基于脂蛋白納米載體的小干擾RNA靶向遞送方法研究畢業(yè)設(shè)計

(此文檔為word格式，下載后您可任意編輯修改！)基于脂蛋白納米載體的小干擾RNA靶向遞送方法研究摘要RNA干擾作為一種治療途徑特別是惡性腫瘤的治療具有巨大潛力。然而，系統(tǒng)遞送siRNA需要高效和生物相容性的遞送手段。腫瘤細(xì)胞通過過度表達(dá)清道夫B型1受體類(SR-B1)受體以清除HDL(HDL)粒子來維持其高生長水平。本文運用這種細(xì)胞特性來實現(xiàn)高效siRNA遞送，通過siRNA偶聯(lián)重組成HDL(rHDL)納米粒子建立一種新型的siRNA制劑。這里,我們證實rHDL納米粒子促進(jìn)了siRNA體內(nèi)高效遞送。此外，概念證明治療研究中,這些納米?？梢杂行С聊瑑煞N蛋白的表達(dá)，在原位卵巢和結(jié)腸直腸癌小鼠模型中，這兩種蛋白是癌癥生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵(信號傳感器和轉(zhuǎn)錄激活因子3以及粘著斑激酶)。這些數(shù)據(jù)表白，rHDL納米粒是一種新型、高效的siRNA載體，因此。這種新型技術(shù)可以作為新型癌癥治療方法的基礎(chǔ)。介紹RNA干擾（RNAi）逐漸被認(rèn)為是一種潛在，高效的治療途徑。這個概念根源于干擾RNA（例如，小分子干擾RNA）基因沉默的能力，傳統(tǒng)治療方法很難靶向這些基因，如抗體或小分子克制劑。即使干擾RNA靶向特定基因的確很有前景的，但需要體內(nèi)高效和生物相容性的siRNA遞送手段來實現(xiàn)其完整的治療潛力。雖然一些使用脂質(zhì)體或其它納米粒子的跨膜轉(zhuǎn)運方法也已經(jīng)報道，但是因毒性和其他因素其治療應(yīng)用受到限制。因此，需要新型，更具有特定性的方法以系統(tǒng)遞送siRNA。脂蛋白，特別是HDL，是脂質(zhì)運送系統(tǒng)的必要成分。HDL在膽固醇逆轉(zhuǎn)中起著舉足輕重的作用，通過促進(jìn)外周細(xì)胞多余膽固醇返回到肝臟進(jìn)行消除（膽汁排泄或在肝腸循環(huán)使用）。關(guān)于內(nèi)源性，HDL納米粒是完全可生物降解的，并且也無引起免疫反映的相關(guān)報道。此外，眾所周知，HDL納米?？梢蕴颖芫W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吸取，比大多數(shù)藥物制劑或其他脂蛋白，他們在循環(huán)中表現(xiàn)出更長的滯留時間。HDL納米粒循環(huán)的核心部分就是攝取，通過清道夫受體B類1型（SR-B1）受體介導(dǎo)的機(jī)制，這種受體重要表達(dá)在肝臟和惡性腫瘤細(xì)胞?；隗w積小，屏蔽疏水核心，受體介導(dǎo)的攝取能力等這些有效特性，HDL納米粒是一種抱負(fù)的藥物載體。重組HDL是由人的HDL合成得到的。該rHDL納米粒的組成部分有磷脂酰膽堿，載脂蛋白A-1，膽固醇和膽甾醇酯（圖1A）。rHDL納米粒都很小，直徑約12至18納米。為了研究siRNA靶向輸送途徑，一些腫瘤細(xì)胞受體已被獲知。SR-B1受體重要在肝臟中的表達(dá)，也在腎上腺或正常卵巢組織也較小限度表達(dá)。然而，在惡性腫瘤細(xì)胞中SR-B1非常顯著表達(dá)。增長HDL攝取可使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生較高增殖率。例如，乳腺癌細(xì)胞通過增長SR-B1的表達(dá)來增長膽固醇酯的攝取。因此，考慮到SR-B1在HDL中的作用，我們認(rèn)為rHDL納米?？梢宰鳛檫x擇性輸送的有效載體。siRNA基因沉默治療非常有效，其他方法很難靶向這些基因。信號傳感器和轉(zhuǎn)錄激活因子3[STAT3]都可以介導(dǎo)正常細(xì)胞對多種細(xì)胞因子和生長因子的反映。激活STAT3是惡性腫瘤轉(zhuǎn)化和發(fā)展（例如，細(xì)胞增殖，分化和存活）的關(guān)鍵過程。雖然STAT3可以在許多實體瘤里激活，但是它在正常組織中表達(dá)，并且參與許多正常細(xì)胞過程。因此，使用小分子克制劑或其他非特異性靶向STAT3的手段也許會導(dǎo)致許多不必要的副作用，因此需要有效途徑限制毒性。同樣，粘著斑激酶（FAK）對于腫瘤細(xì)胞存活，轉(zhuǎn)移，入侵也非常重要。在卵巢癌患者中，F(xiàn)AK過度表達(dá)與侵襲性腫瘤的特性相關(guān)，這有助于弱勢細(xì)胞生存。概念證明，我們在卵巢癌和大腸癌模型中證實使用rHDL納米粒靶向STAT3和FAK治療有效性。原料與方法rHDL納米粒的制備和siRNA的偶聯(lián)siRNA偶聯(lián)到rHDL納米粒，并儲存在-20°C。簡樸地說，載脂蛋白A-I，是rHDL納米粒的重要核蛋白，在生產(chǎn)蛋白過程中用質(zhì)粒載體進(jìn)行分離和純化。然后，脂類混合物（膽固醇[C]膽固醇油酸[CE]蛋黃卵磷脂[PC]，摩爾比的1:5:1.3:115）在氮氣流中干燥。5mg的siRNA用25μg低聚賴氨酸（平均分子量為500-2023）在30℃預(yù)先孵育30分鐘，然后加入到脂質(zhì)成分中。低聚賴氨酸siRNA混合物偶聯(lián)脂質(zhì)，分散在60μl的DMSO和1.4ml的緩沖液（10mMTris，0.1MKCl，1mMpH為8.0的EDTA）。膽酸鈉，140μL（100mgml溶于為PBS）形成的蛋黃卵磷脂摩和膽酸的摩爾比為1:1.6。載脂蛋白A-I（12.7mgml）溶于0.4mlPBS加入到混合物中，終體積用PBS調(diào)整到2ml。4℃孵育12h，接著用2L透射電子顯微鏡法在0.125M乙酸銨，2.6mM的碳酸銨，0.26mM的EDTA，pH值7.4中透析后，rHDL樣品用pH值7.2的2％磷鎢酸鈉并放在福爾瓦200目鎳網(wǎng)支持膜包裹的碳涂層進(jìn)行負(fù)染。顆粒明顯可見（放大50000倍），通過使用Zeiss910透射型電子顯微鏡。得到的圖片有所增強(qiáng)，粒徑可通過AdobeImageCS2軟件檢測。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件衍生和源于人體上皮卵巢癌細(xì)胞系的HeyA8，SKOV3ip1，HeyA8-MDR細(xì)胞系在之前已有研究。人類大腸癌細(xì)胞株(HCT116)對于DrLeeEllis。本篇文章中所用到所有細(xì)胞株都是德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的，通過表征細(xì)胞線芯的研究得到認(rèn)證。簡樸地說,HeyA8和SKOV3ip1細(xì)胞在添加15%胎牛血清和0.1%硫酸慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HeyA8-MDR細(xì)胞在添加有15%的FBS和300ngml紫杉醇以及0.1%硫酸慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。HCT116細(xì)胞在添加10%的FBS和0.1%硫酸慶大霉素的改良伊格爾培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有的細(xì)胞都保存在37°體外基因沉默STAT3（靶序列5'-GCCUCUCUGCAGAAUUCAA-3'），粘著斑激酶（靶序列5'CCACCUGGGCCAGUAUUAU-3'），和一個非定標(biāo)性的控制序列（靶序列的5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'）均購自Sigma-Aldrich公司，RNAiFect轉(zhuǎn)染試劑按照廠家建議使用。