醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

2024/11/141醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一章蛋白質(zhì)的分離純化2024/11/142215生命大分子物質(zhì)的特點(diǎn)：生命大分子是動物、植物和微生物在進(jìn)行新陳代謝時所產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能4生命大分子都是由簡單的小分子構(gòu)成的物3生命大分子的特殊性和復(fù)雜性6生命大分子不穩(wěn)定材料的選擇與處理2024/11/143材料的選擇有效成分：欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。相對于有效成分以外的物質(zhì)稱雜質(zhì)。材料來源動物植物根、莖、葉微生物組織、器官血液、分泌物選材原則：①含有效成分豐富、穩(wěn)定性好；②來源豐富、保持新鮮；③材料適合加工提取；④具有經(jīng)濟(jì)利用價值。組織差異性時間差異性生理狀態(tài)差異性研究對象的選擇蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離(separation，isolation)和純化(purification)工作是生物化學(xué)中一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)。蛋白質(zhì)純化的總目標(biāo)是增加制品的純度(purity)或比活(specificactivity)，以增加單位蛋白質(zhì)重量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性(比活常以活力單位數(shù)／毫克蛋白質(zhì)表示)。分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級分離和細(xì)分級分離3步12(1)前處理(pretreatment)分離純化某一蛋白質(zhì)，首先要求把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。01動物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織。02種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免受雜質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，將組織和細(xì)胞破碎。搗碎法2024/11/149機(jī)械破碎法研磨法勻漿法物理破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲破碎法化學(xué)破碎法利用化學(xué)滲透的方法，通過有機(jī)溶劑、抗生素、表面活性劑、金屬熬合劑、變性劑等，使細(xì)胞膜破碎的方法。酶促破碎法利用酶的活性破壞細(xì)胞膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)使細(xì)胞膜破碎的方法。在不同離心力場下沉降的細(xì)胞器如果所要的蛋白質(zhì)主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性的細(xì)胞質(zhì)等，則可利用差速離心方法將它們分開如果碰上所要蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。(2)粗分級分離(roughfractionation)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液(有時還雜有核酸、多糖之類)獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白分離開來。12有些蛋白質(zhì)提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法(如聚乙二醇濃縮法)進(jìn)行濃縮。3一般這一步的分級分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)(包括脫鹽)，又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。(3)細(xì)分級分離(finefractionation)進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。用于細(xì)分級分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。(4)結(jié)晶2024/11/1414結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，蛋白質(zhì)純度愈高，溶液愈濃就愈容易結(jié)晶。盡管結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是均一的，但只有某種蛋白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢時才能形成結(jié)晶。由于結(jié)晶中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度的一個標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。結(jié)晶也是進(jìn)行X射線晶體學(xué)分析所要求的，結(jié)晶的最佳條件是使溶液略處于過飽和狀態(tài)，此時較易得到結(jié)晶。接入晶種常能加速結(jié)晶過程。第二節(jié)確立測定方法01尋找哪些生物材料中含有有效成分02監(jiān)測有效成分提純程度03光譜法04吸收光譜05熒光光譜06濁度分析07電化學(xué)法08生物活性檢測法09免疫分析法10吸收光譜2024/11/14161根據(jù)有效成分的顏色、對紫外吸收能力進(jìn)行測定；2利用有效成分與生色基團(tuán)所進(jìn)行的特殊的呈色反應(yīng)進(jìn)行測定。3熒光法：利用有效成分所進(jìn)行的特殊的化學(xué)反應(yīng)并偶聯(lián)NAD＋或NADP＋的還原反應(yīng)產(chǎn)生NADH或NADPH。還原型尼克酰胺發(fā)熒光。也可利用NAD和NADP的光譜變化進(jìn)行測定比色法1葡萄糖＋O2＋H2O葡萄糖酸＋H2O22葡萄糖氧化酶3H2O2＋酚＋4－AAP醌亞胺＋H2O4濁度法：測定懸浮液在不被吸收的波長下表觀的消光值。5電化學(xué)法：測定反應(yīng)過程中H＋的濃度變化從而計(jì)算出有效成分含量。