉(zhuǎn)入不同的生根培養(yǎng)基，40d后統(tǒng)計生根數(shù)、根長植株生長情況。表3‘臺農(nóng)1號’百香果生根培養(yǎng)基篩選編號處理主根數(shù)平均根長（cm）植株生長情況S1IBA0.5mg/L3.23.4根細(xì)長、米白色，植株健壯，側(cè)根較多S2IAA0.5mg/L2.63.0根細(xì)長、米白色，植株健壯，側(cè)根少S3NAA0.5mg/L6.11.9根短粗，米白色，植株健壯，側(cè)根少S4IAA1.0mg/L7.83.5根細(xì)長、米白色，植株健壯，側(cè)根少S5IBA1.0mg/L8.22.8根細(xì)長、米白色，植株健壯，側(cè)根較多8生根苗移栽移栽方法：從容器中取出組培苗，用清水洗去根部培養(yǎng)基，移栽至裝滿椰糠的托盤中，移栽后淋一次1000倍噁霉靈，之后隔10d淋一次上述溶液。30d后，植株長至5cm～7cm，將小苗移栽至盛有珍珠巖：育苗基質(zhì)比例為1：5的8cm×8cm的營養(yǎng)杯中，每個營養(yǎng)杯種植1株，移栽后淋一次1000倍惡霉靈。將生根苗分為有根、無根在不不同季節(jié)進(jìn)行移栽。春季移栽成活率最高。春季移栽成活率見表4。表4百香果組培生根苗移栽成活情況品種有根苗總數(shù)存活數(shù)有根苗移栽成活率（%）無根苗總數(shù)存活數(shù)無根苗移栽成活率（%）小黃金433172.099777.78臺農(nóng)302686.6713538.46砧