簡樸地說，SKOV3ip1和HeyA8-MDR卵巢癌細(xì)胞系在一式三份的六孔板用1.33μg特定siRNA孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在70％處匯合。分別使用1:3.75的siRNA和轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對照siRNA和STAT3siRNA組無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6=50)在SB-R1的表達(dá)可以用福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本檢測，這種方法源于德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心，是通過機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)。高表達(dá)或低表達(dá)都是由婦科病理學(xué)家使用下列程序來決定的:強(qiáng)度從1到3,分布是從1到4。TUNEL染色取新鮮冷凍的實驗組(SKOV3ip1模型)腫瘤組織部分，通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口尾部標(biāo)記進(jìn)行末端染色，再用1:10,000的Hoechst進(jìn)行復(fù)染。凋亡小體通過綠色熒光表達(dá)。Tunel陽性細(xì)胞在10個200×區(qū)域，每組分為5個部分進(jìn)行計數(shù)，得到平均值。siRNA選擇性遞送SKOV3ip1雌性裸鼠用0.2mgKg的熒光標(biāo)記對照siRNA或無標(biāo)記對照siRNA（每組n=3時）靜脈注射或腹腔注射。48小時后，處死小鼠，收集腫瘤和器官（腦，心臟，肺，肝，腎，脾）并冷凍。熒光染色取新鮮冰凍得原位卵巢癌模型（SKOV3ip1）的腫瘤組織，置于丙酮中，用PBS洗滌，并用Hoechst（1:10,000）復(fù)染。熒光顯微鏡在400×的視野來分析幻燈片。每張幻燈片有十個高倍區(qū)域，取平均值。原位卵巢癌模型雌性裸鼠（10?12周齡）購自美國美國國家癌癥研究所。所有的實驗都是由MD安德森癌癥中心機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)。體內(nèi)FAK靶向?qū)τ贔AK靶向?qū)嶒灒⊿KOV3ip1模型），治療組分為（每組n=10）：1）空rHDL納米粒，2）對照siRNArHDL，3）FAKsiRNArHDL，4）對照siRNA+多烯紫杉醇，5）FAKsiRNArHDL+多烯紫杉醇體內(nèi)STAT3靶向STAT3基因沉默實驗，根據(jù)以下各組（每組n=10）進(jìn)行實驗：1）對照siRNArHDL，2）對照siRNArHDL+多烯紫杉醇，3）STAT3siRNArHDL，4）STAT3siRNArHDL+多烯紫杉醇。適合的腫瘤細(xì)胞來源于卵巢癌小鼠模型（HeyA8，SKOV3ip1和HeyA8MDR）用腹腔注射接種。小鼠隨機(jī)飼養(yǎng)并在第7天后開始解決。約HeyA8模型3周后或SKOV3ip1和HEYA8-MDR5周后，解剖小鼠，收集腫瘤。大腸癌轉(zhuǎn)移模型對于大腸癌轉(zhuǎn)移模型，HCT116細(xì)胞注入雌性裸鼠脾臟（治療組N=10）。兩個星期后，按照前面描述的開始用奧沙利鉑解決，根據(jù)圖2C所示。4周后，解剖小鼠，收集腫瘤體內(nèi)沉默STAT3或FAK基因的有效劑量通過在SKOV3ip1模型小鼠注入劑量范圍為0.1?0.2mgKgSTAT3siRNArHDL或FAKsiRNArHDL來測定。小鼠在第2，4或6天解剖。收集腫瘤組織，采用蛋白質(zhì)印跡分析蛋白表達(dá)記錄分析假如呈正態(tài)分布連續(xù)變量可以使用t檢查(在兩個組)或方差分析(所有組)進(jìn)行比較。在非參數(shù)值中,連續(xù)變量使用曼-懷氏等級和檢查或秩和檢查(所有組)進(jìn)行比較。rHDL體內(nèi)研究將治療組每10只小鼠被隨機(jī)分派。我們使用SPSS和GraphPadPrism軟件對所有結(jié)果進(jìn)行處。我們認(rèn)為P<0.05就是顯著差異。本研究中所有的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)分析。結(jié)果包含RNAi的rHDL納米粒的制備由于RNAi分子是高度離子化,重要是由于磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，我們設(shè)計了一個新奇制劑是將siRNA偶聯(lián)到rHDL里。反義寡賴氨酸多肽具有大約40賴氨酸殘基，這可使siRNA偶聯(lián)到rHDL。siRNA偶聯(lián)后，rHDL納米粒的直徑約10nm(圖1，A和B)和帶中性電荷(ζ電位?3.2mV)。rHDL納米粒具有強(qiáng)大的有效載荷承載能力（最高至4mgsiRNAml)。此外，具有siRNA納米粒是非常穩(wěn)定的。由于樣品儲存兩周并再次透析后siRNA沒有從rHDL損失。SR-B1表達(dá)在腫瘤細(xì)胞在研究rHDL作為siRNA的有效遞送系統(tǒng)之前，我們一方面分析了多個細(xì)胞系和人類腫瘤存在的SR-B1受體。在50種人類卵巢上皮癌,96%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)了SR-B1受體(圖1C)。此外，我們檢測在人類正常器官的SR-B1表達(dá)并用RT-PCR分析乳腺癌、直腸癌、胰腺癌和卵巢癌細(xì)胞系的表達(dá)(圖W1)。用RT-PCR也檢測了一些細(xì)胞系(圖1D)。所有的癌癥細(xì)胞系測試證實了SR-B1的高水平表達(dá)。在正常的組織里，只有肝臟SR-B1高度表達(dá)，而其他組織很少表達(dá)。Figure1.CharacterizationofrHDLnanoparticles.(A)IllustrationsofrHDLnanoparticlecomposition.(B)ElectronmicrographofrHDLnanoparticlescontainingcontrolsiRNA.(C)ExpressionofSR-B1inepithelialovariancancer(IHC).(D)mRNAexpressionofSR-B1inovarianandcolorectalcancercelllines.在體內(nèi)rHDL納米粒的選擇性輸送比起正常組織，考慮到SR-B1受體在腫瘤細(xì)胞中的高度表達(dá)，我們接下來檢測用rHDL納米粒遞送siRNA在體內(nèi)的有效性。熒光標(biāo)記(Alexa555)siRNA被包入到rHDL納米粒子，并進(jìn)行IV或IP(圖2)。單劑量注射后，siRNA均勻分布到約80%的特定腫瘤組織。我們進(jìn)一步驗證rHDL納米粒的遞送是否由受體介導(dǎo)。為了解決這個問題,，我們一方面分析了用Alexa555標(biāo)記siRNArHDL納米粒解決的小鼠器官(圖W2)。rHDL納米粒在肝臟中的吸取最高，而在大腦、心臟、肺、腎、或脾中吸取很少。靜脈注射或腹腔注射rHDLAlexa555后，腫瘤組織對rHDL納米粒的吸取無顯著差異。用該方法進(jìn)行長期治療實驗之前，我們下一個驗證STAT3siRNA偶聯(lián)到rHDL納米顆粒(siRNArHDL)在體內(nèi)基因沉默的有效性。