【芒果腐敗微生物的細菌進行分離純化及抑菌劑的選擇探究（論文）9100字】

芒果腐敗微生物的細菌進行分離純化及抑菌劑的選擇研究TOC\o"1-3"\u摘要 Ⅲ前言 1第1章緒論 21.1芒果的營養(yǎng)價值 21.2芒果的功效作用 21.3常見腐敗果品中的微生物 41.4研究目的及內(nèi)容 91.4.1研究目的及意義 91.4.2研究內(nèi)容 91.5腐敗微生物分離鑒定的方法 51.5.1分離的方法 51.5.2鑒定的方法 傳統(tǒng)方法 現(xiàn)代方法 61.6腐敗微生物的控制方法 71.6.1低溫處理 71.6.2輻照保藏 71.6.3抑菌劑控制 7第2章材料及方法 102.1實驗材料 102.2實驗方法 102.2.1分離純化 102.2.2回接試驗 112.2.3細菌鑒定 112.2.4抑菌試驗 12第3章結(jié)果與分析 133.1腐敗微生物的分離純化 133.2芒果腐敗微生物細菌的鑒定 133.2.1細菌G1鑒定結(jié)果 133.2.2細菌G2鑒定結(jié)果 143.3芒果腐敗微生物細菌的控制 153.3.1細菌抑制劑的篩選 15結(jié)論 17參考文獻 18摘要在我國芒果種植面積大，產(chǎn)量豐富，對我國農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟中起著很大作用，然而芒果在采收后極易受到微生物的侵害，并且在運輸中逐漸腐敗，對芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著明顯的阻礙作用。本文主要研究芒果腐敗微生物的細菌，并對其采用組織分離法對引起芒果腐敗微生物的細菌進行分離純化，通過回接實驗驗證所分離的微生物細菌是否是具有致腐性。利用形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，確定引起芒果腐敗的微生物的種類。之后采用濾紙片法進行細菌抑制試驗，最后選擇最佳抑菌劑。結(jié)果分析：通過分離純化分離出兩種菌株，再通過形態(tài)學及生理生化鑒定出，兩種菌株都為芽孢桿菌屬，最后經(jīng)過16SrDNA通用引物擴增細菌兩種菌落，測序PCR產(chǎn)物，并進行同源性分析，最終確認兩種菌株分別為巨大芽孢桿菌和假蕈狀芽孢桿菌，再對這兩種菌株篩選最佳抑菌劑。關(guān)鍵詞：芒果腐??；腐敗微生物；細菌分離鑒定；腐敗控制前言芒果是杧果（\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"中國植物志）的通俗名（拉丁學名：Mangiferaindica

L.），芒果是一種原產(chǎn)印度的\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"漆樹科常綠大喬木，葉革質(zhì)，\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"互生；花小，雜性，黃色或淡黃色，成頂生的\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"圓錐花序。核果大，壓扁，長5-10厘米，寬3-4.5厘米，成熟時黃色，味甜，。芒果為著名\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"熱帶水果之一，芒果果實含有糖、\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"蛋白質(zhì)、\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"粗纖維，芒果所含有的\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"維生素A的\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"前體\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"胡蘿卜素成分特別高，是所有水果中少見的。