6生物活性檢測7免疫分析法8純化方案的設(shè)計(jì)與評價2024/11/1419純化方案：在純化某一物質(zhì)過程中，根據(jù)被分離物質(zhì)的理化性質(zhì)、分離方法的優(yōu)劣，將幾種分離方法有機(jī)地結(jié)合并靈活應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)提取被分離物質(zhì)的技術(shù)路線，稱純化方案。純化方案的設(shè)計(jì)與評價2024/11/1420初分離精細(xì)分離鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法電泳法層析法離心法離子交換層析排阻層析親和層析純化方案的設(shè)計(jì)與評價2024/11/1421純化方案的評價：是對組成純化方案的每一種分離方法的評價。有效成分的含量測定比活力測定()活力單位數(shù)毫克蛋白純化倍數(shù)()每步的比活力粗提液比活力收得率(×100％)每步的總活力粗提液總活力評價指標(biāo)蛋白質(zhì)純度和性質(zhì)的分析2024/11/142201純度分析02性質(zhì)分析03比活性04電泳分析05高壓液相或氣相色譜06免疫分析07分子質(zhì)量測定08分子結(jié)構(gòu)測定幾種常用的蛋白質(zhì)純化方法：2024/11/1423根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)的方法：01分子大??；02溶解度；03電荷；04吸附性質(zhì)；05對配體分子的生物學(xué)親和力等。06根據(jù)分子大小不同的純化方法2024/11/1424透析和超過濾透析(dialysis)是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖等分開。常用的半透膜是玻璃紙和其他改型的纖維素材料。超濾是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的。2．密度梯度(區(qū)帶)離心2024/11/1426蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶，密度梯度2024/11/1427常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。蔗糖便宜，純度高，濃溶液(60％，W／W)密度可達(dá)1.28g／cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1—氯—2，3—環(huán)氧丙烷合成的高聚物，Mr約400000。密度梯度在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大，向上逐漸減小凝膠過濾層析(分子排阻)2024/11/1428凝膠過濾的介質(zhì)凝膠過濾所用的介質(zhì)是凝膠顆粒，其內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，二、利用溶解度差別的純化方法2024/11/1429影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素很多，其中主要有：①溶液的pH，②離子強(qiáng)度，③介電常數(shù)，④溫度。自身因素：在同一的外部條件下，不同蛋白質(zhì)具有不同的溶解度，這是因?yàn)槿芙舛葰w根結(jié)底取決于它們本身的分子結(jié)構(gòu)，例如分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量、親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)的比例，它們在蛋白質(zhì)分子表面的排列以及由此而產(chǎn)生的偶極矩等。1.pH控制蛋白質(zhì)的沉淀2024/11/1430蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時，其靜電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析2024/11/1431鹽溶：低濃度時，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度增高鹽溶2024/11/1432鹽析：當(dāng)溶液的離子強(qiáng)度增加到一定數(shù)值時，蛋白質(zhì)溶解度開始下降。當(dāng)離子強(qiáng)度增加到足夠高時，例如飽和或半飽和的程度，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為鹽析（saltingout）。大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)的暴露鹽析（（NH4）2SO4）3．有機(jī)溶劑分級分離法2024/11/1433與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。在室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。3．有機(jī)溶劑分級分離的機(jī)理2024/11/1434有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質(zhì)直接爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集而沉淀。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。水是高介電常數(shù)物質(zhì)(20℃時，80)，有機(jī)溶劑是低介電常數(shù)物質(zhì)(20℃時，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有機(jī)溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低。這樣，蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。4．溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響2024/11/1435No.3在一定溫度范圍內(nèi)，約0～40℃之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，在40～50℃以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解能力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進(jìn)行。No.2No.1蛋白質(zhì)的電泳分離2024/11/1436電泳