STAT3siRNA的有效性一方面在體外SKOV3細(xì)胞上測試(圖W3A)，與對照組siRNA相比，5μg的STAT3siRNA導(dǎo)致STAT3蛋白表達(dá)超過80%的減少。接下來，檢測在體內(nèi)沉默STAT3基因的有效劑量。在SKOV3ip1小鼠模型中我們注射STAT3siRNArHDL，劑量范圍從0.1至0.2mgKg。第四天，單劑量注射0.2mgKg的siRNA，我們發(fā)現(xiàn)減少了88%STAT3蛋白水平(圖W3B)，在第6天，蛋白表達(dá)有些回升。根據(jù)這個實驗，我們在后續(xù)實驗中使用0.2mgKg的劑量。另一個關(guān)于癌癥生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，F(xiàn)AK也具有類似的結(jié)果(圖W3C)。在SKOV3ip1小鼠模型中單劑量注射FAKsiRNArHDL納米粒4天后，F(xiàn)AK水平減少了87%。Figure2.SystemicdeliveryofsiRNAusingrHDLnanoparticles.(A)UptakeofAlexa555-labeledsiRNArHDLinSKOV3ip1tumors.AsingleIVorIPinjectionof0.2mgkgofAlexa555labeledor0.2mgkgofIVandIPinjectionofuntaggedsiRNArHDLwasadministeredinmicebearingSKOV3ip1tumors,and48vivoefficacyofSTAT3siRNArHDLinchemosensitive(HeyA8andSKOV3ip1)andchemoresistant(HeyA8-MDR)mousemodelsofovariancarcinoma.*P<.05comparedwithcontrols.**P<.05comparedwithcontrolsaswellasdocetaxelalone.(C)InvivoefficacyofSTAT3siRNArHDLincolorectalcancermodeloflivermetastases(HCT116).*P<.05comparedwithcontrolsiRNArHDL,**P<.05comparedwithSTAT3oroxaliplatinalone.InvivoefficacyofFAKsiRNArHDLintheSKOV3ip1ovariancancermodel.*P<.05comparedwithcontrols.**P<.05comparedwithcontrolsaswellasdocetaxelalone.Errorbars,SEMSTAT3或FAK基因沉默對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的影響體內(nèi)成功沉默F(xiàn)AK或STAT3基因后(圖W3B），我們接下來測試了這種是否用多烯紫杉醇化療藥方法的治療有效性。我們一方面用STAT3siRNArHDL靶向STAT3(圖2B)。在三個原位卵巢癌小鼠模型中用單獨STAT3siRNArHDL或偶聯(lián)多烯紫杉醇進(jìn)行治療。在HeyA8模型中，單獨給STAT3siRNArHDL或多烯紫杉醇減少了的62%的腫瘤重量(P<0.5年,兩者)。與對照組比較，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇的聯(lián)合治療使腫瘤重量減少的最多(92%，P<0.05)。在SKOV3ip1模型中結(jié)果類似(圖2B)。此外，當(dāng)STAT3siRNArHDL有無多烯紫杉醇解決小鼠，HeyA8和SKOV3ip1卵巢癌模型中證實了腫瘤結(jié)數(shù)量的劇減。(圖W4A)考慮到STAT3的耐藥性，我們還進(jìn)行了紫杉醇耐藥HeyA8-MDR模型實驗(圖2B)。正如預(yù)期，多烯紫杉醇對腫瘤的生長無顯著影響。STAT3siRNArHDL單藥療法使腫瘤生長減少了76%(P<0.01)。多烯紫杉醇和STAT3siRNArHDL聯(lián)合療法使腫瘤細(xì)胞的增長減低的更多(比起對照組，91%，P<0.001；比起多烯紫杉醇，89%，P<0.1)。腫瘤節(jié)數(shù)量也有類似的效果（圖2）。我們在每一個治療組的動物的局部轉(zhuǎn)移頻率進(jìn)行了分析。相比于對照組和多烯紫杉醇單藥療法，STAT3siRNArHDL是否偶聯(lián)多烯紫杉醇都能顯著減少上腹部和薄壁肝組織的轉(zhuǎn)移。接下來，我們研究在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌小鼠模型（HCT116）研究STAT3沉默基因的治療效果，該模型使SR-B1表達(dá)（圖2C）。腫瘤細(xì)胞注射到脾臟后，轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到肝臟。STAT3siRNArHDL單獨治療導(dǎo)致在腫瘤的重量減少79％（P<0.01）。對于這些實驗，我們常用細(xì)胞毒性，奧沙利鉑，偶聯(lián)STAT3siRNArHDL。奧沙利鉑減少55％的腫瘤生長（P<0.01）。與對照組相比，奧沙利鉑和STAT3siRNArHDL偶聯(lián)治療可使腫瘤重量（96％，P<0.01）和肝臟中轉(zhuǎn)移損壞數(shù)目（86％，P<0.01）顯著減少。為了評估rHDL納米粒的安全性，我們評估用rHDL納米粒解決小鼠的幾個參數(shù)（圖W5）。在兩個不同治療組中，動物體重或肝功能測試（AST和ALT比值）沒有顯著差異（圖W5，A和B）。與對照組相比，治療結(jié)果顯示沒有顯著變化后，多個正常器官用蘇木精和伊紅（H＆E）染色（圖W5C）為了測試rHDL納米粒對其他靶點的效用潛力,我們進(jìn)行了FAKsiRNArHDL實驗。我們在SKOV3ip1原位卵巢癌模型中用FAKsiRNArHDL納米粒靶向FAK(圖2C)。FAK或多烯紫杉醇單藥治療可使腫瘤重量減少62%和74%(兩者P<0.01)。聯(lián)合治療顯著減少腫瘤重量(96%，P<0.01)，腫瘤節(jié)的數(shù)量(74%，P<0.05)?？誶HDL納米粒和對照siRNArHDL解決的小鼠之間沒有顯著差異。STAT3靶向腫瘤微環(huán)境的影響為了了解STAT3rHDL的生物效應(yīng)，在藥物敏感的(SKOV3ip1)和藥物耐藥(HeyA8-MDR)卵巢癌模型中進(jìn)行一系列的體內(nèi)體外實驗。在SKOV3ip1卵巢癌模型中(圖3),STAT3基因沉默減少26%細(xì)胞增殖(P<0.05)，而多烯紫杉醇克制30%腫瘤細(xì)胞增殖(P<0.05)。與對照組比較，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇聯(lián)合治療可克制48%腫瘤細(xì)胞增殖(P<0.05)(圖3)。在HeyA8-MDR卵巢癌模型中(圖W6)，就多烯紫杉醇解決對于細(xì)胞增殖就沒有效果，STAT3siRNArHDL單藥可減少19%細(xì)胞增殖。對照組比較，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇偶聯(lián)治療可顯著減少細(xì)胞增殖(39%，P<0.05）。為了擬定STAT3沉默對腫瘤相關(guān)血管生成的影響,我們從所有四個實驗組取新鮮冷凍腫瘤組織的樣品進(jìn)行CD31染色實驗(圖3和W5)和檢測MVD。在SKOV3ip1模型,STAT3siRNArHDL或多烯紫杉醇單藥治療在MVD(圖3)產(chǎn)生66%至69%的減少(P<0.05)。