生物化學第二章 核酸化學2-性質(zhì)研究方法課件

主講教師：季祥郵箱：

第二章核酸化學生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法核酸§2.4核酸的理化性質(zhì)§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)核酸的性質(zhì)是由其結(jié)構(gòu)決定的。核酸的結(jié)構(gòu)特點是分子大,有一些可解離的基團,具有共軛雙鍵等.這些特點決定了核酸及其組分核苷酸性質(zhì)的基礎(chǔ).下面介紹幾種重要的性質(zhì):生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)一、物理性質(zhì)1、性狀：RNA及其組分核苷酸、核苷、嘌呤堿、嘧啶堿的純品都呈白色的粉末或結(jié)晶；DNA則為疏松的石棉一樣的纖維狀固體。2、溶解性：RNA和DNA都是極性的化合物，一般說來，這些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑。它們的鈉鹽易溶于水。DNA和RNA在生物細胞內(nèi)都與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。DNA核蛋白與RNA核蛋白的溶解度受溶液的鹽濃度的影響而不同。DNA蛋白在低濃度的鹽溶液中隨鹽濃度的增加而增加，在1mol/L的NaC溶液中溶解度比純水高2倍，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，僅為水的1%，幾乎不溶解；而RNA蛋白在鹽溶液中其溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L的NaCl溶解度較大。因此，在核酸的提取中，常用此法將兩種核蛋白分開，然后用蛋白質(zhì)變性劑去除蛋白質(zhì)。3、粘性：核酸的水溶液粘度很大，粘度DNA大于RNA。核酸變性后，粘度下降。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)二、核酸的水解生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)三、核酸的兩性電離與等電點

核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質(zhì)。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點偏酸性。DNA的pI約為4～5，RNA的pI約為2.0～2.5，在pH7～8電泳時泳向正極。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)四、UV吸收：核酸分子中含有嘌呤堿和嘧啶堿，因而具有紫外吸收的的性質(zhì)，在260nm處核酸紫外吸收最強。核酸的紫外吸收是核酸定量測定的基礎(chǔ)。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)五、DNA的變性、復性與分子雜交

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，不僅與其生物功能有密切關(guān)系，還能解釋DNA的重要特性變性與復性，這對于深入了解DNA分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系又有重要意義。（一）DNA變性(denaturation)1、DNA變性的概念：指DNA分子中的雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。2、DNA變性的本質(zhì)：維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。3、導致DNA變性的因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)4、變性DNA的特征：（1）溶液粘度降低：DNA雙螺旋是緊密的剛性結(jié)構(gòu)，變性后轉(zhuǎn)化成柔軟而松散的無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，因此粘度明顯下降。（2）旋光性發(fā)生變化：變性后整個DNA分子的對稱性及分子構(gòu)型改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。（3）紫外吸收增強。增色效應(hyperchromiceffect)：指DNA變性后其紫外吸收明顯增強的效應。DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)對雙鏈DNA進行加熱變性，當溫度升高到一定高度時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，吸光度也不再明顯變化。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖，得到的典型DNA變性曲線呈S型如上圖所示。可見，DNA變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，又稱融解溫度(Tm,meltingtemperature)。在Tm時，核酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。特定核酸分子的Tm值與其G＋C所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān)，兩者的關(guān)系可表示為：生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)Tm=69.3＋0.41(G+C)%一定條件下(相對較短的核酸分子)，Tm值大小還與核酸分子的長度有關(guān)，核酸分子越長，Tm值越大；另外，溶液的離子強度較低時，Tm值較低，融點范圍也較寬，反之亦然，因此DNA制劑不應保存在離子強度過低的溶液中。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)(二)DNA的熱變性與復性(renaturation)指經(jīng)加熱變性的DNA在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為退火(annealing)。這一術(shù)語也用以描述雜交核酸分子的形成(見后)。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)