其次\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"維生素C含量也不低。\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"脂肪、糖類等，也是其主要營養(yǎng)成分?？芍芢t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"果汁、\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"果醬、\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"罐頭、\t"/item/%E8%8A%92%E6%9E%9C/_blank"腌漬、酸辣泡菜及芒果奶粉、。在我國芒果種植面積大，產(chǎn)量豐富，對我國農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟中起著很大作用，然而芒果在采收后極易受到微生物的侵害，并且在運輸中逐漸腐敗，對芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著明顯的阻礙作用。因此本文以芒果為原料來研究芒果腐敗微生物的分離鑒定及怎樣控制微生物腐敗。第1章緒論1.1芒果的營養(yǎng)價值《食性本草》記載：“婦人經(jīng)脈不通，丈夫營衛(wèi)中血脈不行，葉可作湯療渴疾”?，F(xiàn)代科學研究發(fā)現(xiàn)，芒果具有良好的營養(yǎng)價值與保健功能。芒果的果肉的營養(yǎng)價值是很高的，例如VC、胡蘿卜素、三萜類、植物甾醇類、多酚類、酮酸異芒果醇酸等三醋酸和多酚類化合物等，尤其維C含量最多，還有很多其他豐富的營養(yǎng)元素，以上幾個只是它重要的營養(yǎng)元素。這些元素可以有效的免疫鎮(zhèn)痛、止咳化痰、抗菌抗癌，同時對痛風、明目等相關(guān)疾病也有很好的療效。芒果的果肉含有豐富的酮酸異芒果醇酸等三醋酸和。不僅如此，就連芒果皮，都可以抗擊糖尿病、治療濕疹和皮炎等，可以說渾身是寶。1.2芒果的功效作用1、功效：（1）芒果有益胃、止嘔、止暈的功效，對于眩暈癥、美尼爾綜合征、高血壓眩暈、惡心嘔吐等均有療效。在古代，凡漂洋過海者，無不隨身攜帶一些芒果，以解暈船之癥。果肉或以芒果煎水進食，對抑制孕婦作嘔也有很好的效果。（2）芒果能降低膽固醇、甘油三酯，常食有利于防治\t"/healthzq/1108/_blank"心血管疾病。芒果有祛疾止咳的功效，對咳嗽、痰多、氣喘等癥有輔助食療作用。芒果含芒果酮酸等化合物，具有抗癌的藥理作用。芒果的果汁能增加胃腸蠕動，使糞便在結(jié)腸內(nèi)停留時間變短，因此對防治結(jié)腸癌很有裨益。（3）芒果的\t"/healthzq/1108/_blank"胡蘿卜素含量特別高，有益于視力，能潤澤\t"/healthzq/1108/_blank"皮膚，是女士們的美容佳果。芒果中含有芒果苷，有明顯的抗脂質(zhì)過氧化和保護腦神經(jīng)元的作用，能延緩細胞衰老、提高腦功能。它可以明顯提高紅細胞過氧化氫酶活力和降低紅細胞血紅\t"/healthzq/1108/_blank"蛋白。它還有祛疾止咳的功效，對咳嗽、痰多、氣喘等癥有輔助。2、作用（1）食用芒果具有清腸胃的功效，對于\t"/healthzq/1108/_blank"暈車、暈船有一定的止吐作用。（2）抗癌。據(jù)現(xiàn)代食療觀點而言，芒果含有大量的\t"/healthzq/1108/_blank"維生素A，因此具有防癌、抗癌的作用。（3）美化肌膚。由于芒果中含有大量的維生素，因此經(jīng)常食用芒果，可以起到滋潤肌膚的作用。（4）防治高血壓、\t"/healthzq/1108/_blank"動脈硬化。