比起對照組，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇偶聯(lián)治療在MVD可減少88%(P<0.05)。同樣,在HeyA8-MDR模型中，就多烯紫杉醇解決對MVD的減少沒有影響，但多烯紫杉醇和STAT3siRNArHDL偶聯(lián)治療可顯著減少(圖W6)。眾所周知，STAT3被認(rèn)為是增長細(xì)胞存活和克制細(xì)胞凋亡。因此，我們在SKOV3ip1卵巢癌模型中用TUNEL染色法(圖3)，在HeyA8-MDR模型活化型半胱天冬酶染色法(圖W6)研究了腫瘤細(xì)胞的凋亡效果。在SKOV3ip1模型，與對照組比較，STAT3基因沉默或多烯紫杉醇治療可增長8-12倍的細(xì)胞凋亡(P<0.05)。與對照組(P<0.05)相比，STAT3siRNArHDL和多烯紫杉醇的聯(lián)合治療可增長30倍的腫瘤細(xì)胞凋亡。除此之外，在HeyA8-MDR模型中，就多烯紫杉醇解決不影響細(xì)胞凋亡，對照組siRNArHDL相比，STAT3siRNArHDL或STAT3siRNArHDL與多烯紫杉醇聯(lián)合治療可大幅增長(分別為61%和76%，兩者P<0.05)凋亡細(xì)胞(陽性活化型半胱天冬酶-3)(圖W6)Figure3.EffectofrHDL-incorporatedSTAT3siRNAontumormicroenvironment.Tissues(Ki-67),angiogenesis(CD31),andapoptosis(TUNEL).FortheTUNELstain,fiverandomfieldsperslidewereexaminedwithfluorescencemicroscopy,andthenumberofapoptoticbodiesandnucleiisreportedasaveragepercentapoptoticcells(200×).Errorbars,SEM.卵巢癌細(xì)胞的STAT3沉默的組織標(biāo)記為了辨認(rèn)潛在組織標(biāo)記對STAT3基因沉默的響應(yīng),我們在卵巢癌細(xì)胞對對照和STAT3siRNA進(jìn)行基因組分析(圖4，A和B)。這兩組間有460個基因表達(dá)差異。生物數(shù)據(jù)指出，STAT3沉默后凋亡和修復(fù)是細(xì)胞生存的重要影響，我們重點研究這些途徑的基因(表W1)。從表中知，我們使用RT-PCR驗證STAT3基因沉默后最顯著改變的12個基因(圖4C)。STAT3基因沉默的限度與兩個模型保持一致。STAT3基因沉默大量減少了關(guān)鍵生存基因，這些基因重要用來調(diào)節(jié)MAP激酶和AKT通路（圖4）。這些基因可以作為響應(yīng)靶向STAT3療法的重要組織標(biāo)記基因。在HeyA8-MDR模型中也有類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。Figure4.EffectofSTAT3silencingongeneexpressionprofileofovariancancercells.(A)STAT3silencingmodulatesgeneexpressionofapoptosisrelatedgenes.AfterSTAT3silencingwithsiRNA(invitro),microarrayanalysiswasperformed.Heatmap(A)representstheoverallgeneexpressionchanges.Analysisofapoptosis-related(B)genesareshown.(C)Validationofmicroarray.Apoptosis-relatedgenesthatweredifferentiallyexpressedbetweencontrolsiRNAandSTAT3siRNAtreatmentgroupswerevalidatedwithquantitativereal-timeRT-PCR.Averagefoldchangeispresented.Errorbars,SEM.體外STAT3沉默對細(xì)胞凋亡的影響為了擬定STAT3基因沉默是否直接影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，在卵巢癌細(xì)胞(SKOV3ip1和HeyA8-MDR)的模型中，我們檢測STAT3siRNA是否具有多烯紫杉醇對細(xì)胞存活的影響(圖5)。STAT3沉默用免疫印跡分析證實(圖W3A)。在SKOV3ip1細(xì)胞,STAT3siRNA或多烯紫杉醇單藥治療增長凋亡(分別是3和5.2倍，兩者P<0.05)，而對照組相比，聯(lián)合治療增長7.7倍細(xì)胞凋亡(P<0.05)。與多烯紫杉醇治療相比，STAT3siRNA可增高41%的細(xì)胞凋亡(P<0.05)，這表白在體內(nèi)凋亡效應(yīng)的的確受到直接影響(圖5A)。此外，在HeyA8-MDR細(xì)胞多烯紫杉醇治療沒有產(chǎn)生顯著凋亡(圖5b)然而,STAT3沉默后增長多烯紫杉醇，比對照組相比可增長175%(P<0.05)的細(xì)胞凋亡，與單獨多烯紫杉醇治療可增長98%的細(xì)胞凋亡(P<0.05)。Figure5.EffectofSTAT3silencingonapoptosis.STAT3wassilencedusingSTAT3-specificsiRNAin(A)SKOV3ip1and(B)HeyA8-MDRcellswithandwithoutdocetaxeltreatment,andapoptosiswasassessedusingflowcytometry(annexinV).Averagepercentapoptosis(AnnexinVPE–positiveSKOV3cells)andaveragepercentapoptosiscomparedwithcontrol(annexinVPE–positiveHeyA8-MDRcells)arereported.Errorbars,SEM討論本研究的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)就是在體內(nèi)rHDL納米粒能有效地傳遞siRNA以沉默基因，這些基因?qū)Π┌Y的增長和發(fā)育很重要。這個概念建立在多個腫瘤模型中，通過siRNA包入rHDL納米粒以介導(dǎo)的高效STAT3或FAK基因沉默。生物效果是通過減少腫瘤細(xì)胞增殖，減少減少血管生成，減少細(xì)胞生存率來評估。盡管干擾RNA是一個高度特定基因沉默的模式,源于在體內(nèi)全身輸送的障礙，目前其治療應(yīng)用受到限制。為了克服這些障礙,選擇性生物相容性的運載系統(tǒng)是必要的。到目前為止,一些納米粒系統(tǒng)已經(jīng)具有潛在的治療措施，然而,由于缺少組織特異性和體內(nèi)廣泛分布大部分這些系統(tǒng)也許在對正常組織產(chǎn)生毒性。因此,非特異性遞送系統(tǒng)也許需要更高的劑量來達(dá)成有效性和連續(xù)的基因沉默。因此,比起其他方法，靶向性遞送系統(tǒng)克服這些障礙更抱負(fù)。遞送siRNA的rHDL傳輸系統(tǒng)具有許多的優(yōu)點。例如，rHDL核心成分的細(xì)胞攝取通過一個特定的受體(SR-B1)完畢。我們的數(shù)據(jù)表白，與正常組織相比，SR-B1受體在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)增長。這些表達(dá)差異也許有助于避免副作用。在目前研究中，rHDL納米粒的吸取重要局限于腫瘤和肝。