是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象

正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子2024/11/1437++++++++--------++++++++--------蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀

帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)酸酸堿堿脫水脫水脫水不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒（沉淀）帶正電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）堿酸（親水膠體）（親水膠體）（親水膠體）電泳原理：2024/11/1438F’=6πrηvF=EQ帶電顆粒在電場中所受到的電場力根據(jù)Stoke定律，球形分子在液體中泳動所受到的阻力12F=F’即：EQ=6πrηv時，V=EQ6πrη

當(dāng)物質(zhì)在電場中移動時，受到電場力和液體阻力兩方面的力的影響，當(dāng)電場力和阻力平衡時，帶電顆粒作勻速運(yùn)動，U==2024/11/1440

兩個帶電顆粒能否分開，由兩個顆粒在電泳過程中的遷移率所決定，即U=dlVt或d=UVtldVEtVl=dlVt

或d1-d2=(U1-U2)VtlΔd=遷移率（或泳動度）是指帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下泳動的速度，可用下列公式計(jì)算：1Ｕ=υ/E=(d/t)/(V/l)=dl/Vt2Ｕ為遷移率（cm2·V-1·min-1）；υ為顆粒泳動速度（cm·s-1）；E為電場強(qiáng)度（V·cm-1）；d為顆粒泳動的距離（cm）；l為濾紙有效長度（cm）；V為實(shí)際電壓（V）；t為通電時間（s或min）。通過測量d,l,V,t,即可計(jì)算出被分離物質(zhì)的遷移率。3影響電泳的因素2024/11/1442帶電粒子的性質(zhì)與電泳行為電場強(qiáng)度對帶電粒子遷移的影響：電場強(qiáng)度也稱電位梯度，是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對泳動速度起著十分重要的作用。一般，電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動速度越快。溶液的pH對帶電粒子遷移的影響：溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。電滲對電泳的影響：電滲是在電場中液體對固體的相對移動。電滲作用離子強(qiáng)度對電泳的影響：電泳液中的離子增加會使電泳遷移率降低，原因是帶電的離子會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，形成一個與運(yùn)動粒子符號相反的離子氛，它使該離子向相反的方向運(yùn)動，從而降低了該粒子的遷移率。溫度對的電泳的影響：電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。溫度每升高1℃，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應(yīng)對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置。電泳的分類和特點(diǎn)2024/11/1447電泳的分類自由移動界面電泳區(qū)帶電泳穩(wěn)態(tài)電泳DCAB自由移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis），沒有支持物，在一個U形管中進(jìn)行電泳，目前已被區(qū)帶電泳所取代。區(qū)帶電泳（zoneelectrophoresis）在一定的支持物上進(jìn)行的電泳，電泳結(jié)果形成一條條的區(qū)帶而得名。穩(wěn)態(tài)電泳（steadystateelectrophoresis）帶電顆粒電泳一定時間后達(dá)到穩(wěn)態(tài)而停止移動。2024/11/1449根據(jù)電荷不同的純化方法2024/11/1450根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。電泳(electrophoresis)在外電場的作用下，帶電顆粒，向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)電泳分離原理：分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶電種類不同，凈電荷密度不同，遷移率不同，因此，在電泳時可以分開。電泳的類型2024/11/1451目前電泳的類型很多，最常見的是區(qū)帶電泳，由于在支持物上電泳時蛋白質(zhì)混合物被分離成若干區(qū)帶而得名。1區(qū)帶電泳按其支持物的物理性狀不同可以分成4類：3粉末電泳，支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉等，粉末與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和，鋪設(shè)成平板；2濾紙電泳和薄膜電泳(如醋酸纖維薄膜電泳和聚酰胺薄膜電泳)；2024/11/1453③細(xì)絲電泳，如尼龍絲和其他人造絲電泳，這是一類微量電泳；④凝膠電泳，最常用的支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，前者適于分離蛋白質(zhì)和多核苷酸，后者適于分離核酸，這兩種凝膠電泳的分辨率都很高，

-++—雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis)也稱圓盤電泳，它是在區(qū)帶電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它以聚丙烯酰胺凝膠為支持物,一般制作成凝膠柱或凝膠板，聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamindegelelectrophoresis，簡稱PAGE)按其凝膠的組成系統(tǒng)可分成四種：2024/11/1457連續(xù)凝膠電泳：只用一層凝膠，采用相同的pH值和相同的緩沖液。不連續(xù)凝膠電泳：采用二層或三層性質(zhì)不同的凝膠(即：樣品膠、濃縮膠和分離膠)重疊起來，使用兩種不同的pH值（6.7和8.3）和不同的緩沖液（Tris-HCl和Tris-Gly）梯度凝膠電泳：采用梯度混合裝置，使制得的凝膠由上至下孔徑逐漸減小(即凝膠濃度由上至下逐漸增高)。梯度凝膠電泳主要適宜于測定球蛋白的相對分子質(zhì)量。SDS—凝膠電泳：在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS(十二烷基硫酸鈉)4．等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)等電聚焦是60年代建立的一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離和分析技術(shù)。它是利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性電解質(zhì)分子具有不同的等電點(diǎn)，從而在一個穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度中得到分離。01近年來，等電聚焦電泳技術(shù)的分辨率有了很大提高，可以分辨pI只差0.001的生物大分子，這是等電聚焦最突出的優(yōu)點(diǎn)，02聚合反應(yīng)凝膠聚合的原理及有關(guān)特性2024/11/1459凝膠的聚合單體:丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)；常用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。TEMED的堿基可催化AP水溶液產(chǎn)生游離氧原子，激活A(yù)cr單體，使其聚合成單體長鏈，在Bis作用下，聚合成網(wǎng)狀凝膠。堿性條件下凝膠易聚合，室溫下7.5％的凝膠在pH8.8時30min聚合，在pH4.3時約需90min。此外，核黃素亦可為催化劑，聚合需光照，故使用不多。丙烯酰胺凝膠聚合原理2024/11/1460凝膠濃度與被分離物相對分子質(zhì)量的關(guān)系PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為PAGE原理2024/11/1463連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)；不連續(xù)系統(tǒng)：由電極緩沖液、樣品膠、濃縮膠及分離膠組成，兩層玻璃板中排列順序依次為上層樣品膠、中間濃縮膠、下層分離膠。電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性。不連續(xù)PAGE系統(tǒng)：2024/11/1464