芒果含有營養(yǎng)素及\t"/healthzq/1108/_blank"維生素C、\t"/healthzq/1108/_blank"礦物質(zhì)等，除了具有防癌的功效外，同時也具有防止動脈硬化及高血壓的食療作用。（5）防治便秘。土芒果中含有大量的纖維，可以促進排便，對于防治便秘具有一定的好處。（6）殺菌。芒果葉的提取物能抑制化膿球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌。同時還具有抑制。3、藥用效果：據(jù)\t"/healthzq/1108/_blank"中醫(yī)食療性味分析，\t"/healthzq/1108/_blank"芒果屬於性平味甘丶解渴生津的果品。（1）芒果有益胃、止嘔、止暈的功效，對於眩暈癥、梅尼埃綜合征、高血壓暈眩、惡心嘔吐等均有療效。果肉或以芒果煎水進食對孕婦作嘔也有很好的效果。（2）芒果能降低膽固醇，常食芒果有利於防治心\t"/healthzq/1108/_blank"血管疾病，有益於視力，能潤澤\t"/healthzq/1108/_blank"皮膚，是女士們的美容佳果。（3）芒果有祛疾止咳的功效，對咳嗽、痰多、氣喘等癥有輔助食療作用。（4）芒果的果汁能增加胃腸蠕動，使糞便在結(jié)腸內(nèi)停留時間變短，因此對防治結(jié)腸癌很有裨益。（5）含有\(zhòng)t"/healthzq/1108/_blank"胡蘿卜素，能益眼、1.3常見腐敗果品中的微生物水果中引起腐敗常見的微生物主要有細菌、酵母菌、霉菌。細菌：一般表現(xiàn)為食品的腐敗，是由于細菌活動分解食物中的蛋白質(zhì)和氨基酸，產(chǎn)生惡臭和異味的結(jié)果。酵母菌：在含碳水化合物較多的食品中容易繁殖；而在含蛋白質(zhì)豐富的食品中一般不生長。易受酵母菌作用的有：蜂蜜、果醬、果凍、醬油、。霉菌：易在有氧、水分少的干燥環(huán)境中繁殖，在富含淀粉和糖的食品中也容易滋生霉菌。1.4研究目的及內(nèi)容1.4.1研究目的及意義近年來我國對芒果產(chǎn)業(yè)的研究取得較大進展，漸漸發(fā)現(xiàn)芒果豐富的營養(yǎng)價值和功效，正在受到人們的日益關(guān)注和青睞，但是芒果在采后甚至之后的運輸貯藏過程中容易出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象，導致芒果中的營養(yǎng)品質(zhì)喪失，功能作用下降。所以本文針對在芒果中引起微生物腐敗變質(zhì)的情況，對引起芒果腐敗變質(zhì)的微生物進行分離純化鑒定，并利用形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定來確定引起芒果腐敗微生物的種類，之后篩選出最佳抑菌劑，并探討其抑菌機理。1.4.2研究內(nèi)容1.芒果腐敗微生物的分離純化對引起芒果腐敗微生物采用組織分離法進行分離純化，之后進行回接實驗來驗證所分離出的微生物是否具有致腐性。2.芒果腐敗微生物的鑒定利用形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，確定引起芒果腐敗的微生物的種類。3.芒果腐敗微生物的抑制從芒果中分離出有益菌，和利用乳酸菌進行試驗。也可以用溶菌酶、乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε-聚賴氨酸等抑菌劑，采用濾紙片法進行抑菌實驗。細菌生理生化試驗：①過氧化物酶活性試驗②淀粉水解試驗③葡萄糖水解試驗④阿拉伯糖水解試驗⑤木糖水解試驗⑥甘露醇水解試驗⑦V-P試驗⑧NacL耐受性試驗1.5腐敗微生物分離鑒定的方法1.5.1分離的方法微生物的分離方法主要有組織分離法、稀釋涂布平板法、平板劃線法這三種。不需要特殊儀器，分離純化的效果還很好，所以最常用的有這三種。組織分離法：也叫無性分離法，是利用子實體的組織塊，在適宜的培養(yǎng)基和生長條件下分離、培育純菌絲的一種簡易方法。