這種吸取模式與SR-B1表達(dá)分布完全一致。此外,我們的安全研究表白，對照組siRNA相比，STAT3rHDL在小鼠肝臟中吸取沒有任何不良反映。概念驗證，我們證實了多種臨床前模型成功靶向兩個關(guān)于癌癥生長和增殖重要的基因。STAT3是一個良好的轉(zhuǎn)錄因子，涉及到腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的許多關(guān)鍵過程。干擾RNA是一種有效的治療策略，特別是對其他方法不易給藥的靶點。即使STAT3被廣泛認(rèn)為是一個重要的癌癥啟動子，傳統(tǒng)治療方法因其靶向性受到的限制。因此，所說的siRNA遞送系統(tǒng)對于靶向STAT3和惡性腫瘤增長促進(jìn)劑是很重要的途徑。減少血管生成的生物效應(yīng)，繼發(fā)于腫瘤細(xì)胞的STAT3沉默，這點已經(jīng)得到支持，是通過STAT3激活劑來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中激活STAT3與血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的增長是相關(guān)的。所以，藥理干預(yù)靶向STAT3對于這里描述的納米技術(shù)是也許的。此外，其他實體瘤中，F(xiàn)AK在直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺、前列腺癌上過度表達(dá)這一點也曾報道過。在卵巢癌患者中，F(xiàn)AK的過度表達(dá)與腫瘤相關(guān)功能在所有存活者中并不明顯。用脂質(zhì)體或小分子克制劑系統(tǒng)性靶向FAK顯示減少腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，但是，這種方法并非腫瘤特異性并且也許產(chǎn)生毒性。FAKsiRNArHDL治療方法具有高度腫瘤特異性，可以顯著克制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移并且對其他器官無明顯副作用?？傊?，用rHDL納米粒系統(tǒng)性遞送siRNA為治療人類惡性腫瘤開拓了新的視野。這個遞送方法不僅高效的，并且具有選擇性和生物相容性。因此,rHDL納米粒癌癥管理中具有顯著的應(yīng)用。FigureW1.ExpressionofSR-B1mRNAindifferentorgansandtumorsusingRT-PCR.Actinisusedasaloadingcontrol.FigureW2.Distributionofsystemicdeliveryoffluorescent-labeledsiRNArHDL.Alexa555-labeledcontrolsiRNArHDLoruntaggedsiRNArHDLwasinjected(IVorIP),and48tissueswerecounterstainedwithHoechst,andtheleveloffluorescent-labeledsiRNA(red)wasassessedwithfluorescentmicroscopy.Averagefluorescenceuptakeisrepresentedbythegraphs.*P<.05comparedwithuntaggedsiRNArHDL.H&ErepresentstheorganmorphologyFigureW3.STAT3andFAKsilencingwithsiRNArHDL.(A)STAT3siRNAtreatment(invitro)inSKOV3ip1ovariancancercells.(B)STAT3siRNArHDL.(C)FAKsiRNArHDLwasinjectedinmicebearingSKOV3ip1ovariantumors.Westernblotanalysisdemonstratesrelativeproteinexpression.GraphsrepresentmeanexpressionintensitymeasuredwithdensitometryFigureW4.InvivoeffectofSTAT3siRNArHDLwithandwithoutdocetaxeltherapyontumornodulesin(A)HeyA8andSKOV3and(B)HeyA8-MDRovariancancermodels.Theaveragenumberoftumornodulesispresentedasabargraph.Errorbars,SEM.Three-dimensionalgraphdepictsthedistributionofovariantumormetastasisinHeyA8-MDR(Taxol-resistant)ovariancancermodelFigureW5.SafetyofrHDLnanoparticles.(A)Bodyweights.(B)Liverfunctiontests(LFTs)measuredattheendoftherapyexperimentfromalltreatmentgroupsarereported(forLFTs,ASTandALTratioispresented).(C)Immunohistochemistry(IHC)performedonorgansafteralong-termtherapyexperiment.RepresentativeimagesofIHCfromeachtreatmentgrouparepresentedFigureW6.EffectofrHDL-incorporatedSTAT3siRNAontumormicroenvironment.Tissuescancermousemodelweresubjectedtoimmunohistochemistryformarkersofproliferation(Ki-67),angiogenesis(CD31),andapoptosis(cleavedcaspase-3).Fortheanalysis,fiverandomfieldsperslidewereexaminedwithlightmicroscopyandnumberofaveragenumberofmicrovessels(MVD)orthenumberofcellspositive(Ki-67andcleavedcaspase-3)andnucleiarereportedasaveragepercentpositivecells(200×).Errorbars,SEM.以下免費送您一百個優(yōu)秀畢業(yè)論文題目，供參考。1.公司集團(tuán)激勵與績效評價問題研究2.XXX地區(qū)中小公司財務(wù)管理現(xiàn)狀問題研究3.XXX地區(qū)上市公司賺錢質(zhì)量實證研究4.XXX地區(qū)公司集團(tuán)整合過程中的財務(wù)問題研究5.XXX地區(qū)中小公司的信用擔(dān)保體系問題研究6.XXX地區(qū)上市公司財務(wù)預(yù)警問題研究7.公司并購前后財務(wù)狀況變化問題研究8.以平衡計分卡為核心的績效評價體系研究9.EVA在公司績效評價中的作用研究10.關(guān)于我區(qū)中小公司引入風(fēng)險投資問題研究11.我國上市公司經(jīng)營目的的實證分析12.對內(nèi)含報酬率法的再思考13.運用平衡計分卡貫徹戰(zhàn)略的案例分析14.基于EVA的公司業(yè)績評價指標(biāo)體系的構(gòu)建與實行研究15.基于不同發(fā)展周期的公司財務(wù)戰(zhàn)略選擇研究16.