樣品膠的T=3％，c=2％，緩沖液為pH6.7的Tris-HCl，其作用是防止對流，促使樣品濃縮以免被電極緩沖溶稀釋。目前，一般不用樣品膠，直接在樣品液中加入等體積40％蔗糖，同樣具有防止對流及樣品被稀釋的作用。

T％=(a+b)/m×l00％c％=b/(a+b)×100％式中a：Acr克數(shù)；b：Bis克數(shù)；

m：緩沖液體積(ml)。

T：Acr和Bis總濃度

c：交聯(lián)劑百分比濃縮膠是樣品膠的延續(xù)，凝膠濃度及pH值與樣品膠完全相同，其作用是使樣品進(jìn)入分離膠前，被濃縮成窄的區(qū)帶，從而提高分離效果。分離膠的T=7.0％一7.5%，c=2.5％，緩沖液為pH8.9的Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷)，大部分蛋白質(zhì)在此pH條件下帶負(fù)電荷。此膠主要起分子篩作用。不連續(xù)PAGE電泳的3種物理效應(yīng)：2024/11/14661樣品的濃縮效應(yīng)；2凝膠對被分離分子的篩選效應(yīng)(顆粒小的移動快，顆粒大的移動慢)；3一般電泳分離的電荷效應(yīng)。4由于這3種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。人血清用紙電泳只能分成5～7個組分，而圓盤電泳則可分成幾十個清晰的條帶。樣品濃縮效應(yīng)(由三種不連續(xù)性造成)2024/11/1467

（1）凝膠孔徑的不連續(xù)性上述三層凝膠中，樣品膠及濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時，受到的阻力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。濃縮膠分離膠(2)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

