《基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)規(guī)程》

T/CIXXXX—2024

基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組樣品量要求，確立了樣品采集與保存、蛋白質(zhì)提取、樣品運(yùn)

輸、質(zhì)量控制、蛋白質(zhì)酶解及除鹽、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的程序，描述了質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制的方法。

本文件適用于動(dòng)植物組織、細(xì)胞、細(xì)菌、真菌、血清、血漿、各類體液等樣品中提取的蛋白質(zhì)樣品。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

定量蛋白質(zhì)組quantitativeproteomics(QP）

對(duì)一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜混合體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確鑒定和定量。

注：可用于篩選和尋找任何因素引起的樣本之間的差異表達(dá)蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)揭示細(xì)胞生理病理等功能，同時(shí)

也可對(duì)某些關(guān)鍵蛋白進(jìn)行定性和定量分析。

3.2

蛋白質(zhì)酶解proteolysis

蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下降解成肽段的過程。

3.3

非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組labelfree(LF）

不需要對(duì)比較樣本做特定標(biāo)記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)

便可得到樣品間蛋白表達(dá)量的變化。

3.4

子離子daughterion(DI）

母離子進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)形成的產(chǎn)物，反應(yīng)可以是單分子解離，形成碎片離子、離子或分子反應(yīng)、或

發(fā)生了電荷數(shù)的改變。

3.5

保留時(shí)間retentiontime(RT）

被色譜分離的樣品組分從進(jìn)樣開始到色譜柱后出現(xiàn)該組分濃度極大值時(shí)的時(shí)間，也即從進(jìn)樣開始到

出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點(diǎn)時(shí)為止所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為此組分的保留時(shí)間，用RT表示，常以分鐘（min）

為時(shí)間單位。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件：

MS：質(zhì)譜分析法(massspectrometry)

iTRAQ：同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification）

TMT：串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組(tandemmasstag）

DDA：數(shù)據(jù)依賴質(zhì)譜掃描模式采集(datadependentacquisition）

DIA：數(shù)據(jù)非依賴質(zhì)譜掃描模式采集(dataindependentacquisition)

MS1：一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)(massspectrometry1）

MS2：二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)(massspectrometry2）

iRT：索引保留時(shí)間(indexedretentiontime）

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5樣品量要求

根據(jù)不同樣品類型和檢測(cè)目標(biāo)準(zhǔn)備足量樣品，在條件許可情況下，盡量加倍準(zhǔn)備樣品量，并做好樣

品備份工作，表1為推薦樣品量。

表1推薦樣品量

樣品類型推薦樣品量

新鮮動(dòng)物組織50mg～2g

新鮮植物組織100mg～50g

細(xì)菌/真菌菌體50mg～2g

新鮮培養(yǎng)細(xì)胞5×106個(gè)～1×107個(gè)

血清50μL～100μL

血漿50μL～100μL

唾液、羊水、腦脊液100μL～500μL

尿液15mL～50mL

6樣品采集與保存

6.1保存樣品之前需要對(duì)新鮮采集樣品進(jìn)行預(yù)處理，去除易對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響的雜質(zhì)或污染物，如：

殘留的血液、培養(yǎng)液、沉淀物、泥土等非目標(biāo)檢測(cè)物，需要對(duì)組織和細(xì)胞進(jìn)行充分破碎，以提高蛋白質(zhì)

提取效率，具體要求見表2。

表2樣品采集與保存

樣品類型樣品采集與保存要求

1.1手術(shù)切除的人體組織，使用4℃預(yù)冷的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）或無菌生理鹽水洗去殘留

血液等非目標(biāo)檢測(cè)污染物a；

b

1.2其他動(dòng)物來源組織如肝臟、心臟等可采用灌流方式去血；

1.3如無灌流條件可將組織剪碎后用4℃預(yù)冷的PBS或生理鹽水去除血液；

1新鮮動(dòng)物組織1.4將組織剪/切碎成0.5cm3～1.0cm3的小塊；

1.5液氮速凍后-80℃保存。

a：血液等組織液中因含多種高豐度蛋白質(zhì)，會(huì)降低蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目，應(yīng)在樣品采集階段決定是否去除高豐