集團(tuán)公司全面預(yù)算目的的制定與分解17.鈔票流量折現(xiàn)法在評估公司戰(zhàn)略中的應(yīng)用分析18.財務(wù)指標(biāo)與非財務(wù)指標(biāo)在評估管理者業(yè)績中的應(yīng)用擬合19.我國公司財務(wù)管理目的的現(xiàn)實選擇20.財務(wù)管理目的與公司財務(wù)核心能力問題研究21.公司財務(wù)管理中運用稅收籌劃的探討22.建立以財務(wù)管理為核心的資源配置制度23.財務(wù)預(yù)警系統(tǒng)在財務(wù)管理中應(yīng)用評價24.基于Excel的財務(wù)預(yù)警模型研究25.中西部地區(qū)中小公司財務(wù)戰(zhàn)略選擇問題研究26.中小公司納稅籌劃問題研究27.公司投資過程中的納稅籌劃問題研究28.公司集團(tuán)納稅籌劃問題研究29.公司納稅籌劃中的風(fēng)險規(guī)避問題研究30.從公司治理結(jié)構(gòu)透視財務(wù)管理目的31.作業(yè)成本管理模式及其應(yīng)用研究32.論管理層并購在我國的運用33.公司并購中的財務(wù)風(fēng)險與防范34.跨國公司財務(wù)管理策略及其在我國的實踐35.關(guān)于上市公司并購的財務(wù)分析36.跨國公司財務(wù)管理體制的比較與選擇37.跨國公司財務(wù)管理策略及其在中國的實踐38.全球化與財務(wù)管理發(fā)展趨勢及其模式選擇39.財務(wù)治理與財務(wù)管理之異同40.EVA對傳統(tǒng)財務(wù)管理的沖擊41.公司財務(wù)管理機(jī)制重塑問題探討42.財務(wù)管理發(fā)展的文化分析43.利益相關(guān)者合作模式下的財務(wù)管理目的選擇44.行為財務(wù)管理探索——以價值管理為中心45.上市公司股利政策實證研究46.公司治理結(jié)構(gòu)與財務(wù)管理目的問題研究47.產(chǎn)權(quán)理論分析與財務(wù)管理目的的現(xiàn)實選擇48.金融工具創(chuàng)新與公司財務(wù)管理49.對價值鏈財務(wù)管理目的的探討50.IT信息產(chǎn)業(yè)公司的財務(wù)管理51.期權(quán)在財務(wù)管理中的運用52.論創(chuàng)業(yè)投資在我國所面臨的財務(wù)問題53.風(fēng)險投資退出機(jī)制問題研究54.公司可連續(xù)發(fā)展與財務(wù)管理問題研究55.公司集團(tuán)資金鏈構(gòu)造問題研究56.內(nèi)蒙古地區(qū)上市公司融資效率實證研究57.預(yù)算管理在ERP系統(tǒng)中的運用問題研究58.發(fā)展中小公司信貸融資的思考59.中小公司在不同發(fā)展階段戰(zhàn)略選擇問題研究60.連鎖經(jīng)營公司財務(wù)管理創(chuàng)新61.對我國中小公司風(fēng)險投資的探討62.中西部地區(qū)中小公司融資策略研究63.融資租賃在中小公司中的運用問題研究

64.對我國中小公司信用管理的研究65.對我國中小公司創(chuàng)業(yè)版上市公司成長性分析的探討66.對連鎖經(jīng)營公司資金運營管理的思考67.推行全面預(yù)算管理

建立新型財務(wù)管理體系68.機(jī)會成本及其在公司財務(wù)管理中的應(yīng)用69.建立以預(yù)算管理為中心的財務(wù)管理模式70.論邊際成本在公司理財中的運用71.公司融資障礙及對策研究72.高新技術(shù)公司財務(wù)管理若干問題的思考73.公司的擴(kuò)張與財務(wù)管理74.行為財務(wù)管理新論75.論破產(chǎn)公司財務(wù)管理存在的問題及對策76.公司核心能力與財務(wù)管理能力研究77.我區(qū)公司運用外資融資效率分析78.我區(qū)中小公司創(chuàng)新模式研究—基于財務(wù)視角79.公司集團(tuán)成本管理的創(chuàng)新問題研究80.集團(tuán)公司財務(wù)管理模式的探討81.非營利組織財務(wù)管理面臨的問題及對策研究82.公司激勵與績效評價問題研究83.我區(qū)公司集團(tuán)財務(wù)戰(zhàn)略選擇問題研究84.非營利組織財務(wù)管理創(chuàng)新問題研究85.公司集團(tuán)資本運營問題研究86.論表內(nèi)融資與表外融資的關(guān)系87.EVA—現(xiàn)代公司的最佳績效評價指標(biāo)88.對杜邦分析法的再思考89.EVA與傳統(tǒng)業(yè)績評價方法結(jié)合問題研究90.財務(wù)分析指標(biāo)體系創(chuàng)新問題研究91.非財務(wù)分析法與財務(wù)分析法結(jié)合有效性研究92.非財務(wù)指標(biāo)在業(yè)績評價體系中運用的有效性問題研究93.關(guān)于經(jīng)營者業(yè)績評價的思考94.公司融資效率實證研究95.信息時代財務(wù)控制趨勢分析96.期權(quán)在公司投資決策中的應(yīng)用97.公司集團(tuán)融資中的風(fēng)險規(guī)避問題研究98.我區(qū)公司的融資創(chuàng)新問題研究99.現(xiàn)代資本預(yù)算技術(shù)在公司理財中的運用100.國有資本減持的財務(wù)風(fēng)險研究現(xiàn)在，我把自己數(shù)年來撰寫畢業(yè)論文經(jīng)驗，總結(jié)如下，一并贈送給您，希望能幫到您：畢業(yè)論文注意事項前言畢業(yè)論文（學(xué)士學(xué)位論文）是本科生畢業(yè)設(shè)計成果的“固化”與“濃縮”，其規(guī)范性歷來為指導(dǎo)教師和論文審閱人所重視，幾乎系評語中不可或缺之內(nèi)容。畢業(yè)論文的規(guī)范性由此可見一斑。各屆學(xué)生畢業(yè)論文中出現(xiàn)的問題比比皆是，筆者將其加以整理，急忙成文，姑且稱之為“畢業(yè)論文注意事項”。須指出，本文所有內(nèi)容乃筆者之見，難免以偏概全、掛一漏萬，更無權(quán)威性可言，故不敢稱之為“畢業(yè)論文寫作規(guī)范”。文中不妥之處在所難免，歡迎同仁批評指正，共同商榷，以饗畢業(yè)班之學(xué)生。或許一些人認(rèn)為，給一篇畢業(yè)論文做“樣板”，諸多問題都將迎刃而解；網(wǎng)站上提供論文模版供學(xué)生下載更為上策。但筆者必須指出，許多應(yīng)注意的細(xì)微之處，遠(yuǎn)不是給一篇范文或給一個模版就能做到的，此乃撰本文之初衷。第一章關(guān)于插圖1．1圖號插圖要有圖號，格式為“圖m-n”。其中m為該插圖所在的章號，n為本章中該插圖的順序號，m與n均為阿拉伯?dāng)?shù)字。每一章的插圖獨立編號。例如第3章的第4個插圖標(biāo)記為“圖3-4”1．2圖名（圖注）圖名應(yīng)確切反映該圖的含義，一般為名詞性短語，力圖簡明扼要。圖名放于圖號后，與圖號隔兩個全角空格。為便于敘述，不妨將圖號與圖名并稱為“圖題”。1．3插圖的形式插圖一般有四種形式，即手繪圖、屏幕抓圖、掃描圖、文獻(xiàn)插圖。來自電子版參考文獻(xiàn)的插圖，多數(shù)是模糊不清的，故建議用手繪圖取而代之。1．3．1手繪圖手繪圖系指在Word中直接用繪圖命令繪制的圖。該類插圖所占磁盤空間最少，系使用最多的一種插圖形式，數(shù)據(jù)流圖、結(jié)構(gòu)圖、程序框圖一般用此法繪制。繪圖所用圖例應(yīng)注意規(guī)范。程序框圖的選擇框要注意標(biāo)“是否”或“YN”，起始框、終結(jié)框注意用圓角矩形（建議使用專門用于畫框圖的軟件Visio畫框圖）；數(shù)據(jù)流圖的數(shù)據(jù)線需標(biāo)數(shù)據(jù)名稱，數(shù)據(jù)加工與數(shù)據(jù)存儲之間的箭頭無數(shù)據(jù)名稱。