HCl在任何pH溶液中均易解離出Cl—，在電場中遷移率快，走在最前面稱為快離子。在電極緩沖液中，除有Tris外，還有甘氨酸，其pI=6.0，在pH8.9的電極緩沖液中，易解離出甘氨酸根(NH2CH2COO—)，而在pH6.7的凝膠緩沖體系中，甘氨酸解離度僅有0.1％～1％，因而在電場中遷移很慢，稱為慢離子。Tris-HClpH=6.7pH=8.9GlyCl-Gly-Tris-HCl血清中大多數(shù)蛋白質(zhì)pI在5.0左右,遷移率介于快離子與慢離子之間，—+凝膠緩沖體系，Tris-Gly,pH=8.3(3)電位梯度的不連續(xù)性2024/11/1469電泳開始后，快離子的快速移動會在其后形成一個離子強(qiáng)度很低的低電導(dǎo)區(qū)，使局部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的區(qū)帶。分子篩效應(yīng)2024/11/1470大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。01蛋白質(zhì)進(jìn)入pH8.9的同一孔徑的分離膠后，分子小且為球狀的蛋白質(zhì)分子所受阻力小，移動快，走在前面；反之，則阻力大，移動慢，走在后面，從而通過凝膠的分子篩作用將各種蛋白質(zhì)分成各自的區(qū)帶。01這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析中的分子篩效應(yīng)，后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子后流出。01電荷效應(yīng)2024/11/1471在pH8.9的分離膠中，各種帶凈電荷不同的蛋白質(zhì)有不同的遷移率。凈電荷多，則遷移快；反之，則遷移慢。因此，各種蛋白質(zhì)按電荷多少、相對分子質(zhì)量及形狀，以一定順序排成一個個區(qū)帶，因而稱為區(qū)帶電泳。2024/11/1472蛋白質(zhì)的層析分離2024/11/1473層析的分類01分配層析02吸附層析03離子交換層析04分子篩（凝膠過濾）層析05親和層析06層析技術(shù)的基本原理2024/11/1474任何一種層析技術(shù)都由互不相溶的兩相組成，分別稱為固定相和流動相。被分離的物質(zhì)由于其本身的物理性質(zhì)或化學(xué)性質(zhì)的不同，在兩相中的分配系數(shù)（溶解度）不同，經(jīng)過一定的時間后，混合在一起的物質(zhì)彼此實(shí)現(xiàn)分離。Ｋ＝＝溶質(zhì)在固定相中的濃度溶質(zhì)在流動相中的濃度CsCm2024/11/1478遷移率(Rf)：層析過程中，樣品移動的相對速率或相對距離。abRf==溶質(zhì)斑點(diǎn)中心移動的距離溶劑前沿移動的距離ab濾紙前沿原點(diǎn)影響Rf值的主要因素物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性的影響：一般來說，物質(zhì)分子中極性基團(tuán)增加，物質(zhì)的極性就隨著增加，則分配系數(shù)變大，Rf值變小。而分子中(-CH2-)增加分子極性變小，Rf值相應(yīng)變大。常用參數(shù)：2024/11/14791/2h607h如圖所示為一色譜流出曲線：2024/11/1480層析峰：樣品從洗脫開始到樣品流出層析柱時，檢測器對層析樣品和層析時間所產(chǎn)生的信號。峰高：峰的最大值到峰底的距離。峰寬：層析峰半高峰時的寬。峰面積：峰與峰底間的面積?；€：在正常的操作條件下，僅有流動相（無被分離樣品）通過檢測器時所產(chǎn)生的信號。層析峰區(qū)域?qū)挾?024/11/1482半峰寬：峰高一半處的峰寬度。峰寬：峰的基線寬度，通過層析峰兩側(cè)拐點(diǎn)作切線交于基線上的距離。標(biāo)準(zhǔn)差：樣品組分被帶出層析柱的分散度，用σ表示。兩側(cè)拐點(diǎn)之間的距離為2個標(biāo)準(zhǔn)差。Wb=4σ=1.699W1/2W1/2=2.354σ保留值：表示樣品中各組分在層析柱中停留時間的長短或組分流出時所需流動相體積的大小。01保留時間和保留體積：樣品組分通過層析柱出峰所需的時間稱保留時間；樣品組分通過層析柱出峰時所需流動相的體積稱保留體積。02死時間或死體積：柱中未被固定相所占有的空間，如柱的接口、柱出口管路、檢測器內(nèi)腔空間及柱內(nèi)填充空隙等稱為死體積；流動相流經(jīng)死體積所需的時間稱死時間。調(diào)整保留時間或調(diào)整保留體積：保留時間中扣除死時間后的時間；或保留體積中扣除死體積后的體積。?