TFJCA 003-2024 特殊食品和化妝品 減脂功效測試 秀麗隱桿線蟲法

ICS19.020CCSC04FJCASpecialfoodsandcosmetics—Anti-obesitytest—CaenorhabditIT/FJCA003—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由福建上源生物科學(xué)技術(shù)有限公司提出。本文件由福建省特殊食品與化妝品協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：福建上源生物科學(xué)技術(shù)有限公司、安發(fā)（福建）生物科技有限公司、廣東丸美生物技術(shù)股份有限公司、福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院。本文件主要起草人：張壬輝、高益槐、劉涵、劉用國、趙培、鄭春源、孫懷慶、張熠、陳嵐彬。1T/FJCA003—2024特殊食品和化妝品減脂功效測試秀麗隱桿線蟲法本文件規(guī)定了運(yùn)用秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans，以下簡稱“線蟲”）對(duì)特殊食品和化妝品進(jìn)行減脂功效測試的方法。本文件適用于特殊食品和化妝品減脂功效的測試，特殊食品和化妝品的原料可參考本方法執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB35/T2132—2023實(shí)驗(yàn)用秀麗隱桿線蟲飼育技術(shù)T/GDCA013—2022化妝品抗氧化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4符號(hào)和縮略語下列符號(hào)和縮略語適用于本文件。CAS：CAS登錄號(hào)（CASRegistryNumber）CI：空白對(duì)照組平均總強(qiáng)度值（IntensityofBlankControlGroup）IL：脂質(zhì)抑制率（InhibitionRateofLipid）LB：溶菌肉湯（Luria-Bertani）NGM：線蟲生長培養(yǎng)基（NematodeGrowthMedium）OP50-NGM：含有尿嘧啶合成缺陷型大腸桿菌的線蟲生長培養(yǎng)基（EscherichiacoliOP50onNematodeGrowthMedium）P：P值（Pvalue）SI：樣品組平均總強(qiáng)度值（IntensityofSampleGroup）t-test：T檢驗(yàn)（Student’sttest）5檢測原理油紅O是一種脂溶性二唑染料，可與線蟲的中性脂質(zhì)和膽固醇酯特異性結(jié)合而著色。線蟲通身透明，可以通過觀測油紅O在線蟲體內(nèi)的著色水平來判斷其脂肪含量。利用ImageJ2軟件處理線蟲的油紅著色樣圖即可進(jìn)行定量分析。6材料與試劑6.1材料所需材料如下：——線蟲、尿嘧啶合成缺陷型大腸桿菌（EscherichiacoliOP50，E.coliOP50——挑蟲器；——培養(yǎng)皿；2T/FJCA003—2024——移液槍。6.2試劑除非另有說明，化學(xué)試劑使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?。配制方法見附錄A及DB35/T2132—2023。油紅O（C26H24N4O）、氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl2）、硫酸鎂（MgSO4）、氯化鉀（KCl）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇、膽固醇、瓊脂粉（Agar）、LB、蛋白胨、異丙醇、免疫染色通透液（TritonX-100）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS緩沖液）。6.3陽性對(duì)照品奧利司他標(biāo)準(zhǔn)品（Orlistat），純度≥98％，CAS：96829-58-2。7實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備所需儀器與設(shè)備如下：——體視顯微鏡，放大倍數(shù)5倍～50倍；——恒溫培養(yǎng)箱，精度±1℃;——潔凈工作臺(tái)；——萬分之一天平，精度0.1mg；——高壓滅菌鍋；——高速離心機(jī)；——恒溫?fù)u床；——旋轉(zhuǎn)混勻儀；——﹣20℃冰箱；——光學(xué)顯微鏡，物鏡變倍不小于10倍。8測試方法8.1受試樣品處理配制受試樣品測試母液時(shí)，若受試樣品為水溶性物質(zhì)，則使用無菌雙蒸水作為溶劑；若受試樣品為非水溶性物質(zhì)，可選用DMSO作為溶劑。8.2線蟲NGM制備8.2.1空白對(duì)照組NGM的配制空白對(duì)照組NGM的配制按照DB35/T2132—2023的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。