度蛋白質(zhì)；

b；組織樣品需保證新鮮狀態(tài)下才可進(jìn)行灌流操作，灌流不適用于冷凍保存或經(jīng)固定液浸泡的其他不新鮮的

組織樣品。

2.1木本植物的花、葉等，草本科植物，藻類，蕨類植物和大型真菌等的柔軟組織，推薦樣品

量為0.1g～10g；

2.2果實(shí)和種子推薦采集樣品量為0.5g～10g；

2新鮮植物組織2.3富含雜質(zhì)或蛋白質(zhì)含量低的植物樣品，如樹根、樹皮、木質(zhì)部、韌皮部組織等，應(yīng)采集樣

本量為5g～50g；

2.4應(yīng)使用PBS或生理鹽水清洗干凈樣品表面泥土等非目標(biāo)檢查污染物，去除其他相鄰組織；

2.5取樣后盡快液氮速凍后-80℃保存。含水量多的樣本，如果實(shí)、花等，可先凍干再液氮速凍。

3.13000g離心10min收集菌體；

3細(xì)菌/真菌菌體3.2使用預(yù)冷的無菌PBS清洗沉淀塊三次，離心去除上清液，保留沉淀塊；

3.3液氮速凍后-80℃保存。

4.1貼壁細(xì)胞：細(xì)胞長(zhǎng)至90%密度時(shí)，吸干凈培養(yǎng)基，使用預(yù)冷的無菌PBS潤(rùn)洗細(xì)胞表面1~2

次，吸干PBS；使用胰蛋白酶消化（需避免過度消化）或使用細(xì)胞刮（動(dòng)作要快）采集細(xì)胞；

4℃，300g，5min離心去除上清液；加入預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞后，再4℃，300g，5min

4新鮮培養(yǎng)細(xì)胞

離心沉淀細(xì)胞，去除上清液；液氮速凍后-80℃保存；

4.2懸浮細(xì)胞：采集細(xì)胞懸液至離心管；4℃，300g，5min離心去除上清液；經(jīng)預(yù)冷PBS輕柔

重懸細(xì)胞成單細(xì)胞懸液后，再次離心去除上清；液氮速凍后-80℃保存。

5.1采集血液后放入試管，室溫靜置30min；

5.2如不能及時(shí)處理樣品，需將新鮮采集的血液置于4℃冰箱，2h內(nèi)離心；

5血清

5.3待血液凝結(jié)后，2000g離心10min，小心吸取上層淡黃色清液于EP管；

5.4液氮速凍后-80℃保存。

6血漿6.1用抗凝管收集血液，輕柔顛倒混勻5次，室溫靜置30min；

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樣品類型樣品采集與保存要求

6.21500g離心10min去除血細(xì)胞，吸取上清液至凍存管或EP管；

6.3液氮速凍后-80℃保存。

7.11500g離心10min去除體液中的沉淀，保留上清液至凍存管或EP管；

7唾液、羊水、腦脊液

7.2液氮速凍后-80℃保存。

8.15000g離心30min去除體液中的細(xì)胞及尿沉渣，保留上清液至收集管；

8尿液

8.2液氮速凍后-80℃保存。

6.2所有前處理步驟應(yīng)盡量保證在冰上或4℃下低溫操作，并盡可能縮短操作時(shí)間以減小蛋白質(zhì)降解

幾率。

6.3制塑劑、聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）等表面活性劑屬于污染物，容易影響數(shù)據(jù)質(zhì)量，

