藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的質(zhì)量保證

藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的質(zhì)量保證藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的質(zhì)量控制與保證是個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證的核心內(nèi)容，是個體化用藥基因診斷規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的首要前提。因此臨床檢驗項目的計劃和準(zhǔn)備，試驗性能確認(rèn)/驗證以及檢驗全過程都需要建立有效的質(zhì)量控制體系。1檢測確認(rèn)和特征描述在將檢測用于臨床工作之前應(yīng)該對方法進(jìn)行分析確認(rèn)和臨床確認(rèn)。實驗室應(yīng)確定待檢測的靶核酸、確定要使用的試驗方法和建立試驗性能確認(rèn)/驗證的計劃和程序。確認(rèn)/驗明程序應(yīng)該包括：檢驗?zāi)康?；靶基因，基因序列和突變；預(yù)期患者人群；被比較的試驗方法，或要使用的方法；使用的樣本類型；要確定的分析性能特征；參考材料的來源；如何分析性能規(guī)范，如何規(guī)定試驗的局限性；出現(xiàn)問題時的糾正措施。2可操作性的SOP編寫有可操作性的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）是個體化醫(yī)學(xué)檢測實驗室質(zhì)量管理的靈魂。SOP源于儀器和試劑說明書、一些標(biāo)準(zhǔn)文件和實驗室實驗工作經(jīng)驗的積累，應(yīng)包括試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、標(biāo)本接收與預(yù)處理、核酸提取、測定方法、結(jié)果分析和報告、儀器操作、實驗室安全措施等臨床檢驗的各個環(huán)節(jié)。SOP的編寫應(yīng)注意通俗易懂、注重細(xì)節(jié)、清晰明了、圖文并茂。實驗室工作人員應(yīng)嚴(yán)格遵循SOP中的步驟要求進(jìn)行操作，當(dāng)發(fā)現(xiàn)SOP有“故障”時，經(jīng)過技術(shù)研發(fā)小組的工作人員討論、實驗驗證后及時修改。3質(zhì)控品與室內(nèi)質(zhì)控3.1質(zhì)控品所有藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測都需要選擇一定的質(zhì)控樣本進(jìn)行質(zhì)控分析。質(zhì)控樣本的選擇視檢測項目而定，如藥物代謝酶的SNP檢測的陰性質(zhì)控樣本可以是無相關(guān)突變的同類樣本和不含任何核酸的水樣本，陽性質(zhì)控樣本可以為以前檢測過的特定基因突變已知的樣本或體外構(gòu)建的已含特定突變質(zhì)粒的細(xì)胞株。常用的做法為：在每次檢測時同時設(shè)立試劑對照、陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控、弱陽性質(zhì)控，且這些質(zhì)控樣本與待檢樣本同時進(jìn)行檢測，每隔一定數(shù)量的臨床標(biāo)本插入一份質(zhì)控樣本。當(dāng)同時檢測多個變異位點時，可根據(jù)實驗室的條件設(shè)立針對2～3個位點的陰性或陽性對照，但不同批次間要注意更換陰性和陽性對照樣品。質(zhì)控樣本的質(zhì)量與實驗結(jié)果的可信度密切相關(guān)。理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本應(yīng)該具有以下特點：基質(zhì)一致，即與待測樣本具有相同的基質(zhì)；穩(wěn)定性好，在適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下能保持較好的穩(wěn)定性；檢測結(jié)果應(yīng)該是確定的，且越接近試驗的決定性水平越好；具有安全性，不得有生物傳染危險性；單批可大量獲得，以便于長期連續(xù)監(jiān)測。3.2室內(nèi)質(zhì)量控制的方法應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)原理或非統(tǒng)計學(xué)方法判斷測定批次的結(jié)果是失控還是在控，是室內(nèi)質(zhì)控的核心。室內(nèi)質(zhì)量控制的方法包括統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制和非統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制兩大類。一般而言，定性檢測（如基因分型）采用非統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制，而定量檢測如基因表達(dá)水平檢測、基因甲基化水平測定、以及實驗室“污染”所致的假陽性定量檢測一般采用統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控。統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控主要從不精密度和偏離度兩個方面確定檢測程序或分析方法穩(wěn)定性的性能特點，其具體做法是在常規(guī)檢測臨床標(biāo)本時，除陰性質(zhì)控外，還要對連續(xù)的一個濃度梯度的陽性質(zhì)控樣本進(jìn)行檢測，分析判斷質(zhì)控樣本的測定結(jié)果是否偏出所用方法的測定范圍，進(jìn)而決定常規(guī)臨床測定標(biāo)本結(jié)果的有效性。統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制的前提是制定在最佳條件和常規(guī)條件下實驗室變異的基線。在進(jìn)行不精密度測定時，一般至少對20個不同的樣本連續(xù)檢測不少于20天，每天2次。