第五章-免疫學(xué)檢測(cè)及應(yīng)用

第五章

免疫學(xué)檢測(cè)及應(yīng)用第一節(jié)沉淀反應(yīng)第二節(jié)凝集反應(yīng)第三節(jié)補(bǔ)體參與的抗原 抗體反應(yīng)第四節(jié)中和反應(yīng)第一節(jié)沉淀反應(yīng)一、沉淀反應(yīng)的原理二、沉淀反應(yīng)的種類和特性返回一、沉淀反應(yīng)的原理免疫沉淀反應(yīng)（precipitation）：

是指可溶性抗原分子與特異性抗體分子在溶液或凝膠中相混合形成復(fù)合物，當(dāng)兩者的比例合適時(shí)，可相互作用產(chǎn)生較大的不溶性免疫復(fù)合物析出，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的不溶性沉淀物。沉淀反應(yīng)曲線

沉淀反應(yīng)中：

抗體也稱沉淀素（precipitin）

抗原為沉淀原（precipitinogen）返回二、沉淀反應(yīng)的種類和特性

根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的環(huán)境條件及附加因素，沉淀反應(yīng)可分為兩種主要形式：

1．溶液中沉淀反應(yīng)

2．凝膠中沉淀反應(yīng)返回1．溶液中沉淀反應(yīng)

（Precipitationreactioninsolution）

是指在清徹透明的液體中，呈溶解狀態(tài)的抗原與抗體在試管內(nèi)或凹玻片上混勻，可凝聚成為肉眼可見(jiàn)的絮狀或顆粒狀的不溶性沉淀物。溶液中沉淀反應(yīng)

鹽溶液抗原

+抗體———

沉淀

20~56℃、pH6～8

抗原：沉淀原抗體：沉淀素1．溶液中沉淀反應(yīng)

（Precipitationreactioninsolution）

（1）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)（2）免疫比濁法（3）免疫沉淀技術(shù)返回（1）環(huán)狀沉淀試驗(yàn) 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)

（ringprecipitationtest）或毛細(xì)管內(nèi)沉淀反應(yīng) （precipitationin capillarytube）返回（2）免疫比濁法(immunonephelomytry）

可溶性的抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)渾濁。復(fù)合物的量與濁度成正比。與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可計(jì)算出樣品中的抗原或抗體含量。返回免疫沉淀技術(shù)細(xì)胞膜成分的分析膜分子的研究返回2．凝膠中沉淀反應(yīng)（Precipitationreactioningel）

1968年Ouchterlong發(fā)明的。即將抗原抗體溶液放在瓊脂凝膠板上的小孔中，使它們彼此對(duì)向擴(kuò)散，在抗原抗體相遇的地方形成沉淀線。2．凝膠中沉淀反應(yīng)此沉淀線的突出性質(zhì)是：特異性抗原抗體不能通過(guò)；與沉淀線無(wú)關(guān)的抗原和抗體分子則可自由通過(guò)此沉淀線。2．凝膠中沉淀反應(yīng)（1）單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（2）雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（3）免疫電泳（4）火箭電泳試驗(yàn)（5）免疫印跡技術(shù)返回單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)返回FLASH雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)返回FLASH1FLASH2（3）免疫電泳（immunoelectrophoresis）免疫電泳FLASH返回（4）火箭電泳試驗(yàn)返回又稱Westernblotting電泳印漬及檢測(cè)（5）免疫印漬技術(shù)（immunoblotting）免疫印漬HIV的免疫印漬返回第二節(jié)凝集反應(yīng)

一、凝集反應(yīng)的原理二、凝集反應(yīng)的種類和特性

返回一、凝集反應(yīng)的原理

凝集反應(yīng)（agglutination）：是指顆粒型抗原（如細(xì)菌或吸附在乳膠、離子交換樹(shù)脂等不溶性的顆粒上的抗原），以及細(xì)胞型抗原（如紅細(xì)胞或吸附在紅細(xì)胞上的抗原）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，可形成肉眼可見(jiàn)的凝集團(tuán)塊。凝集反應(yīng)中的抗體稱為凝集素而抗原為凝集原凝集反應(yīng)的特性