應(yīng)避免使用含此類污染物的槍頭、EP管或凍存管處理和保存樣品。

6.4應(yīng)使用旋蓋密封管或氣密性好的容器保存樣品，以免液氮速凍或低溫保存時(shí)因氣壓變化造成管蓋

彈開。不方便存儲(chǔ)在EP管或凍存管中的體積較大的組織樣品，可采用錫箔紙等材料仔細(xì)包裝。樣品如

需運(yùn)輸，應(yīng)用封口膜密封管蓋。

7蛋白質(zhì)提取

7.1針對(duì)不同樣品類型，提取蛋白質(zhì)的步驟和方法有所不同，需要根據(jù)樣品類型選擇對(duì)應(yīng)方法進(jìn)行操

作，具體參考表3。

表3樣品前處理

樣品類型樣品前處理備注

1.1低溫快速將大塊的組織剪或切成小塊，使用含1%蛋白酶抑制劑的預(yù)冷PBS緩沖液反

復(fù)進(jìn)一步清洗去除血液；

1.2組織塊中如含有血管、脂肪等非目標(biāo)檢測(cè)物，應(yīng)盡量剝離去除；

1.3樣品吸干后稱重并記錄；

1.4進(jìn)一步破碎組織塊，可選擇液氮研磨、勻漿或加入合適直徑的研磨珠后使用組織破

a應(yīng)盡量充分破

1新鮮動(dòng)物碎儀將組織破碎；碎和溶解樣品，

組織1.5加入蛋白質(zhì)裂解液溶解破碎樣品，部分組織可能較難溶解，可添加蛋白質(zhì)裂解液后但也需要盡可

在低溫下超聲破碎，或用渦旋振蕩器劇烈振蕩，使其盡可能均勻溶于裂解液中。骨能減少不必要

組織等無機(jī)鹽含量高的組織塊最終無法全部溶解，屬正?，F(xiàn)象。的破碎步驟，以

a：對(duì)于大多數(shù)組織選用1.0mm直徑的研磨珠，纖維類植物樣品如單子葉植物的葉子用2mm～3mm，減少樣品損失；

茵類用0.5mm，細(xì)胞類用0.1mm直徑的研磨珠。針對(duì)不同的組織類型,珠子的用量不同，如動(dòng)物組

蛋白質(zhì)裂解液

織球料比一般為1：1，球和料的體積最少不能少于容器的1/3,最高只能2/3。若發(fā)現(xiàn)研磨效果不好，

可以同時(shí)加入大小研磨珠配合研磨，另外可適當(dāng)增加研磨珠數(shù)量和研磨時(shí)間。的量要加足，建

議按樣品重量：

2.1低溫快速將大塊的組織剪或切成小塊，液氮速凍后放入超低溫冰箱保存；

裂解液體積（w：

2.2由于植物細(xì)胞壁厚，應(yīng)使用液氮充分研磨破碎為細(xì)粉；

v）=1:5～1：

2.3加入蛋白質(zhì)裂解液溶解樣品后，需在低溫下（如冰?。┏暺扑椋蛴脺u旋振蕩器

2新鮮植物

劇烈振蕩（一般每振蕩3min需將樣品插入冰上靜置3min，振蕩次數(shù)則根據(jù)樣品溶10添加。即100

組織

解情況隨機(jī)調(diào)整），使其盡可能均勻溶于裂解液中；mg克樣品，加入

0.5mL～1mL

2.4由于植物樣品次級(jí)代謝產(chǎn)物和色素較多，容易干擾質(zhì)譜檢測(cè)，因此需要添加如丙酮、

三氯乙酸、甲醇等有機(jī)溶劑沉淀樣品的步驟來去除色素和次級(jí)代謝物、脂肪等雜質(zhì)。的蛋白質(zhì)裂解

液。

3.1菌體樣品因具細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，可采用液氮研磨、超聲或高壓細(xì)胞破碎儀等方法將菌體