DNA的復性不僅受溫度影響，還受DNA自身特性等其它因素的影響：1、溫度和時間：一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件，越遠離此溫度，復性速度就越慢。復性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下)，復性幾乎是不可能的，核酸實驗中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利于復性。2、DNA濃度：溶液中DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合的機會越大，有利于復性。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)3、DNA順序的復雜性：簡單順序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復性時，互補堿基的配對較易實現(xiàn)。而順序復雜的序列要實現(xiàn)互補，則困難得多。在核酸復性研究中，定義了一個Cot的術(shù)語，(Co為單鏈DNA的起始濃度，t是以秒為單位的時間)，用以表示復性速度與DNA順序復雜性的關(guān)系。在探討DNA順序?qū)托运俣鹊挠绊憰r，將溫度、溶劑離子強度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定，以不同復雜程度的核酸分子重締合部分(在時間t時的復性率)對Cot作圖，可以得到如圖下圖所示的曲線：生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)不同物種核酸的Cot曲線：生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)曲線上方為示復雜性的核酸分子的非重復堿基對數(shù)。如多聚(A)的復雜性為1，重復的(ATGC)n組成的多聚體的復雜性為4，分子長度是105核苷酸對的非重復DNA的復雜性為105。

原核生物基因組均為非重復順序，故以非重復核苷酸對表示的復雜性直接體現(xiàn)基因組大小(圖上方的箭頭所指為基因大小)，對于真核生物基因組中的非重復片段也是如此。在標準條件下(一般為0.18ml/L陽離子濃度，400核苷酸長的片段)測得的復性率達0.5時的Cot值(稱Cot1/2)，與核苷酸對的復雜性成正比。對于原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的復雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重復序列(repetitivesequence)，所得到的Cot曲線更為復雜。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)

DNA的變性和復性原理，現(xiàn)已在醫(yī)學和生命科學上得到廣泛的應用。如核酸雜交與探針技術(shù)，聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)等。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)（三）分子雜交：(hybridization)不同來源的核酸變性后，合并在一處進行復性，這時，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補配對的片段，復性也會發(fā)生于不同來源的核酸鏈之間，即形成所謂的雜化雙鏈(heteroduplex)，這個過程稱為雜交(hybridization)。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)雜交可以發(fā)生于DNA與DNA之間，也可以發(fā)生于RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。例如，一段天然的DNA和這段DNA的缺失突變體(假定這種突變是DNA分子中部丟失了若干堿基對)一起雜交，電子顯微鏡下可以看到雜化雙鏈中部鼓起小泡。測定小泡位置和長度，可確定缺失突變發(fā)生的部位和缺失的多少。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們在進化中的關(guān)系，其主要應用如下圖所示：生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)核酸雜交及其應用示意圖Ⅰ.變性、復性和雜交。粗細線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈Ⅱ.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內(nèi)是已缺失的部分；D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡Ⅲ.粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標記生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.4核酸的理化性質(zhì)在核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種用于研究和診斷的非常有用的技術(shù)稱探針技術(shù)(Probe)。探針技術(shù)在遺傳性疾病診斷上已開始應用。例如診斷地中海貧血或血紅蛋白病，可以由已確診的病人白細胞中提取DNA，這就是診斷探針。用診斷探針檢查，不但可以對有癥狀患者進行確診，還可以發(fā)現(xiàn)一些沒有癥狀的隱性遺傳性疾病。如從胎兒的羊水可以提取到少量DNA后，再用探針技術(shù)對此進行產(chǎn)前診斷各種遺傳性疾病已在臨床上開展。雜交和探針技術(shù)是許多分子生物學技術(shù)的基礎(chǔ)，在生物學和醫(yī)學的研究中，以及臨床診斷中得到了日益廣泛的應用。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法一、分離核酸的一般原則因為遺傳信息全部貯存在核酸的一級結(jié)構(gòu)中，故完整的一級結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；排除其它分子的污染。（一）核酸的分離和純化時應遵循兩個原則：生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法（二）核酸的純度要求①核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時，應去除RNA，反之亦然。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法（三）核酸分離純化的注意事項為保證分離核酸的完整性和純度，在實驗中應注意：①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞；②減少化學物質(zhì)對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進行；③防止核酸的生物降解。細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要金屬二價陽離子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素；生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法④