這種分離法操作容易，后代能保持原菌株的優(yōu)良性，不易發(fā)生變異。涂布平板法：由固體介質(zhì)上的微生物形成的單一菌群，即是由單個細胞設(shè)計的計數(shù)方法來重現(xiàn)這種培養(yǎng)特征。將待測樣品制成均勻的稀釋液，需要使樣品中的微生物細胞保持分散狀態(tài)，促成單個細胞存在，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。平板劃線法：通過平板劃線獲得微生物純培養(yǎng)的方法。一種從混合微生物或不同的細胞中獲得更獨立分布的單個細胞，并將其生長成一個。1.5.2鑒定的方法傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)的微生物鑒定方法依賴于表型識別，主要是通過染色、培養(yǎng)和簡單的生化測試。1.宏觀特征：宏觀特征包括微生物的整體外觀、形狀、大小、顏色、氣味等，肉眼可見。通過檢測瓊脂培養(yǎng)基中的形態(tài)或宏觀特征來確定微生物的種類。同一物種在不同的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出。2.微觀特征：微生物通常在顯微鏡下通過染色更容易顯示出來。最常用的染色方法如下：（1）革蘭氏染色法細菌鑒定的首選就是革蘭氏染色法，基于結(jié)晶性的紫色染料。芽孢桿菌、葡萄球菌、鏈球菌和梭狀芽孢桿菌都是典型的革蘭氏陽性菌,而革蘭氏陰性菌則有大腸桿菌、幽門螺桿菌和沙門氏菌。但有些細菌是革蘭氏染色不確定的，不適合。（2）芽孢染色這項技術(shù)包括將染料應用到細菌樣品中，是為了檢測孢子的存在。這些信息在鑒定中是很重要的，因為不是所有細菌都可以產(chǎn)生孢子。最受歡迎的孢子染色劑可能就是孔雀石綠。3.簡單的生化測試：主要有過氧化氫酶試驗、氧化酶試驗、底物利用率測試、?，F(xiàn)代方法雖然傳統(tǒng)的鑒定方法依舊被廣泛使用，但有兩個缺點。它們只適用于可以在體外培養(yǎng)的生物體，而且一些菌株表現(xiàn)出獨特的生化特性，不符合已知物種模式的生化特性。許多現(xiàn)代的方法并不依賴于活的培養(yǎng)物，它們經(jīng)常能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法無法檢測到的生物體之間的不可察覺的差異。方法有PCR鑒定、微陣列芯片識別、免疫學和化學分析鑒定。（每日生物評論2017.8.13）1.6腐敗微生物的控制及方法1.6.1低溫處理食品的低溫處理包括冷藏和凍藏，冷藏又分為強制空氣冷卻法、真空冷卻法、水冷卻法、冰冷卻法。食品的低溫處理是指通過降低食品溫度，使食品被冷卻或被凍結(jié)來改變食品的特性。進而達到加工貯藏目的的過程。低溫會導致微生物體內(nèi)代謝酶的活性下降，通過低溫技術(shù)使食品溫度降低并讓食品保持在低溫狀態(tài)來抑制食品腐敗變質(zhì)，從而延長食品保質(zhì)期。低溫保藏不僅可以用于新鮮食品物料的貯藏，也可以用于食品加工品、。不同種類的微生物都有自己的溫度適用環(huán)境，當溫度降低時，微生物的生長速度就變慢，當溫度降低一定程度時，大多微生物就會停止繁殖，甚至出現(xiàn)死亡，只有少數(shù)的微生物可以繼續(xù)緩慢生長。1.6.2輻照保藏輻照保藏就是利用電離輻射（主要是指鈷-60，γ-射線和電子加速器產(chǎn)生的電子束）對物質(zhì)或材料進行處理，使射線與物質(zhì)發(fā)生物理反應、化學效應和生物學效應，抑制食品中的腐敗因子，達到長期保藏化學的目的。采用輻射技術(shù)加工食品早在20世紀40年代就已開始，50年代美國等國家加強了研究，70年代證明了輻射食品的安全性，80年代各國開始建立規(guī)程、法規(guī)、標準。1980年FAO/IAEA/WHO輻照食品安全聯(lián)合專家委員會結(jié)論：輻照食品總平均劑量10kGy以下不需要做毒理學實驗，無特殊營養(yǎng)和微生物問題。