沉淀塊充分破碎，充分破碎菌體，是提高蛋白質(zhì)提取效率的關(guān)鍵；

3細(xì)菌/真菌

3.2部分細(xì)菌（尤以革蘭陽性菌為甚）細(xì)胞壁非常厚，需要使用較強(qiáng)的破碎條件，如增

菌體

強(qiáng)破碎參數(shù)、增加破碎時(shí)間、組合3.1b中提到的多種破碎方法以充分破碎樣品；

3.3完成破碎后加入蛋白質(zhì)裂解液，反復(fù)震蕩以充分溶解樣品。

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樣品類型樣品前處理備注

4.1貼壁細(xì)胞長(zhǎng)至90%密度時(shí)，吸干凈培養(yǎng)基，使用預(yù)冷的無菌PBS潤(rùn)洗細(xì)胞表面1～2

次，吸干PBS后，將培養(yǎng)皿/瓶轉(zhuǎn)移到冰上操作，往培養(yǎng)皿/瓶中直接加蛋白質(zhì)裂解液，

按每25cm2培養(yǎng)瓶底面積加500μL～800μL體積裂解液，使用細(xì)胞刮反復(fù)刮下每1×106個(gè)細(xì)

4新鮮培養(yǎng)

培養(yǎng)皿/瓶中貼壁細(xì)胞，收集裂解液于EP管；胞添加200μL

細(xì)胞

4.2采集懸浮細(xì)胞懸液至離心管，離心去除上清液，經(jīng)預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞沉淀塊后，4℃，蛋白質(zhì)裂解液。

300g，5min離心去除上清，按每1×106個(gè)細(xì)胞添加200μL蛋白質(zhì)裂解液，充分

吹打或渦旋以迅速溶解細(xì)胞沉淀塊。

5血清5～8體液類樣品中含高豐度蛋白質(zhì)（如：Albumin,IgG,IgG(lightchains),IgA,IgM,可不加蛋白質(zhì)

6血漿IgD,IgE等），會(huì)極大降低質(zhì)譜對(duì)其他中、低豐度蛋白質(zhì)的鑒定效率，從而得到較低的裂解液，經(jīng)蛋白

7唾液、羊總蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。若檢測(cè)目標(biāo)為中、低豐度蛋白，可選擇的方法有兩種：質(zhì)濃度檢測(cè)后，

水、腦脊液1）采用高豐度蛋白質(zhì)去除試劑盒，以去除高豐度蛋白質(zhì)；直接進(jìn)入酶解

8尿液2）或采用低豐度蛋白質(zhì)富集試劑盒，以富集低豐度蛋白質(zhì)。操作環(huán)節(jié)。

7.2應(yīng)選擇溶解性強(qiáng)的蛋白質(zhì)裂解液裂解樣品，推薦蛋白質(zhì)裂解液見表4，亦可采購樣品溶解效果好、

蛋白質(zhì)提取效率高、酶解及質(zhì)譜兼容的商品化蛋白質(zhì)裂解液。為取得最佳的使用效果，可以適當(dāng)將裂解

液分裝后使用，應(yīng)盡量避免過多的反復(fù)凍融。

表4各種裂解液主要特點(diǎn)、差異和選擇

裂解液編號(hào)1號(hào)2號(hào)3號(hào)4號(hào)5號(hào)

細(xì)胞組織蛋白質(zhì)提取裂

1%SDS裂解液4%SDS裂解液1%SDC裂解液8M尿素裂解液水化液

解液

7M尿素，2M硫

1%（w/v）SDS，1%4%（w/v）SDS，1%脲，20mMDTT，

8M尿素，1%

（w/v）蛋白酶抑制（w/v）蛋白酶抑1%（w/v）SDC，1001%（w/v）蛋白酶

（w/v），100mM

配方劑Cocktail，100制劑Cocktail，mMTris/HCl抑制劑

Tris/HCl（pH

mMTris/HCl100mMTris/HCl（pH8.0）。Cocktail，2%

8.0）。

（pH8.0）。（pH8.0）。（w/v）CHAPS，

1%（w/v）SDS。

裂解強(qiáng)度強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)