減少物理因素對核酸的降解，物理降解因素主要是機械剪切力，其次是高溫。

機械剪切力包括強力高速的溶液振蕩、攪拌，細胞突然置于低滲液中；細胞爆炸式地破裂及DNA樣品的反復凍融等。這些操作細節(jié)在實驗操作中應加倍注意。機械剪切作用的主要危害對象是大分子量的線性DNA分子，如真核細胞的染色體DNA等。高溫，如長時間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過程中常規(guī)操作溫度為0～4℃以降低核酸酶的活性從而減少對核酸的生物降解。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法二、核酸分離純化的一般步驟破碎細胞→去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子→沉淀核酸→去除鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)→純化干燥→溶解核酸提取方案，應根據(jù)具體生物材料和待提取核酸分子的特點而定。對于某特定細胞器中富集的核酸分子，采用先提取細胞器后再提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法三、核酸的測定方法1、紫外吸收法在一定pH下測定樣品的紫外吸光度（A260），即可由下式計算樣品中的核酸含量：C=Mr×A260/ε×L其中：C為核酸的含量（mg/mL），Mr為相對分子質(zhì)量，A260為核酸溶液的吸光度，ε為摩爾消光系數(shù)（即1升溶液中含1摩爾核酸的光吸收值），L為比色杯的內(nèi)徑（cm）生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法2、定糖法

RNA的測定：RNA分子中所含的核糖經(jīng)濃硫酸或濃鹽酸作用脫水生成糠醛，糠醛可與3，5-二羥甲苯（苔黑酚或地衣酚）反應生成綠色化合物，該化合物可在670-680nm波長下進行比色測定。

DNA的測定：DNA分子中的脫氧核糖在冰醋酸或濃硫酸存在下可與二苯胺反應生成蘭色化合物，該化合物可在595-620nm波長下進行比色測定。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法3、定磷法

RNA和DNA中都含有磷酸，可以進行磷的測定。純的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，測出核酸中的磷含量就可計算核酸的含量。測定時先將核酸用強酸消化成無機磷酸，后者與定磷試劑中的鉬酸反應生成磷鉬酸，在經(jīng)過還原作用而生成藍色的復合物，最后在650-660nm進行比色測定。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法四．核酸研究方法（一）核酸的沉降特性溶液中的核酸在引力場中可以下沉。在超速離心機造成的強大的離心力場中，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的超速離心用于：1、測定核酸的浮力密度；2、測定DNA分子中的G、C含量；3、測定溶液中核酸的構(gòu)象，核酸經(jīng)染料—氯化銫密度梯度離心以后，在離心管里，沉降的速度由大到小依次為：超螺旋DNA、閉環(huán)質(zhì)粒DNA、開環(huán)及線型DNA，若樣品中含有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)沉降速度最小。4、核酸的制備。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法（二）核酸的凝膠電泳凝膠電泳是當前核酸研究中最常用的方法，有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。前者常用于DNA的分離分析，后者用于RNA的分離分析。生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法五、核酸的序列測定生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法§2.5核酸的分離純化、測定及研究方法生物化學第二章核酸化學2-性質(zhì)研究方法

DNA的一級結(jié)構(gòu)的測定方法1.Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法測序）

DNA的合成總是從5′端向3′端進行的。DNA的合成需要模板以及相應的引物鏈。DNA的合成過程中，在合成的DNA鏈的3′末端，依據(jù)堿基配對的原則，通過生成新的3′,5′－磷酸二酯鍵，使DNA鏈合成終止，產(chǎn)生