迄今為止，已有40多個國家批準了100多種類的輻照食品，但輻照技術(shù)真正大規(guī)模商業(yè)化應用，是從20世紀90。輻照類型包括輻射阿氏滅菌、輻射巴氏滅菌、輻射耐貯滅菌。輻射在滅菌的同時也會有一些傷害，可以通過降低輻射時的溫度環(huán)境、照射時排除輻射源產(chǎn)生的、采用真空包裝和充氣包裝、采用抗氧化劑來減少輻射帶來的傷害。1.6.3抑菌劑控制抑菌劑有人工合成抑菌劑和天然抑菌劑兩種：1.人工合成常用抑菌劑包括：山梨酸鉀，乙醇，碳酸氫鈉等。主要是通過對食物使用一些人工合成的物質(zhì)來達到保鮮的目的。雖然人工合成的抑菌劑抑菌效果顯著，但是安全問題沒有得到保證。2.天然抑菌劑：近年來由于環(huán)保和回歸大自然的意識顯著提高，利用天然的物質(zhì)來達到同樣的功能性引起了人們廣大的興趣。天然抑菌劑主要是利用天然物質(zhì)的提取物來達到抑菌的效果，例如植物提取物、微生物源抑菌劑、酶、天然方丈純粹、檸檬醛等。植物提取物包括植物多糖、精油、多酚物質(zhì)，微生物源抑菌劑包括乳酸鏈球菌素（乳酸鏈球菌產(chǎn)生的多肽物質(zhì)）、納他霉素（發(fā)酵產(chǎn)生的多烯物質(zhì)）、ε-聚賴氨酸，。第2章材料與方法2.1試驗材料試劑：試劑名稱純級/規(guī)格生產(chǎn)單位葡萄糖瓊脂粉氯化鈉二氧化氯無水乙醇結(jié)晶紫碘化鉀碘番紅蛋白胨牛肉浸膏酵母膏分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純常得比克曼生物科技有限公司北京鴻潤寶順科技有限公司天津市致遠化學試劑有限公司北京華龍星宇科技發(fā)展有限公司天津市永大化學試劑有限公司常得比克曼生物科技有限公司天津市津北精細化工有限公司天津市津北精細化工有限公司北京澤平科技有限公司北京奧博生物技術(shù)有限責任公司天津書英博生化試劑有限公司北京奧博生物技術(shù)有限責任公司圖表1儀器：設(shè)備名稱產(chǎn)地電子天平手提式壓力蒸汽滅菌鍋恒溫培養(yǎng)振蕩器超凈工作臺生物顯微鏡恒溫水浴鍋霉菌培養(yǎng)箱瓊脂糖凝膠電泳PCR儀離心機賽多利斯科學儀器（北京）有限公司紹興萬力儀器有限公司上海智城分析儀器制造有限公司南京貝登醫(yī)療股份有限公司上海正晞儀器設(shè)備有限公司江蘇新春蘭科學儀器有限公司上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠上海金鵬分析儀器有限公司\o"北京創(chuàng)譽科技有限公司"北京創(chuàng)譽科技有限公司湘儀離心機儀器有限公司圖表22.2試驗方法2.2.1分離純化挑選無機械傷、無病蟲害、成熟度一致的芒果，進行消毒之后擦干，將芒果放置在4℃恒溫環(huán)境中，待果實出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象時，切除腐敗部位與正常部位交接處進行消毒處理，放入裝有無菌水的三角瓶中，制成芒果懸浮液。將稀釋度不同的芒果懸浮液吸取于NA培養(yǎng)基上，均勻涂布，將NA培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2小時。結(jié)束后根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小的區(qū)別，對平板上的菌落進行劃線分離，。（李慧等，2019）2.2.2回接實驗首先對芒果進行清洗干凈，然后進行消毒，用無菌水沖洗之后晾干，在無菌操作中將芒果的中間部分用打孔器打出對稱的幾個小孔，在小孔處分別接入20μL篩選出的致腐菌的懸浮液，以無菌生理鹽水作為對照。在芒果接種后用保鮮膜包裹住。之后講被保鮮膜包裹住的芒果放置在28℃恒溫環(huán)境中，進行具體觀察，觀察在該過程中發(fā)生的組織變化和腐爛情況，根據(jù)最終的情況確定該菌是否為主要的致腐菌。