對(duì)膜蛋白的提取好較好較好較好非常好

對(duì)胞漿蛋白的提取很好很好很好很好很好

對(duì)核蛋白的提取很好很好很好很好很好

胞漿磷酸化蛋白提取很好很好很好很好很好

細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子提取很好很好很好很好很好

含蛋白酶抑制劑是是否否是

含磷酸酯酶抑制劑否否否否否

不同物種樣品兼容性高高高高高

推薦的蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)去垢劑兼容的

BCA試劑盒BCA試劑盒BCA試劑盒BCA試劑盒

試劑盒Bradford試劑盒

若進(jìn)行超濾管輔助酶解，

否否否否否

是否需要丙酮沉淀？

若進(jìn)行非超濾管輔助的

溶液酶解，是否需要丙酮是是否否是

沉淀？

若進(jìn)行膠內(nèi)酶解，是否需

否否否否否

要丙酮沉淀？

植物、細(xì)菌（革

貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)蘭陽性菌）、真

優(yōu)先推薦裂解的樣品類動(dòng)物組織、細(xì)菌動(dòng)物組織、細(xì)菌（革動(dòng)物組織、細(xì)菌

胞、外泌體、亞細(xì)菌、膜蛋白含量

型（革蘭陰性菌）蘭陰性菌）（革蘭陰性菌）

胞器高的樣品類型、

難溶性蛋白質(zhì)

7.3若選擇表4中的1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)和5號(hào)裂解液則按照以下步驟進(jìn)行操作：

a)需在使用裂解液前新鮮加入終濃度為1mM的PMSF。如需檢測(cè)磷酸化蛋白，必須加入含磷酸酶

抑制劑的蛋白酶抑制劑化合物。所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行；

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b)加入蛋白質(zhì)裂解液后在冰上裂解30min，每隔10min渦旋震蕩樣品管20s，可促進(jìn)蛋白質(zhì)

從細(xì)胞中釋放；

c)在4℃，16000g離心30min，收集上清液為樣品蛋白質(zhì)溶液，可進(jìn)行步驟7.5的蛋白質(zhì)濃度

測(cè)定；

d)此步驟獲得的蛋白質(zhì)樣品可直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也可分裝保存至-80℃冰箱/液氮罐中。此步

驟獲得的蛋白質(zhì)樣品可直接兼容步驟10.1介紹的超濾管輔助酶解實(shí)驗(yàn)流程。

7.4若選擇3號(hào)裂解液則按照以下步驟進(jìn)行操作：

a)金屬浴95℃，1000rpm振蕩5min；對(duì)于血液樣品，可直接取0.5μL進(jìn)行酶解步驟的操作；

b)在4℃，12000g離心20min，取蛋白質(zhì)上清液，可進(jìn)行步驟7.5的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定；

c)此步驟獲得的蛋白質(zhì)樣品可直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也可分裝保存至-80℃冰箱/液氮罐中。此步

驟獲得的蛋白質(zhì)樣品可直接兼容步驟10.2介紹的快速溶液內(nèi)酶解實(shí)驗(yàn)流程。

7.5若選擇1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)裂解液應(yīng)選擇BCA法（BicinchoninicAcid）蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑

盒對(duì)測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度，選擇5號(hào)裂解液則應(yīng)選擇考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）。通常人和小鼠軟組織

樣品蛋白質(zhì)總量/樣品重量在0.5%～0.7%為正常蛋白質(zhì)提取效率，蛋白質(zhì)總量不低于200μg、蛋白質(zhì)

濃度不低于1μg/μL說明提取效果較好。

8樣品運(yùn)輸

8.1樣品如果需要運(yùn)輸，應(yīng)盡量送往距離最近的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

8.2如需低溫運(yùn)送，應(yīng)使用足夠多的冰袋和保溫盒，保證整個(gè)運(yùn)輸過程中的溫度維持在-20℃。

8.3空運(yùn)時(shí)可使用-20℃封閉式冰盒，以防止溫度過低而使塑料管變脆破裂。

9蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量控制

使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)檢，將所有蛋白質(zhì)樣品取等量（推薦上樣量：

20μg蛋白質(zhì)/樣品）加載到凝膠后進(jìn)行電泳，對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色至背景透明無色后使用