凝集反應(yīng)的原理和影響因素與沉淀反應(yīng)相同，但凝集反應(yīng)有如下特性：

1．凝集反應(yīng)中的抗原為較大的顆?？乖?，離心沉淀可使顆粒下沉，而在沉淀反應(yīng)中，抗原卻是最細(xì)微的膠狀溶液，溶液大多清晰透明。２．凝集反應(yīng)中凝集塊主要由抗原懸液形成，而在沉淀反應(yīng)中，沉淀物主要由抗體形成。３．凝集反應(yīng)因?yàn)榭乖肿哟?，為使抗原與抗體在等當(dāng)點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)，需稀釋免疫血清中的抗體，使抗體分子不致于過(guò)多，而沉淀反應(yīng)因抗原分子小，具有較大的反應(yīng)面積，為了不使抗原過(guò)多則需稀釋抗原。返回二、凝集反應(yīng)的種類和特性

返回1．直接凝集反應(yīng)2．間接凝集反應(yīng)3．病毒的血凝和血凝抑制反應(yīng)4．橋梁凝集反應(yīng)5．共同凝集反應(yīng)1．直接凝集反應(yīng)

（directagglutination） 是將細(xì)菌或紅細(xì)胞與其相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。1．直接凝集反應(yīng)（1）微生物凝集反應(yīng) 如診斷傷寒病的肥達(dá)氏（Widalreaction）反應(yīng)（2）同種紅細(xì)胞凝集反應(yīng)如檢查血型的血細(xì)胞凝集現(xiàn)象紅細(xì)胞凝集反應(yīng)紅細(xì)胞凝集反應(yīng)的結(jié)果返回2．間接凝集反應(yīng)

（indirectagglutination）

用可溶性抗原（或抗體）包被在一種與免疫無(wú)關(guān)的、具一定大小的不溶性顆粒（即載體顆粒，如：乳膠顆粒或紅細(xì)胞）的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在有適宜電解質(zhì)存在的條件下，結(jié)合產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象。2．間接凝集反應(yīng) 如用細(xì)菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳膠顆粒，一旦與含有相應(yīng)抗原的腦脊液混合，便可發(fā)生凝集現(xiàn)象。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體；方法簡(jiǎn)便、敏感。2．間接凝集反應(yīng)（1）正向間接凝集反應(yīng)

（2）反向間接凝集反應(yīng)（3）間接凝集抑制反應(yīng)

返回（1）正向間接凝集反應(yīng)

將抗原先吸附在載體表面，然后與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。

正向間接凝集反應(yīng)返回（2）反向間接凝集反應(yīng)

將特異性抗體先吸附在載體表面，然后與相應(yīng)抗原結(jié)合產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。

此方法對(duì)檢測(cè)微量抗原具有較高的敏感性。而且由于相關(guān)病原體的抗原成分一般情況下比血清抗體出現(xiàn)早，所以可用于某些傳染病如鉤端螺旋體抗原和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或原發(fā)性肝癌AFP的檢測(cè)等。返回（3）間接凝集抑制反應(yīng)

先將可溶性抗原加到相應(yīng)抗體中，使抗體先與該可溶性抗原結(jié)合，則抗體就不能與致敏的顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)。返回3．病毒的血凝和血凝

抑制反應(yīng)

有些病毒如粘病毒、痘類病毒、呼吸道腸道病毒、某些腺病毒等，均能凝集某種哺乳類和禽類的紅細(xì)胞，稱之為病毒血凝反應(yīng)，特異性抗體可以抑制這種反應(yīng)，稱之為病毒的血凝抑制反應(yīng)。

返回4．橋梁凝集反應(yīng)

又稱Coombs抗球蛋白試驗(yàn)。此試驗(yàn)用于檢測(cè)不完全抗體。Coombs

抗球蛋白試驗(yàn)返回5．共同凝集反應(yīng)