再次進行分離純化在回接后腐爛的組織上，判斷是否與。6.2.3細菌鑒定將芒果分離純化后的菌株放置在NA培養(yǎng)基上，并劃線培養(yǎng)1~2小時，之后進行形態(tài)學鑒定，觀察形態(tài)、大小、顏色，透明度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面光滑度、菌落隆起形狀、表面狀態(tài)等，然后與標準菌株進行對比，并對其進行生理生化試驗，試驗主要包括過氧化氫酶活性試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖水解試驗、阿拉伯糖水解試驗、木糖水解試驗、甘露醇水解試驗、V-P試驗、。挑取細菌平板上的單菌落，接種于NB培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng)，溫度為37℃，時間為12小時，取2mL菌液10000g離心1min，之后撇去上清液，按照天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取。提取細菌的基因組DNA步驟如下：（1）100ml細困培養(yǎng)液5000rpm離心10分鐘，去上清液。加9.5mlTE懸浮沉淀，并加05mL10%SDS，50μL20mg/ml（或1mg干粉)蛋白酶K，混勻，37℃保溫一個小時。（3）加1.5ml5mol/LNaCl，混勻。（4）加1.5mlCTAB/NaCl溶液混勻65℃。（5）用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提，5000rpm離心10分鐘，將上清液移至干凈離心管。（6）用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干凈管中。（7)加1倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。（8)用玻棒撈出DNA沉淀70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于1mlTE,-20℃保存。如DNA沉淀無法撈出，可5000rpm離心，使DNA沉淀。最終可以獲得。采用擴增細菌的16SrDNA通用引物，前引物63F（5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ˊ），后引物為1387R（5ˊ-CCCGGGATCCAAGCTTAAG-3ˊ）擴增目標細菌的16SrDNA，引物由北京六合華大科技有限公司合成。PCR擴增反應體系（50μL）為：模板DNA3μL，5×Buffer（含Mg2+）10μL，dNTP（各2.5mmol/L）4μL，10μmol/L27F和1492R引物各1μL，酶1μL，ddH2O30μL。PCR反應條件為：95℃下預變性5分鐘；95℃變性10秒，50℃退火15s，然后72℃延伸1分鐘，需要循環(huán)33次，最終72℃下修復延伸5分鐘，最后等到溫度降到11℃時終止反應。取5μL的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其他的PCR產(chǎn)物在4℃下冷藏，用凝膠成像系統(tǒng)，觀察它的電泳條帶，確認是否有目的性條帶顯現(xiàn)。之后將PCR產(chǎn)物在哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司測序，然后分析序列，。2.2.4抑菌試驗1.抑菌劑溶液的配制從芒果中分離出有益菌，和利用乳酸菌進行試驗。也可以用溶菌酶、乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε-聚賴氨酸等抑菌劑，之后采用濾紙片法進行細菌抑制試驗。2.菌懸液制備在NB培養(yǎng)基上用接種環(huán)挑取菌落，30℃130r/min搖床培養(yǎng)十二個小時，在9ml裝有生理鹽水的試管中加入1ml菌液，震蕩均勻取出1ml加在另一個裝有生理鹽水9ml的試管中，依次做10倍稀釋備用。