其他圖形的圖例參考有關(guān)文獻(xiàn)。手繪圖時必須一絲不茍，搭結(jié)欠量、過量均不合格；圖中的文字放入文本框中，框內(nèi)文字注意橫縱居中；線框交界處注意勻稱；框內(nèi)文字的筆劃宜完整，不得被線框遮蓋；文字、線條不得交叉；圖中文字盡也許使用統(tǒng)一的字體、字形、字號，其中字號原則上不大于正文字號（以小半號為宜）。微調(diào)線條位置、長短時，可將Alt鍵和箭頭鍵配合使用。觀測線條是否存在搭接問題時，可選用500%的顯示比例，否則難以看出搭接問題。線條、文字等元素輸入完畢后，應(yīng)選中與所繪之圖有關(guān)的所有線條、文本框，按鼠標(biāo)右鍵，選“組合”，將各元素組合在一起。否則，很有也許排版后“東一只胳膊、西一條腿”，甚至“丟胳膊少腿”。1．3．2屏幕抓圖此類圖系指使用PrtScreen或Alt+PrtScreen鍵通過剪貼板獲得的圖像。采用屏幕抓圖制作插圖時，應(yīng)“量身定做”，抓圖后不要縮放，以免模糊。1．3．3掃描圖如使用掃描圖片，分辨率規(guī)定為300線，顏色模式為灰度，嵌入文中后不要縮放。1．3．4文獻(xiàn)插圖文獻(xiàn)插圖系指使用“插入|圖片|來自文獻(xiàn)…”命令插入的圖像。采用文獻(xiàn)插圖時，盡量不要使用JPG等類型的壓縮圖片，以免影響打印效果。1．4插圖的位置盡量將插圖與正文中的相關(guān)文字說明置于同一頁。放入前一頁或后一頁，乃不得已而為之（例如圖太大等）。插圖一般居中放置；圖題位于插圖的下方，用宋體5號字，居中放置；圖題與插圖放于同一頁中，即兩者不得跨頁。換言之，圖題不能位于某一頁的頁首。一張圖一般不得跨頁（大的程序框圖例外，但需按正規(guī)規(guī)定標(biāo)清楚）。1．5插圖的排版插圖很小時，建議使用圍繞排版（四周排版），插圖前、圖題后均應(yīng)留適當(dāng)空間，切勿與正文“緊密相連”。第二章關(guān)于表格論文中的表格一般使用Word的表格功能直接制作，使用Excel制作亦可。2．1表號表格要有表號，格式為“表m-n”。其中m為該表格所在的章號，n為該章中該表格的順序號，即每一章的表格獨立編號。例如第3章的第4個表格標(biāo)記為“表3-4”2．2表名表名應(yīng)確切反映該表的含義，一般為名詞性短語，力圖簡明扼要。表名放于表號后，與表號隔兩個全角空格。為便于敘述，不妨將表號與表名并稱為“表題”。2．3表格盡量將表格與正文中的相關(guān)文字說明置于同一頁，放入前一頁或后一頁乃不得已而為之（例如表格太大等）。表格一般居中放置；表題位于表格的上方，用宋體5號字；居中放置；表題與表格放于同一頁中，即兩者不得跨頁。換言之，表題不能位于某一頁的頁尾。表格自身可以跨頁，但次頁的表應(yīng)加一個表頭（注意，不是標(biāo)題，是表頭，即表格的首行），或在次頁首部加注“（續(xù)表）”。2．4表格內(nèi)文字的排版表格內(nèi)文字應(yīng)比正文小半號，一般居中放置，但文字量較大且長短不一時，以左對齊為宜。表格設(shè)計應(yīng)美觀、大方，表格風(fēng)格盡量一致，推薦使用三線式表格。表格前、后均應(yīng)留適當(dāng)空間，切勿與正文“緊密相連”。第三章關(guān)于摘要5．1格式中英文摘要各占一頁，首行寫“摘要”“ABSTRACT”（“摘要”之間空兩格，采用三號字、黑體、居中，與內(nèi)容空一行）；第三行開始寫摘要內(nèi)容，首行空兩格（內(nèi)容采用小四號宋體）。最后單獨列一行，寫中英文關(guān)鍵詞。關(guān)鍵詞一般提供3-5個即可，寫于1-2行上，以分號分隔。中文關(guān)鍵詞前冠以“關(guān)鍵詞：”，靠左；英文關(guān)鍵詞前冠以“Keywords:”，亦靠左。第二行首個關(guān)鍵字與第一行的首個關(guān)鍵字對齊。具體規(guī)定參見模板。5．2內(nèi)容課題的意義，工作方法，結(jié)果與結(jié)論，后續(xù)研發(fā)建議等。摘要中不可大段大段地引用正文中的段落。切忌使用自動翻譯工具將中文摘要翻譯為英文摘要。第四章關(guān)于目錄4．1目錄的制作目錄必須由Word自動生成，不得手工輸入，以免后患無窮。制作方法：先使用格式工具欄的第一個圖標(biāo)將各級標(biāo)題“格式化”，再使用“插入|索引和目錄”便可自動生成。目錄生成后，在首行加上“目錄”二字，采用黑體三號字，居中。目錄只列到三級，一、二、三級標(biāo)題依次內(nèi)縮一字，分別采用四號、小四號、五號宋體。4．2目錄頁的位置目錄頁位于正文第一頁之前。正文首頁為論文第一頁。目錄右端的頁號應(yīng)對齊。目錄頁超過一頁時，應(yīng)有頁碼，一般采用大寫羅馬數(shù)字，以區(qū)別于正文。注意：目錄之前的各頁均無頁號、無頁眉。第五章關(guān)于正文5．0關(guān)于頁面新的一章應(yīng)換頁。正文任何一頁的尾部均不得留很多空行（一章的末頁除外）。圖表過大，致使本頁剩余空間容納不下時，可將其放于次頁，并將其后的文字上提至前一頁。編了號的圖表，原則上可放于正文的任何一頁，但通常與正文中的說明性文字不要相隔甚遠(yuǎn)。只有正文才有頁眉。換言之，正文之前的各頁無頁眉；自“參考文獻(xiàn)”起，以后各頁亦無頁眉。正文各頁的頁腳只有頁碼，且居中放置。5．1關(guān)于體例第一章章標(biāo)題（黑體、小三號、居中）1.1節(jié)標(biāo)題（黑體、四號、頂格）1.1.1小節(jié)標(biāo)題（黑體、四號、頂格）一、段落標(biāo)題1（宋體、小四號、空2格、用1.25倍行間距）1.段落標(biāo)題2(1)段落標(biāo)題3=1\*GB3①段落標(biāo)題4論文正文注意：無論哪一級標(biāo)題，尾部均無標(biāo)點符號。不得懸空出現(xiàn)一個標(biāo)題，如：系統(tǒng)的基本原理提醒：根據(jù)往屆學(xué)生論文情況，各級序號盡量不用Word自動生成，以免格式難以控制。5．2關(guān)于字體、字形、字號、行距、字距（按模版）正文一般用小四號宋體，行距采用1.5倍，字距采用默認(rèn)值。5．3關(guān)于分頁新的一章開始，要換頁，但不要用多個回車進(jìn)行分頁（否則后患無窮），而要用^Enter（即Ctrl+Enter）插入換頁符；標(biāo)題不得位于一頁的末行；圖題不得位于一頁的首行（前已提及，此處強(qiáng)調(diào)）；表題不得位于一頁的末行（前已提及，此處強(qiáng)調(diào)）；不能因圖表過大而提前換頁（即將大的圖表放入次頁）；可將后頁的部分文字提到前頁來解決此問題。5．4關(guān)于文獻(xiàn)引用引用文獻(xiàn)處，用[n]以上角標(biāo)形式標(biāo)注，其中n為參考文獻(xiàn)序號。文獻(xiàn)引用屬正?，F(xiàn)象，無可厚非，但忌諱大量抄錄，特別是整章整節(jié)內(nèi)容大肆抄襲。軟件介紹、開發(fā)工具介紹、數(shù)據(jù)庫原理介紹宜少花筆墨。并且，所“寫”內(nèi)容出自何文獻(xiàn)，需以此方法注明（通俗地講，抄自何處，應(yīng)讓人一目了然）。5．5關(guān)于圖表只要出現(xiàn)插圖或表格，在正文中必須要有相應(yīng)的說明。例如：“系統(tǒng)的數(shù)據(jù)流圖如圖3-1所示”，“數(shù)據(jù)字典示于表3-1”，等等（前已提及，此處強(qiáng)調(diào)）。不得出現(xiàn)“…如下圖所示”、“…如下表所示”圖表中的文字應(yīng)注意嚴(yán)厲性，嚴(yán)禁出現(xiàn)不良人名、地名，忌諱影星、歌星名字或影視作品中的人名。5．6關(guān)于段落段首嚴(yán)格空兩個漢字的位置。