(W1+W2)2024/11/1485分離度：指相鄰兩峰的保留時間差值是兩峰寬平均值的幾倍。因Wb=4σ，即分離度為1時，ΔtR＝4σ。兩峰有98％分離。Rs＝＝tR2-tR12(tR2-tR1)W1+W2當(dāng)W1=W2，且峰面積相等時Rs＝ΔtR/WN=L/H柱效：層析過程是一個連續(xù)過程，流動相不斷流過，在任何一點(diǎn)上實(shí)際上都無法獲得平衡，當(dāng)流動相通過柱的一定高度，在離開這段柱時，流動相中某組分的平均濃度與固定相中的平均濃度可以達(dá)到分配平衡，完成這一平衡所需要的柱長稱為理論塔板等效高度，簡稱板高層析的主要設(shè)備自動分步收集器2024/11/1489離子交換層析法2024/11/1490logo離子交換層析利用物質(zhì)的電荷與層析載體(離子交換劑)電荷之間的相互作用達(dá)到分離純化目的的技術(shù)。離子交換層析分離蛋白的依據(jù)是其帶電狀態(tài)，當(dāng)溶液pH高于目的蛋白等電點(diǎn)時，蛋白帶凈負(fù)電荷，可與陰離子交換劑結(jié)合；如pH低于蛋白等電點(diǎn)時蛋白帶凈正電荷，與陽離子交換劑結(jié)合。+常用離子交換纖維素的種類和特性離子交換層析技術(shù)的基本操作2024/11/14935mol/LNaCl浸泡30min，蒸餾水洗至pH8.0最后用上樣緩沖液平衡065mol/LNaCl浸泡30min，蒸餾水洗至pH8.004樣品的準(zhǔn)備01纖維素離子交換劑的預(yù)處理035mol/LHCl浸泡30min，蒸餾水洗至中性05離子交換劑和層析柱的準(zhǔn)備022）葡聚糖離子交換劑的預(yù)處理Sephadex用前在上樣緩沖液中室溫浸泡一天DEAE－SephadexCL－6B使用前用1~2mol/LNaCl浸泡，然后用上樣緩沖液平衡DEAE－Sephadex是以24%乙醇中提供的，用前要用起始緩沖液充分洗滌。層析柱的準(zhǔn)備：將層析介質(zhì)均勻的裝入適當(dāng)?shù)牟ＡЧ苤薪M成離子交換柱。離子交換層析柱一般較短粗，高徑比一般在10:1~15:1。層析柱太高將使樣品擴(kuò)散而稀釋。上樣量根據(jù)層析柱的交換容量決定，一般為交換容量的1/10。低鹽洗脫液高鹽洗脫液混合蛋白質(zhì)目的蛋白的洗脫樣品上樣后，用特定的緩沖液從被離子交換劑吸附的組分從層析柱上洗脫下來，這一過程稱為洗脫。離子交換層析的洗脫有兩種方式：改變洗脫液的離子強(qiáng)度；改變洗脫液的pH值每種方式又分為階段洗脫和梯度洗脫兩種類型。01階段洗脫：用一系列不同濃度的洗脫液逐次對層析柱進(jìn)行洗脫的方式02階段洗脫：用幾種具有不同洗脫能力的緩沖液相繼進(jìn)行活脫階段洗脫的優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備和操作簡單洗脫迅速洗脫液體積小這種洗脫方式適合于混合物組成簡單，目的物在層析行為上和其它有組分有顯著差別或需要快速分離時。階段洗脫的缺點(diǎn)：2024/11/14101親和力相近的不同組分不易分開，而生物介質(zhì)中具有相似層析特性的組分往往是很多的，很難找到使某一種組分解吸，而其它組分皆不解吸的條件。拖尾現(xiàn)象：生物大分子和離子交換纖維素表面的電荷分布都是不規(guī)則的，電荷密度大，排列恰當(dāng)?shù)牟课挥H和力大，另一些部位親和力小，所以同一個組分的不同分子所遇到的微環(huán)境有差別，吸附緊密程度不同。在一個恒定的洗脫條件下，吸附較緊密的分子落在后面形成拖尾現(xiàn)象。同一個組分的多峰現(xiàn)象：由于同一個組分的不同分子吸附緊密程度不同，每當(dāng)改換一次洗脫能力較大的洗脫液時，便出現(xiàn)一個峰，導(dǎo)致一個組分出現(xiàn)幾個假峰。梯度洗脫：用連續(xù)濃度的溶液對層析柱進(jìn)行連續(xù)洗脫的洗脫方式。梯度洗脫：在梯度活脫中緩沖液的洗脫能力是逐漸的連續(xù)的加強(qiáng)。在梯度洗脫的條件下，同種組分中那些因?yàn)槲捷^緊密而落在后面的分子，會因?yàn)橄疵撃芰Φ闹鸩郊訌?qiáng)而趕上前面的分子，克服了階段洗脫中的拖尾現(xiàn)象和假峰。同時，混合物中的各個組分將逐個地進(jìn)入解吸狀態(tài)，而被逐次洗脫為峰形對稱的各個清晰層析譜峰，分辨力大大超過階段洗脫。連續(xù)梯度的形式及連續(xù)梯度的建立緩沖液的選擇2024/11/14107對緩沖液pH的選擇：決定于被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)、穩(wěn)定性和溶解度，也要根據(jù)交換纖維素解離基團(tuán)的pK值。