偏離度的測定可采用基準(zhǔn)線法、與參考物質(zhì)的檢測結(jié)果比較、與其他平行單位的檢測結(jié)果比較、與其他檢測方法的檢測結(jié)果比較等多種方法。部分定性檢測方法因可計算出樣本中突變等位基因的比例，也可應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控方法進(jìn)行質(zhì)控分析。統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制方法主要包括兩大類：陽性樣本測定重復(fù)性統(tǒng)計質(zhì)控方法和假陽性的統(tǒng)計質(zhì)控方法。陽性質(zhì)控品測定重復(fù)性統(tǒng)計能較準(zhǔn)確的反映實驗室儀器、試劑、實驗員操作的穩(wěn)定性，也是實驗室實時監(jiān)控檢測結(jié)果是否可信的重要手段，其主要統(tǒng)計控制方法包括基線測定、Levey-Jennings質(zhì)控圖方法、Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法、累積和（CUSUM）質(zhì)控方法及“即刻法”質(zhì)控方法。假陽性的統(tǒng)計質(zhì)控方法包括根據(jù)日?；颊呓Y(jié)果陽性率的Levey-Jennings質(zhì)控圖和直接概率計算法兩種，其中Levey-Jennings質(zhì)控圖法是目前臨床檢驗中應(yīng)用較為廣泛的一種方法，適合于質(zhì)控樣本多次重復(fù)、檢測結(jié)果可用數(shù)值表示且呈正態(tài)分布的情況。Levey-Jennings質(zhì)控圖法的具體做法是：樣本處理（核酸提?。r加入流程陰參，所有步驟與待測樣本一致；加模板時，各檢測位點均應(yīng)設(shè)置陰性對照（即以流程陰參為模板，用于檢測是否發(fā)生“污染”）與一定比例的突變型/野生型陽性標(biāo)準(zhǔn)品[23]。PCR擴增時注意前后批次陰參和陽參的孔槽擺放位置的隨機性。所有陰參、陽參的檢測結(jié)果應(yīng)符合預(yù)期值，記錄各個陽性質(zhì)控品PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果。用Levey-Jennings質(zhì)控圖進(jìn)行統(tǒng)計分析，根據(jù)質(zhì)控規(guī)則判斷檢測結(jié)果是否在控。質(zhì)控規(guī)則如下：12S：1個質(zhì)控測定值超出X±2S控制線，預(yù)警。13S：1個質(zhì)控測定值超出X±3S控制線，失控。22S：同一批次2個連續(xù)的質(zhì)控測定值或不同批次的2個質(zhì)控測定值同時超出X+2S或X-2S控制線，失控。R4S：同一批測定中，2個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的差值超出4S控制線，失控。41S:4個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出X+1S或X-1S控制線，失控。7T：7個連續(xù)的質(zhì)控測定值呈現(xiàn)出向上或向下的趨勢，失控。10X：10個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（X）的同一側(cè)，失控。只有當(dāng)使用所有質(zhì)控規(guī)則判斷確定測定值在控時的檢測結(jié)果方為可信結(jié)果，而只要上述質(zhì)控規(guī)則之一判斷測定值失控即認(rèn)為該測定值失控。陰參檢測結(jié)果為陽性，也判定為失控。一旦失控出現(xiàn)，當(dāng)日所有檢測結(jié)果無效，必須暫停實驗并及時查明原因，采取改進(jìn)措施，直至測定結(jié)果在控后方可重新開始臨床檢測。每次出現(xiàn)失控情況需填寫失控記錄，詳細(xì)記錄失控原因、采取措施及其效果，失控報告應(yīng)及時通報公布，以免反復(fù)出現(xiàn)同一原因?qū)е碌氖Э亍?室內(nèi)質(zhì)量控制的評價實驗室應(yīng)有專人對實驗過程各個階段及實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢。在日常臨床診斷服務(wù)過程中，如果發(fā)現(xiàn)陽性質(zhì)控標(biāo)本結(jié)果偏高、偏低或陰性，或陰性質(zhì)控品檢測為陽性，則應(yīng)立刻查找失控原因，并采取預(yù)防措施。陽性質(zhì)控品失控常見的原因包括模板問題、引物或探針問題、儀器問題或試劑問題。應(yīng)對策略包括：純化核酸、高濃度小量分裝、避免核酸反復(fù)凍融；換用新的檢測試劑；標(biāo)本重復(fù)雙份測定；對可能含PCR擴增抑制物的標(biāo)本進(jìn)行稀釋等。陰性質(zhì)控品呈陽性提示核酸“污染”，污染來源可能是擴增產(chǎn)物和（或）核酸提取過程中的交叉污染。如果臨檢標(biāo)本全都陽性，提示擴增產(chǎn)物或試劑污染，應(yīng)更換試劑或進(jìn)行實驗室清潔、通風(fēng)；如果臨檢標(biāo)本部分陽性、部分陰性，考慮為擴增產(chǎn)物輕度污染或標(biāo)本間交叉污染，可通過對5～8份水樣品進(jìn)行檢測，查明污染來源，陽性提示實驗室污染，則應(yīng)進(jìn)行實驗室清潔、通風(fēng)，陰性要提醒臨檢人員注意操作過程。5室間質(zhì)量評價臨床檢測實驗室應(yīng)參加室間質(zhì)量評價（EQA），對待EQA樣本不能特殊化，詳細(xì)、如實地記錄參與EQA的全過程，根據(jù)反饋結(jié)果了解本實驗室的能力、自查存在的問題，及時尋求改進(jìn)方法，解決問題，完善實驗室質(zhì)量控制體系，以促進(jìn)實驗室更好的發(fā)展。EQA評分包括絕對評分和相對評分。絕對評分就是看實驗室對該次所有質(zhì)評樣本檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符的標(biāo)本總數(shù)占該次全部樣本的百分比，大部分項目大于80%即可視為檢測結(jié)果滿意或合格。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的EQA還需對檢測報告的填寫規(guī)范程度、文字錯誤、報告清晰度、結(jié)