又稱協(xié)同凝集反應(yīng)。指由兩種顆粒成分相互作用而發(fā)生的凝集反應(yīng)。5．共同凝集反應(yīng)（1）細(xì)菌抗體與攜帶蛋白A的金黃色葡萄球菌CowanⅠ系致敏，即通過(guò)其IgG的Fc段與蛋白A結(jié)合，再與相應(yīng)細(xì)菌發(fā)生凝集反應(yīng)。（2）玫瑰花結(jié)試驗(yàn)：主要用于研究各種淋巴細(xì)胞特性。

返回返回淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞形成

玫瑰花結(jié)的主要模式

玫瑰花結(jié)的類型紅細(xì)胞的類型及處理淋巴細(xì)胞類型E花結(jié)綿羊紅細(xì)胞T、50%NKEA花結(jié)抗體致敏的紅細(xì)胞B、T、NK、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞EAC花結(jié)補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞B綿羊紅細(xì)胞受體及E玫瑰花環(huán)形成示意圖

B細(xì)胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖

淋巴細(xì)胞的分離玫瑰花結(jié)返回

第三節(jié)

補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)

一、補(bǔ)體反應(yīng)的原理二、補(bǔ)體參與抗原抗體反應(yīng) 的種類和特性

返回補(bǔ)體反應(yīng)的原理

返回二、補(bǔ)體參與抗原抗體

反應(yīng)的種類和特性

1．補(bǔ)體參與直接的抗原抗 體反應(yīng)2．補(bǔ)體參與間接的抗原 抗體反應(yīng)

返回1．補(bǔ)體參與直接的

抗原抗體反應(yīng)

（1）溶血反應(yīng)（2）溶菌反應(yīng)（1）溶血反應(yīng)

（hemolyticassay）溶血反應(yīng)常作為是否存在游離補(bǔ)體的指示系統(tǒng)。（1）溶血反應(yīng)

1942年Rutstein和Walker根據(jù)補(bǔ)體能使兔抗羊紅細(xì)胞抗體致敏的羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血的特點(diǎn)，建立了測(cè)定血清中總補(bǔ)體活性的方法（即50%溶血反應(yīng)CH50

測(cè)定方法）（1）溶血反應(yīng)

即求得能使50%致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血的最小量血清，然后計(jì)算出每毫升血清中補(bǔ)體的含量。血清中每毫升補(bǔ)體含量（單位）

=1/血清用量

稀釋倍數(shù)

（2）溶菌反應(yīng)

溶菌反應(yīng)常作為某血清中是否存在相應(yīng)抗體的檢測(cè)方法。返回2．補(bǔ)體參與間接的

抗原抗體反應(yīng)

（1）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（2）被動(dòng)紅細(xì)胞溶解試驗(yàn)（3）溶血空斑試驗(yàn)

返回（1）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complementfixationtest）

1901年由Bordet和Gengou首先應(yīng)用溶血反應(yīng)作為指示系統(tǒng)，建立的檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)的方法。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)原理是根據(jù)補(bǔ)體作用無(wú)特異性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的，補(bǔ)體能與任何抗原與抗體反應(yīng)所形成的復(fù)合物吸附并激活補(bǔ)體的原理而設(shè)計(jì)的一種血清學(xué)反應(yīng)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)原理補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后不引起可見(jiàn)反應(yīng)，但可用指示系統(tǒng)測(cè)定補(bǔ)體是否被結(jié)合，從而間接地檢測(cè)反應(yīng)系統(tǒng)是否存在抗原抗體復(fù)合物。是測(cè)定可溶性抗體或抗原的一種敏感的方法。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)第一步：抗原抗體混合物與定量的補(bǔ)體于37℃水浴中作用第二步：用兔抗SRBC溶血素致敏的SRBC懸液加到混合物中作為指示系統(tǒng)，以檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)之后的游離的補(bǔ)體。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)返回（2）被動(dòng)紅細(xì)胞溶解試驗(yàn)