用陰離子交換纖維素時要選用低于其pK值的緩沖液，用陽離子交換纖維素則要選用高于其pK值的緩沖液。pH值一經(jīng)選定，便限制了緩沖液種類選擇。適用于不同pH范圍的一些常用緩沖液種類如下表：常用緩沖液種類2024/11/141083.1.2緩沖液的選擇2024/11/14109為了獲得足夠的緩沖容量，選用的緩沖離子，其pK值要盡量接近起始緩沖液的pH值(最好約在0.5個pH單位之內(nèi))。這樣可降低因緩沖液離子與離子交換纖維素的相互作用和由吸附過程本身所引起的pH紊亂。否則會出現(xiàn)pH的交錯界面而形成假峰。3.1.2緩沖液的選擇2024/11/14110適宜的緩沖液必須在所選擇的pH范圍內(nèi)有足夠的緩沖能力，而且必須不影響目的物的活性，并且不干擾洗脫液的分析。如用紫外吸收法來分析洗脫液中的蛋白質(zhì)和核酸含量時不能選用含芳香族化合物(如吡啶、巴比妥)的緩沖液。而假如用215－225nm波長光測吸收進(jìn)行分析時，則不能用含有羧基的緩沖液。選用的緩沖液也必須不影響樣品的溶解性或與一些活性保護(hù)劑(如Ca＋＋、Mg＋＋)等生成沉淀。3.1.2緩沖液的選擇2024/11/14111No.1用陽離子交換纖維素時一般應(yīng)使用陰離子型緩沖液(如磷酸、醋酸等)，而用陰離子纖維素時則應(yīng)使用陽離子型緩沖液(如Tris，吡啶等)，以避免緩沖液離子被吸附而形成人為的pH和鹽濃度交錯界面。No.2為了結(jié)合盡可能多的樣品，起始緩沖液的離子強(qiáng)度一般較低，為0.001~0.01M。當(dāng)用增加離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫時，為使層析系統(tǒng)盡可能地單一，可以用單純增加緩沖液離子濃度的辦法來達(dá)到，這樣便于控制pH。3.1.2緩沖液的選擇2024/11/14112當(dāng)需要將洗脫液分部干燥后測量放射性時，殘?jiān)械柠}會妨礙放射性的正常測量或分離較小的分子時去鹽也常常出現(xiàn)困難，在這些情況下可選用揮發(fā)性緩沖液。在進(jìn)行某些容易丟失活性的物質(zhì)的層析分離時，緩沖液中可適當(dāng)加入保護(hù)劑，如巰基保護(hù)劑：半胱氨酸、巰基乙醇；螯合劑：EDTA、甘氨酸；無機(jī)離子等。洗脫液按一定的體積分別收集后逐管進(jìn)行分析，最后將分析結(jié)果對收集管號作圖。洗脫峰純度鑒定2024/11/14114理論上應(yīng)出現(xiàn)一個對稱的峰，但實(shí)際上吸附層析得到的峰幾乎都有拖尾現(xiàn)象。鑒定可用圓盤電泳和凝膠過濾法。分析分為兩種類型：1、非特異性分析，反映各組分的分離情況；2、特異性分析，反映目的物的具體位置。123.6應(yīng)用實(shí)例DEAE纖維素柱層析分離甘露醇脫氫酶DEAE纖維素柱上的層析分離人血清免疫球蛋白的分離情況兔γ－球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纖維素柱上的層析分離天花粉各成分用特種離子交換劑層析分離天花粉各成分用特種離子交換劑層析分離E.Coli核酸在甲基血清白蛋白硅藻土層析柱上的分部分離情況凝膠過濾(分子篩層析)2024/11/14123凝膠層析中常用的術(shù)語和參數(shù)2024/11/14126床體積：膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（Vt）表示。Vt=V0+Vi+Vg內(nèi)水體積：是層析基質(zhì)顆粒內(nèi)部所含水的體積，用（V0）表示。外水體積：層析基質(zhì)顆粒之間所含水的體積，用（Vi）表示?；|(zhì)體積：層析基質(zhì)本身在層析柱中所占有的體積（Vg）表示。凝膠過濾的分配常數(shù)Kav=Vt-VoVe-Vo在給定的條件下，Vt和Vo都為恒定值，而Ve隨著分離物分子質(zhì)量的變化而變化。對凝膠過濾，其分配常數(shù)應(yīng)在0≥Kav≥1。當(dāng)被分離物質(zhì)完全排阻時，Kav等于0，Ve等于V0；當(dāng)被分離物質(zhì)自由擴(kuò)散時，Kav等于1，Ve等于Vo＋Vi。Vt＝πr2h或用Vt＝Vo＋Vi＋VgVg很小，可忽略不計(jì)。V0一般用藍(lán)色葡聚糖2000測定，其分子是為200萬，呈藍(lán)色，在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可直接觀察。