凝膠成像儀掃描獲得樣品的完整蛋白質(zhì)組條帶。樣品結(jié)果判定及對(duì)應(yīng)解決方法見表5。

表5SDS質(zhì)量控制結(jié)果判定及解決方法

SDS結(jié)果質(zhì)檢結(jié)果判定解決方法

背景干凈，可明顯分辨蛋白質(zhì)梯狀條帶，

在不同分子量間分布均勻，同類樣品間蛋

質(zhì)量高，可繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。/

白質(zhì)條帶整體和局部無明顯差異，各泳道

重復(fù)性和顏色一致。

蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，不

樣品間的蛋白質(zhì)條帶灰度值差異過大。重新進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)后再次質(zhì)檢。

符合要求。

再次實(shí)驗(yàn)，重新提取蛋白質(zhì)，再次質(zhì)檢判

樣品質(zhì)量存疑，有待再次實(shí)驗(yàn)判

同一類型樣品蛋白質(zhì)條帶分布差異過大。定是提取不充分導(dǎo)致條帶差異過大還是樣

定。

品本身存在差異。

蛋白質(zhì)分布不均勻，出現(xiàn)如：分布在某一

蛋白質(zhì)提取效率低，提取不充使用較前更強(qiáng)的破碎/裂解條件處理樣品后

范圍分子量的蛋白質(zhì)條帶過少，或樣品條

分。不符合要求。再次質(zhì)檢。

帶分布零星且單一。

蛋白質(zhì)條帶中橫紋、縱紋較多，或背景較蛋白質(zhì)樣品中鹽類等雜質(zhì)含量使用有機(jī)溶劑如丙酮、甲醇沉淀蛋白質(zhì)后

深，無法清洗分辨出蛋白質(zhì)梯狀條帶。高，不符合要求。溶于蛋白質(zhì)裂解液后再次質(zhì)檢。

無明顯梯狀蛋白質(zhì)條帶、條帶出現(xiàn)拖尾、采集新鮮樣品，注意操作手法，重新進(jìn)行

蛋白質(zhì)樣品發(fā)生降解。

主要條帶堆積在低分子量區(qū)域。蛋白質(zhì)提取和質(zhì)檢。

10蛋白質(zhì)酶解及除鹽

10.1超濾管輔助的蛋白質(zhì)酶解（Filter-aidedsamplepreparation，F(xiàn)ASP）

10.1.1當(dāng)使用的蛋白質(zhì)裂解液為SDS裂解、水化液，或含有PEG及各種表面活性劑（如SDS、CHAPS、

Triton、Tweens、DMSO、NP-40等），應(yīng)使用FASP方法進(jìn)行酶解。

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10.1.2采購質(zhì)譜級(jí)品質(zhì)的試劑耗材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，蛋白質(zhì)酶解及除鹽的試劑配方見表6。