應(yīng)使用標(biāo)尺進(jìn)行控制，不要使用4個半角空格或2個全角空格代之。除特殊情況外，段落一般使用“兩端對齊”，以免右側(cè)參差不齊，特別是英文。5．7關(guān)于標(biāo)點1．凡中文敘述之處，均使用全角標(biāo)點符號；破折號“——”與省略號“……”必須規(guī)范（在微軟拼音方式下，分別用“Shift+-”和“Shift+^”輸入，前者亦可用Alt+Ctrl+.輸入），不得用其他符號替代。外國人名字的姓與名之間用“?”分隔，不得以“.”或“．”代替。表達(dá)區(qū)間、范圍時，使用“～”，不使用“~”（參考文獻(xiàn)頁碼范圍使用“-”）。2．凡英文敘述之處，均使用半角標(biāo)點符號；且注意英文無頓號，代之以逗號；英文無書名號，代之以斜體排版。3．凡是程序中涉及標(biāo)點符號的，一律用半角符號（雙引號應(yīng)顯示為“"”，單引號應(yīng)顯示為“’”），但程序中的注釋例外。4．寫完文章后，要多檢查幾遍，注意文中標(biāo)點的對的使用。5．8關(guān)于錯別字1．多數(shù)同學(xué)使用拼音法輸入漢字，同音別字非常之多，如“儀器”誤輸為“一起”，“及其”誤輸為“機(jī)器”，“登錄”誤輸為“登陸”，“清楚”誤輸為“清洗”，“指導(dǎo)”誤輸為“直到”……特別注意：“登陸”二字在學(xué)生論文中大量出現(xiàn)，希望使用Word的查找命令檢查一下是否出現(xiàn)之。2．寫完文章后，要多檢查幾遍，注意文中錯別字問題，特別是“的、地、得”的誤用問題（本科生的論文中大量出現(xiàn)此類問題）。5．9關(guān)于縮略語、外來語、文獻(xiàn)名、軟件名稱及其版本號1．縮略語正文中初次出現(xiàn)縮略語時應(yīng)給出原文。形式如下：MIS（ManagementInformationSystem，管理信息系統(tǒng)）順便說明一下，重點術(shù)語，即使非縮寫，亦應(yīng)給出原文。2．外來語外來語大小寫應(yīng)統(tǒng)一。例如：Internet，INTERNET，internet應(yīng)統(tǒng)一為Internet，不可混用。3．文獻(xiàn)名文獻(xiàn)名（特別是擴(kuò)展名）一般應(yīng)大寫。4．軟件名稱以及版本號介紹軟件名稱以及版本號時，要注旨在軟件名和版本號之間加一個半角的空格，如：Windows2023（錯誤）、Windows2023（對的）。Windows不可寫為Window。軟件名稱中，字母的大小寫應(yīng)前后一致。常用軟件名稱的寫法如下：PowerBuilder9.0,FoxPro2.5,VFP6.0,VB6.0,VC++6.0,C++Builder,C#,Delphi,ASP,SQLServer2023，Oracle9i，SybaseSQLAnywhere等。5．10關(guān)于句子1．要做到語法對的、句子通順，注意語義連貫性，杜絕病句。一般句子規(guī)定有主語、謂語，及物動詞還應(yīng)帶賓語（本不該在此提及此類“小兒科”之事，但畢業(yè)論文中的的確確存在著大量病句，尤以無主句為盛。要反反復(fù)復(fù)、認(rèn)認(rèn)真真地讀每一個句子，復(fù)讀數(shù)十遍，毛病必自現(xiàn)）。以祈使句描述某一過程時可以使用無主句，特殊情況下也可以使用無主句。例如：“為了提高CPU超頻的成功率，可把其核心電壓提高0.1-0.2伏”。2．要用書面語，忌用口頭語，忌用“網(wǎng)絡(luò)語言”，忌用非專業(yè)術(shù)語?！斑@個問題前面已經(jīng)說過了，所以這里就不多說了?！保ú缓茫霸搯栴}前已提及，此處不復(fù)贅述?！保ê茫斑\營了N多遍?！保O差）“文獻(xiàn)的后綴”應(yīng)改為“文獻(xiàn)的擴(kuò)展名”。3．用語簡明扼要，切忌煩瑣?！坝捎诋厴I(yè)設(shè)計只有三四個月的時間，比較短，所以該系統(tǒng)免不了尚有許多不盡如人意的地方，這些都有待于在下一個版本中進(jìn)行進(jìn)一步的完善?！保ú缓茫耙驎r間所限，系統(tǒng)不盡人意之處在所難免，尚有待進(jìn)一步完善?！保ê茫?．中文句、英文句應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分，不要土洋結(jié)合，不倫不類?！笆褂闷饋矸浅asy，只需點一下mouse就OK了?！保ú缓茫?．11關(guān)于稱謂每篇論文均系一人所作，故不要張口閉口地用“我們”?！拔摇弊衷诳萍颊撐闹酗@得過于乏味，可代之以“筆者”、“本人”。5．12關(guān)于程序大量的程序不宜出現(xiàn)于正文中，但少量程序、核心代碼或腳本可以穿插于正文之中；量大時建議放于附錄中，不要給人以充字?jǐn)?shù)之嫌。5．13關(guān)于計量單位介紹內(nèi)存、外存容量以及軟件的大小時，注意將單位寫清楚、寫規(guī)范。如：353K（錯誤）、353KB（對的）、256M（錯誤）、256MB（對的）。5．14關(guān)于下載地址介紹軟件下載地址時，一定要有最終地址，不要寫成:.cfan之類的，而要寫成:.cfandownloadscfan.exe之類。正文中盡量避免出現(xiàn)下載地址，最佳放于參考文獻(xiàn)中。5．15關(guān)于表達(dá)式（含方程等）公式、表達(dá)式一般應(yīng)居中排版。若帶有編號，編號應(yīng)加圓括號，并靠右對齊。例如：a2+b2=c2(2-1)公式如有上、下角標(biāo)，應(yīng)對的使用。變量應(yīng)使用斜體排版，常量用正體排版。建議使用word的公式編輯器進(jìn)行排版。第六章關(guān)于封面“畢業(yè)論文”一行的下面直接寫論文題目，不必畫蛇添足，多寫“題目：”二字。你見過哪本書的封面上寫著“書名：XXXXXX”嗎？姓名為兩個字時，中間應(yīng)加兩個空格。班級名應(yīng)規(guī)范化。本校計算機(jī)專業(yè)全稱為“計算機(jī)科學(xué)與技術(shù)”。第七章關(guān)于參考文獻(xiàn)工大學(xué)報幾乎每篇文章最后均附有參考文獻(xiàn)，其格式十分正規(guī)，分為著作、論文、網(wǎng)文、學(xué)位論文等幾類，格式各異。參考文獻(xiàn)以正文中引用的先后順序排列。以下分別是著作、學(xué)位論文和期刊的例子：[1]王興業(yè)，唐羽章．復(fù)合材料力學(xué)性能[M]．長沙：國防科技大學(xué)出版社，1988：366–382．[2]李玉彬．環(huán)氧樹脂電子束固化機(jī)制與應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D]．北京：北京航空航天大學(xué)，2023．[3]武德珍，宋勇志，金日光．PVC彈性體納米CaCO3復(fù)合體系的加工和組成對力學(xué)性能的影響[J]．復(fù)合材料學(xué)報，2023，21(1)：119–124．第八章關(guān)于結(jié)束語寫畢業(yè)設(shè)計的收獲、感想、局限性，以及哪些地方尚可改善。忌諱大段引用正文中的句子。第九章關(guān)于翻譯最佳寫明所譯材料的出處，最佳提供原書的影印件（建議使用掃描儀掃描）。所譯之材料在內(nèi)容上最佳有一定的相對獨立性，且應(yīng)有標(biāo)題，內(nèi)容盡量與所做課題接近。第十章關(guān)于謝辭9．1稱謂問題謝辭中，“感謝指導(dǎo)教師XXX”顯得不夠禮貌，“XXX”后應(yīng)有個稱謂（博士、專家、老師、先生、女士、同志……）。9．2病句與錯別字問題9．2．1病句的典型例子及其改法（1）“感謝單位領(lǐng)導(dǎo)的大力支持，使我在繁忙的工