Vt是凝膠過濾柱床總體積，由三部分組成，即Vo＋Vi＋Vg。從上式可以看出，Ve、Vo可通過層析過程中測定，只要測出Vt即可計(jì)算出Kav。010302Vi的測定：選用一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測出洗脫體積，減去V0就是Vi。常用鉻酸鉀來測定，鉻酸鉀為黃色化合物，可直接觀察，優(yōu)點(diǎn)為不與葡聚糖起任何反應(yīng)；也可用硫酸銨測定，用硝酸銀檢出洗脫峰。凝及的選擇和處理2024/11/14131凝膠的選擇凝膠的型號和粒度的選擇型號的選擇：選擇時主要根據(jù)凝膠的篩分范圍、凝膠分辨率及分離目的而確定。粒度的選擇：根據(jù)層析對分辨率及流速的要求合理的選擇凝膠的粒度。0102主要凝膠過濾介質(zhì)的牌號及骨架結(jié)構(gòu)性能：2024/11/14134溶脹性Sephadex系均以干態(tài)供應(yīng)，使用前必須在過量的溶劑中充分溶脹后才能使用?；瘜W(xué)穩(wěn)定性Sephadex不溶于一切溶劑，在水、鹽溶液、有機(jī)溶劑、堿及弱酸溶劑中均較穩(wěn)定。因葡聚糖中的糖苷鍵在強(qiáng)酸中可發(fā)生降解作用，所以只能接觸強(qiáng)酸的稀溶液，在0.1mol/L鹽酸中可接觸1～2小時，在0.02mol/L鹽酸中經(jīng)6個月均無明顯變化，但要避免作用氧化劑。(3)物理穩(wěn)定性pH中性濕態(tài)珠體可經(jīng)受120℃、30min高壓滅菌而不影響色譜性能(4)機(jī)械強(qiáng)度Sephadex凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于交聯(lián)度，交聯(lián)度越大，機(jī)械強(qiáng)度越高。機(jī)械強(qiáng)度與柱床所能承受的壓力有關(guān)，其壓力與流速的關(guān)系為：V=K×ΔPLV：線速度，cm/h；ΔP：壓力降，cm水柱；L：床高；K：比滲透率，受粒徑影響較大。葡聚糖凝膠(G)2024/11/14136型號分離范圍(分子量)吸水量(克／克干凝膠)膨脹體積(毫升／克干凝膠)浸泡時間蛋白質(zhì)多糖20～25℃90~100℃10<700<7001.02-33115<1500<15001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-40725Sephadex的型號及性能瓊脂糖系由經(jīng)過純化的瓊脂糖制備，其中含有極小的帶電基團(tuán)。利用瓊脂糖熱溶液冷卻時可凝膠化的特點(diǎn)，能方便地制成珠狀物。在凝膠過程中由單獨(dú)的多糖鏈先形成雙螺旋，然后聚集成膠束。膠束之間有孔，孔的大小取決于膠束的多少即瓊脂糖的濃度。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠非特異性吸附極低，分離范圍很廣，分離范圍從10000～40000000，所以適用于分子量差距較大的分子間分離，分辨率不很高。瓊脂糖凝膠有兩種牌號Bio－GelA系和SepharoseBio－GelA系型號及性能2024/11/14140Sepharose系型號能性能2024/11/14141Sepharose是該系中最早的產(chǎn)品，為非交聯(lián)結(jié)構(gòu)，因此不能進(jìn)行高壓滅菌，僅能在2～40℃范圍內(nèi)使用。根據(jù)瓊脂糖含量的不同，對含量為2％、4％及6％的產(chǎn)品分別命名為2B、4B和6B。由于新型凝膠的不斷出現(xiàn)，此型凝膠有逐漸被淘汰的趨勢。Superose為剛性－半剛性珠體，在高黏性液體如8mol/L尿素下也能保持適當(dāng)流速將廣泛的分離范圍及高分辨率集于一身，適用于糖類、核酸、病毒等的分離，特別是包含體蛋白在促溶劑中的純化。能一次性分離生物分子大小差異較大按的混合物。由于顆粒細(xì)小，粒度分布均勻，柱效高，可允許高流速，適用于中、高壓層析系統(tǒng)分離。SepharoseFastFlow是新型的BioProcess凝膠介質(zhì)，經(jīng)過高度交聯(lián)的瓊脂糖珠體。具有機(jī)械強(qiáng)度高、流速快、極高的物理化學(xué)穩(wěn)定性及非特異性吸附極低等特點(diǎn)，而適合工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)使用。對蛋白質(zhì)的回收率很高，并可用多種促溶劑及有機(jī)溶劑或1～2mol/L的NaOH進(jìn)行清洗。聚丙烯酰胺系2024/11/