3.濾紙片法采用濾紙片法對細菌進行抑菌試驗（張笮晦等，2019）。在NA培養(yǎng)基上用移液槍取100μL菌懸液，之后將濾紙片均勻分布的放在培養(yǎng)基表面，再取不同質(zhì)量分數(shù)的10μL抑菌劑，做對照。將培養(yǎng)基在30℃放置一至兩個小時觀察，最后測定抑菌圈直徑。第3章結(jié)果與分析3.1腐敗微生物的分離純化M1M2M3從腐敗的芒果中首先分離出兩株細菌，分別給他們命名為G1、G2。然后再將分離出的這兩種菌株接種到新鮮、無腐敗現(xiàn)象的且經(jīng)過消毒殺菌的芒果表皮上。之后表皮呈現(xiàn)褐色的班點，斑點先是為淺褐色，后變?yōu)樯詈稚?，并向周圍擴散，芒果表皮變軟。將回接后腐敗的芒果部位再次進行微生物分離，菌株在分離純化后都與所接種的菌株相同。由此可見，細菌G1和G2是可以。3.2芒果腐敗微生物細菌的鑒定3.2.1細菌G1鑒定結(jié)果觀察細菌G1可知菌落顏色為乳白色，表面光滑有光澤，濕潤度良好，整體呈圓形，凸起，。在光學顯微鏡下觀察到，菌落為長桿狀，單個呈現(xiàn)短鏈狀或者成對出現(xiàn)，可以生成芽孢。利用生理生化實驗可以得知細菌G1可以水解淀粉，V-P試驗與過氧化氫酶試驗都呈陽性，對氯化鈉的耐受性時7％。綜述可得可以初步判定G1菌落為言胞桿菌屬。a1（細菌菌落）a2（光學顯微鏡下）構(gòu)建的細菌G1的16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹：細菌G1鑒定結(jié)果通過16SrDNA通用引物擴增細菌G1菌落的16SrDNA序列，測序PCR產(chǎn)物。之后將測的序列在NCBI基因庫中與已經(jīng)登錄的其他菌落序列進行BLAST同源性分析。再通過MAGE7.0對菌落G1的測序結(jié)果和同源性高的基因序列對比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終發(fā)現(xiàn)G1菌落與巨大芽孢桿菌遺傳的距離最近，同源性也達到了百分之百，其形態(tài)與生理生化反應的結(jié)果也很相似，因此可以認定菌落G1是巨大芽孢桿菌。3.2.1細菌G2鑒定結(jié)果由圖可見，G2細菌的菌落呈乳白色,不透明，邊緣不圓整，表面不光滑、不隆起?？梢援a(chǎn)生生物表面活性劑，能使發(fā)酵液的表面張力值降低到34.2mN·m-1，最適生長溫度為30℃。生理生化試驗鑒定結(jié)果為：能水解淀粉，V-P試驗與過氧化氫酶試驗都呈陽性。對氯化鈉耐受為7%，種種結(jié)果都與芽孢桿菌一致，可初步判定菌落G2為芽孢桿菌屬。a1（細菌菌落）a2（光學顯微鏡下）細菌G2鑒定結(jié)果通過16SrDNA通用引物擴增G1菌落，測序PCR產(chǎn)物。之后將測的序列在NCBI基因庫中與已經(jīng)登錄的其他菌落序列進行BLAST同源性分析。根據(jù)同源性分析的結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終發(fā)現(xiàn)G2菌落與假蕈狀芽孢桿菌遺傳的距離最近，同源性也達到了百分之百，其形態(tài)與生理生化反應的結(jié)果也很相似，因此可以認定菌落G1是假蕈狀。3.3芒果腐敗微生物細菌的控制3.3.1細菌抑菌劑的篩選為了抑菌劑的特性和安全性以及抑菌效果，所以選擇出了三種抑菌劑對G1、G2菌落進行抑菌試驗，有溶菌酶、Nisin、ε-聚賴氨酸這三種，如表3所示。溶菌酶（0.005%）、Nisin（0.005%）、ε-聚賴氨酸（0.005%）都能對菌落 G1起到抑制作用，其中溶菌酶的抑菌圈最大，直徑為9.10mm，證明菌落G1抑制效果最好的是溶菌酶。所以，本試驗確定溶菌酶為G1菌落的抑菌劑。ε-聚賴氨酸（0.005%）對G2菌落的抑制效果最好，接著是Nisin（0.005%），對G2菌落沒有抑制作用的是溶菌酶。