表6非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)酶解及除鹽試劑配方

試劑配方主要溶劑備注

應(yīng)新鮮配置，現(xiàn)配現(xiàn)用；使用

8MUrea，100mMTris/HCl，pH8.0～

8M尿素（Urea）緩沖液前充分混勻；操作過程應(yīng)注意

8.5

溫度不可超過37℃。

500mM碘乙酰胺（IAA）500mMIAA現(xiàn)配現(xiàn)用，避光使用。

1M二硫蘇糖醇（DTT）1MDTT

50mM三乙基碳酸氫銨（TEAB）50mMTEAB

金標(biāo)水

0.5%三氟乙酸（TFA）0.5%（v/v）TFA

0.1%TFA0.1%（v/v）TFA

5%（v/v）乙腈（ACN），0.5%（v/v）現(xiàn)配現(xiàn)用。

平衡液

TFA

0.1%甲酸（FA）0.1%（v/v）FA

溶劑A2%ACN，98%H2O，0.1%FA

溶劑B80%ACN，20%H2O，0.1%FA質(zhì)譜級(jí)乙腈

10.1.3取7.3c）步驟獲得的蛋白質(zhì)50μg～100μg進(jìn)行酶解。

10.1.4加適當(dāng)體積的8M尿素，使其終濃度大于4M。

10.1.5加適量體積的1MDTT溶液，使其工作濃度為20mM。

10.1.637℃水浴1小時(shí)。

10.1.7待樣品恢復(fù)至室溫，加適量體積500mM的IAA，使其工作濃度在50mM。

10.1.8室溫避光孵育30分鐘。

10.1.9加入200uL的50mM的TEAB潤(rùn)洗新的V型超濾管（10Kda），12000g離心10min至液體

全部濾下。

10.1.10樣品加入超濾管，每管體積不要超過400μL，4℃，12000g離心，單次離心時(shí)間不可超過

15min，離心次數(shù)視超濾管內(nèi)殘留液體情況而定，直至液體全部濾下。

10.1.11加200μL的8M尿素，4℃，12000g離心潤(rùn)洗樣品，單次離心時(shí)間不可超過15min，離心

次數(shù)視超濾管內(nèi)殘留液體情況而定，直至液體剛好全部濾下；若使用的離心機(jī)是定角轉(zhuǎn)子，在每一次離

心前可水平旋轉(zhuǎn)超濾管180°，以使樣品得到更充分的潤(rùn)洗。

10.1.12若細(xì)胞組織裂解液中含SDS、硫脲、CHAPS、β-巰基乙醇、Triton、DMSO等去垢劑成分，需重

復(fù)10.1.10步驟3次～6次，方能去除以上物質(zhì)的干擾；若使用的裂解液是8M尿素裂解液則重復(fù)

10.1.10步驟一次即可。

10.1.13加入200μL的50mMTEAB潤(rùn)洗樣品2次～5次，根據(jù)步驟10.1.10的離心難易程度調(diào)整

離心次數(shù)，越難離心的樣品應(yīng)該增加離心次數(shù)。

10.1.14將超濾管從舊收集管套中取出，用干凈的無粉濾紙將超濾管外的液體吸干，將超濾管放置到

新的收集管套中。

10.1.15依次加入50mM的TEAB和胰蛋白酶溶液。

10.1.16加入TEAB的體積依據(jù)所加胰蛋白酶的體積定，使兩者體積之和為120μL～130μL。

10.1.17胰蛋白酶溶液可配置為1μg/μL，按照與蛋白質(zhì)的量比例為1:30～1:50加入，渦旋震蕩1min；

10.1.18封口膜封住，放入37℃培養(yǎng)箱過夜。

10.1.19酶解時(shí)間8h～16h，不能超過16h。

10.1.20在室溫下，12000g離心，轉(zhuǎn)移收集濾下的多肽溶液至干凈的EP管。

10.1.21超濾管內(nèi)加70μL的50mMTEAB，渦旋振蕩；在室溫下，12000g離心，轉(zhuǎn)移濾下多肽溶液

與步驟10.1.20的多肽過濾液混合。

10.1.22重復(fù)10.1.21步驟一次。

10.1.23使用BCA多肽濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定多肽濃度，計(jì)算酶解效率（酶解效率=酶解后多肽量/酶

解前蛋白量），酶解效率一般在60%～90%說明酶解效率和多肽回收率較好。

10.1.24使用真空冷凍干燥機(jī)凍干縮小樣本體積至50μL，轉(zhuǎn)到步驟10.3進(jìn)行多肽除鹽。

10.2溶液內(nèi)酶解（Insolutiondigestion）

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10.2.1取步驟7.4b)獲得的蛋白質(zhì)10μg～30μg（總體積不能超過20μL），加入終濃度為20mM

的三(2-羧乙基)膦（Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP）和終濃度為40mM的2-氯乙酰胺