即吸附抗原的紅細(xì)胞在有相應(yīng)抗體和補(bǔ)體存在時(shí)，出現(xiàn)紅細(xì)胞溶解反應(yīng)。抗原致敏紅細(xì)胞——加入待測(cè)血清和補(bǔ)體——判斷結(jié)果（陽(yáng)性對(duì)照：加入相應(yīng)抗體和補(bǔ)體）

返回（3）溶血空斑試驗(yàn)

是測(cè)定B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和分泌抗體功能的一種體外試驗(yàn)方法。

將SRBC免疫小鼠后取其脾臟細(xì)胞，在體外與高濃度的SRBC混合，加到瓊脂凝膠層中孵育，待相應(yīng)的抗體形成細(xì)胞釋放抗體并致敏周圍的SRBC，在補(bǔ)體存在時(shí)，致敏的SRBC發(fā)生溶解現(xiàn)象，在抗體形成細(xì)胞周圍產(chǎn)生溶血圈，就稱為溶血空斑試驗(yàn)。

（3）溶血空斑試驗(yàn)直接溶血空斑試驗(yàn)間接溶血空斑試驗(yàn)

改良型溶血空斑試驗(yàn)

返回直接溶血空斑試驗(yàn)

測(cè)定溶血效率較高的IgM型溶血性抗體。

返回間接溶血空斑試驗(yàn)

測(cè)定溶血效率較低的IgG型抗體時(shí)，需要加入抗球蛋白抗體。

返回改良型溶血空斑試驗(yàn)

將抗原致敏SRBC，與相應(yīng)的抗體形成細(xì)胞混合后，加到瓊脂凝膠層中，抗體形成細(xì)胞則釋放溶血性抗體與周圍致敏的SRBC發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)補(bǔ)體存在時(shí)，致敏的SRBC發(fā)生溶解現(xiàn)象，在抗體形成細(xì)胞周圍產(chǎn)生溶血圈。這個(gè)技術(shù)可測(cè)定紅細(xì)胞以外的其他抗原。

溶血空斑試驗(yàn)返回第四節(jié)中和反應(yīng)

一、中和反應(yīng)的原理及特點(diǎn)二、中和反應(yīng)的類型返回一、中和反應(yīng)的原理及特點(diǎn)

中和反應(yīng)（neutralization）：是免疫學(xué)和病毒學(xué)中常用于檢測(cè)中和抗體是否存在及其效價(jià)的試驗(yàn)，反映抗體中和病毒感染性或細(xì)菌毒素的生物學(xué)效應(yīng)。 中和抗體：病原微生物侵入機(jī)體后，使之產(chǎn)生能中和相應(yīng)微生物及其毒性產(chǎn)物（毒素），從而使病原微生物喪失感染能力或毒力的抗體。（中和抗體：能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體?？苟舅兀耗芘c細(xì)菌外毒素結(jié)合，中和其毒性作用的抗體。）中和反應(yīng)的原理

即將被檢血清與病原微生物混合，經(jīng)適當(dāng)時(shí)間作用后，接種于宿主系統(tǒng)（包括動(dòng)物、雞胚或培養(yǎng)細(xì)胞），按照對(duì)其產(chǎn)生的保護(hù)效果的差異，可判斷該微生物或毒素是否已被中和，并計(jì)算出中和的程度（中和指數(shù)），即代表中和抗體效價(jià)。中和反應(yīng)的特點(diǎn)

（1）檢測(cè)機(jī)體內(nèi)是否存在中和抗體以及中和抗體的效價(jià)，直接反應(yīng)機(jī)體抗病毒的能力，有利于臨床診斷；（2）中和抗體在體內(nèi)存留時(shí)間一般較長(zhǎng)，可用于流行病學(xué)調(diào)查；（3）中和反應(yīng)有嚴(yán)格的種、型特異性，可對(duì)分離的病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定。缺點(diǎn)：操作麻煩，試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)。返回二、中和反應(yīng)的類型

1．終點(diǎn)法中和反應(yīng)2