因此，本試驗確定使用ε-聚賴氨酸來作為G2菌落的抑菌劑。表3三種抑菌劑對細菌的抑制效果抑菌劑（%）抑菌圈直徑（mm）G1G2溶菌酶0.0059.10±0.34a6.00±0.00aNisin0.0058.64±0.33b6.25±0.02bε-聚賴氨酸0.0057.17±0.13c8.05±0.13c結(jié)論如今國內(nèi)外芒果產(chǎn)業(yè)的科研工作取得較大進展，目前我國研究使用殼聚糖/納米TiO_2復合涂膜對芒果致腐霉菌抑制效果，并對其防治采后芒果腐敗的效果及其抗性誘導作用進行了研究。并對其防治采后芒果腐敗的效果及其抗性誘導作用進行研究。等人對殼聚糖對芒果腐敗病菌的抑菌性能進行了研究,劉嘉俊研究了海藻酸鈉涂膜對芒果保鮮效果。都對芒果產(chǎn)業(yè)科研工作提供了幫助。本研究對芒果腐敗微生物進行了分離純化，獲得了兩種菌株，之后對分離出來的菌株進行形態(tài)學鑒定、生理生化實驗、16SrDNA分子序列測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最后鑒定出G1菌株為巨大芽孢桿菌，G2菌株為假蕈狀芽孢桿菌。本文分離鑒定出了會使芒果腐敗的細菌微生物，同時對其他果蔬等也會造成腐敗的現(xiàn)象，如今果蔬易腐敗現(xiàn)象已普遍存在，對于能引起果蔬腐敗的微生物也是有很大不同，如此，使用不同的抑菌劑來針對不同的腐敗微生物，并采取多種或一種來抑制，可以達到更好的防腐敗作用。參考文獻[1]李想.靜電噴檸檬香茅/蜂蠟復合微球制備及其芒果保鮮效果研究[D].浙江工商大學,2019.[2]黃榮,王曉麗,王兆升,李游,方雙杰.皺皮木瓜腐敗微生物的分離鑒定[J].食品科學,2021,42(04):161-166.[3]韓千慧,岳琪琪,吳忌,艾有偉,王宏勛,侯溫甫.曲酸對冷鮮鴨肉腐敗微生物致腐能力的影響研究[J].食品科技,2020,45(04):344-350.[4]李小義,才讓卓瑪,楊星,吳丹,楊明舉.冷藏鱘魚片優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2019,39(01):5-7+33.[5]鄭樂友.異植物醇中未知雜質(zhì)的分離鑒定及含量控制研究[D].中國石油大學(華東),2016..[6]賴宏剛,蔣云升,張元嵩,曹宏,肖歡.真空包裝冷鮮雞中腐敗菌微生物的分離鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2018,46(17):198-201.[7]黃榮.皺皮木瓜腐敗微生物的分離鑒定及控制[D].山東農(nóng)業(yè)大學,2020.[8]譚純良.雞蛋干中腐敗微生物的分離鑒定及控制[D].湖南農(nóng)業(yè)大學,2019.[9]BasseyAnthonyPius,YeKeping,LiChunbao,ZhouGuanghong.Transcriptomic-proteomicintegration:Apowerfulsynergytoelucidatethemechanismsofmeatspoilageinthecoldchain[J].TrendsinFoodScience&Technology,2021,113.[10]白冬紅.柿餅霉菌污染菌的分離鑒定及控制[D].山東農(nóng)業(yè)大學,2017.[11]趙一潔,唐毅,王威浩,姚世響,鄧麗莉,曾凱芳.蜜橘酸腐病病原菌的分離鑒定以及不同抑菌劑處理對其控制效果[J].食品科學,2017,38(07):230-237.[12]王林林,何光華,儲小軍,李海龍,郝東海,林學海,劉福生.乳制品生產(chǎn)過程中耐熱菌分離鑒定與抑菌效果評價[J].中國乳品工業(yè),2016,44(08):12-16.[13]王周利,蔡瑞,岳田利,張江波,袁亞宏,范可奕.果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌識別與控制研究進