8.2.2受試樣品組NGM的配制受試樣品組NGM的配制按照T/GDCA013—2022的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。8.2.3陽性對(duì)照組NGM的配制陽性對(duì)照奧利司他組：用DMSO配制成6mg/mL母液，取奧利司他母液分別同熔融的NGM及E.coliOP50菌液按999:1比例混合均勻，將奧利司他終濃度為6μg/mL的NGM加入6cm培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，用移液槍吸取150μL奧利司他終濃度為6μg/mL的E.coliOP50菌液打在NGM板的中央，避光晾干后封膜，4℃保存?zhèn)溆谩?.3線蟲同期化線蟲的飼育與質(zhì)量控制應(yīng)按照DB35/T2132—2023的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。線蟲的生命周期見附錄B，挑取L4時(shí)期的線蟲轉(zhuǎn)移至OP50-NGM培養(yǎng)皿中，每皿放置30～50只，在20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d后，挑取20只至各組NGM培養(yǎng)皿中，產(chǎn)卵1h，而后將母蟲盡數(shù)挑出。20℃培養(yǎng)3d。3T/FJCA003—20248.4油紅O染色用1.5mL的PBST緩沖液將NGM培養(yǎng)皿上的線蟲沖洗轉(zhuǎn)移至無菌2mL離心管中，在845g轉(zhuǎn)速下離心1min，棄上清，加1.5mL的PBST緩沖液沖洗線蟲并在同樣條件下離心2次，棄上清。加入600μL的40%異丙醇，在旋轉(zhuǎn)混勻儀中，8g旋轉(zhuǎn)3min，棄上清，再加入600μL的油紅染液，在旋轉(zhuǎn)混勻儀中，8g旋轉(zhuǎn)2h。棄上清，加入600μL的PBST緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混勻儀中，8g旋轉(zhuǎn)30min，棄上清，余下50μL含線蟲的緩沖液，用于圖像的拍攝及脂質(zhì)的定量分析。8.5圖像拍攝及脂質(zhì)的定量分析取10μL待檢的線蟲緩沖液，滴加至載玻片中央，蓋上蓋玻片。在光學(xué)顯微鏡100×放大倍數(shù)下拍攝線蟲圖像，并使用ImageJ2軟件對(duì)圖像中線蟲紅色的脂質(zhì)進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)挑選至少20只線蟲進(jìn)行拍攝分析。9結(jié)果評(píng)價(jià)9.1統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用ImageJ2軟件對(duì)圖像中線蟲紅色的脂質(zhì)進(jìn)行定量分析，得到總強(qiáng)度值（分析方法見附錄C）。采用GraphPadPrism8軟件繪制柱狀圖并進(jìn)行t-test差異分析，P＜0.05表示有顯著性的差異。線蟲體脂抑制率計(jì)算見公式。9.2結(jié)果判斷及說明最終用于脂質(zhì)定量分析的單組實(shí)驗(yàn)線蟲數(shù)量不少于60條。線蟲的孵化率不低于95％。奧利司他陽性對(duì)照組應(yīng)與空白對(duì)照組應(yīng)具有顯著性差異且脂質(zhì)抑制率不低于30如附錄D所示）。受試樣品組線蟲的總強(qiáng)度值顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），且脂質(zhì)抑制率不低于10％說明樣品在該濃度下具有減少線蟲脂質(zhì)的功效。在同一批次實(shí)驗(yàn)中，可以通過比較不同樣品的線蟲脂質(zhì)抑制率來判定其減脂功效的強(qiáng)弱。4T/FJCA003—2024試劑配制A.1磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST緩沖液）1×PBS緩沖液100mL，10μL的TritonX-100，混勻。A.2油紅O染液36mg油紅O加入18mL異丙醇，混勻；再加入12mL的雙蒸水，混勻。5(資料性)線蟲生命周期蟲階段發(fā)育為成蟲。在L4期蛻皮后約12h,進(jìn)入產(chǎn)卵生殖期。在生殖期之后，線蟲可以再存活14d～21線蟲的生命周期如圖B.1所示。年輕成蟲(youngadult)四齡幼蟲(L4)在子宮外發(fā)育在子宮外發(fā)育620-650微米400微米沒有食物則停止發(fā)育二齡幼蟲(L2)250微米360-380微米圖B.1線蟲生命周期6T/FJCA003—2024ImageJ2測定線蟲紅色脂質(zhì)總強(qiáng)度的方法ImageJ2軟件下載地址：/Fiji/Downloads：1)在ImageJ2軟件中打開圖像（File—Open—SelectFile—Open）；2)選擇多邊形工具（菜單欄左至右第三個(gè)繪圖工具），在圖像上完整地勾勒出線蟲的輪廓，點(diǎn)擊窗口Edit—ClearOutside；3)調(diào)整顏色的閾值（Image—Adust—ColorThreshold），將Colorspace選擇為RGB格式，調(diào)