（2-Chloroacetamide，CAA），金屬浴95℃，1000rpm振蕩5min。

10.2.2加熱結(jié)束待樣品恢復(fù)至室溫后，加入15μL的胰蛋白酶與重組賴氨酸酶（Lys-C）混合物；添

加比例為：胰蛋白酶：蛋白（質(zhì)量比）=1：20、Lys-C；蛋白(質(zhì)量比）＝1：50，并吹打混勻；混勻，

金屬浴37℃，800rpm振蕩酶解2h。

10.2.3加入終濃度0.5%的TFA混勻，終止酶解反應(yīng)，此時(shí)會(huì)有沉淀出現(xiàn)，20000g室溫離心1min，

吸取上清為酶解好的多肽，使用BCA多肽濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定多肽濃度。

10.2.4酶解后樣本如不能及時(shí)進(jìn)行后續(xù)脫鹽處理，可-80℃存放2周。

10.3多肽除鹽

10.3.1將步驟10.1.24或10.2.4得到的多肽溶液，取0.5μL～1μL樣品點(diǎn)在pH試紙上檢測(cè)此時(shí)

樣品pH值，可使用20%TFA溶液條件樣品pH值，確保樣品pH﹤3。

10.3.2加入100微升質(zhì)譜級(jí)ACN，室溫1000g離心1min，以活化C18除鹽柱。

10.3.3加入100微升平衡液，室溫1000g離心1min，以平衡C18除鹽柱；重復(fù)此步驟一次。

10.3.4把復(fù)溶好的多肽溶液加入C18除鹽柱，1000g室溫離心1min，使多肽溶液從柱子流出，并檢

查多肽溶液是否都穿過柱子，如果溶液未完全穿過柱子，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，但不可增加離心力；收

集流出溶液，反復(fù)過柱子2次以增加C18對(duì)多肽的吸附效果。

10.3.5加入100μL0.1%的TFA溶液，1000g室溫離心1min，以濾洗除鹽柱，重復(fù)濾洗1次。

10.3.6更換新的收集管，加入50μL70%的ACN溶液至除鹽柱，1000g室溫離心1min，將肽段洗脫

下來；重復(fù)一次本步驟，最終樣本體積約為100μL，此時(shí)得到除鹽后的多肽溶液。

10.3.7使用真空冷凍干燥機(jī)凍干得到除鹽后的多肽干粉，凍干后可于-80℃保存1年。

10.3.8加入10μL～20μL0.1%甲酸重新溶解多肽干粉，經(jīng)BCA多肽濃度測(cè)定試劑盒定量后，各樣

品分別取10μg多肽，凍干后等待進(jìn)行質(zhì)譜分析。

10.4TMT標(biāo)記實(shí)驗(yàn)流程

10.4.1TMT標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

采購質(zhì)譜級(jí)品質(zhì)的試劑耗材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，TMT標(biāo)記實(shí)驗(yàn)試劑及說明詳見表7。

表7TMT標(biāo)記實(shí)驗(yàn)試劑及說明

試劑說明

1M的TEAB用于同量異位質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的10X溶解緩沖液。

50%羥胺10X淬滅試劑，用于TMT實(shí)驗(yàn)的胺反應(yīng)性標(biāo)記。

是串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽，設(shè)計(jì)用于提高樣品多通路水平，同時(shí)不影響蛋白鑒定和定量。Thermo

TMTpro標(biāo)記試劑

ScientificTMTpro18plex標(biāo)記試劑套件實(shí)現(xiàn)對(duì)多達(dá)18份樣品的多通路檢測(cè)。

從-80℃取出標(biāo)記試劑使其恢復(fù)室溫，加入ACN，使標(biāo)記試劑終濃度為20μg/μL。

將步驟10.2.3獲得的不同樣品的多肽干粉取出7μg多肽后真空濃縮干，然后用4μL0.1M

的TEAB溶解。

將TMT標(biāo)記試劑順序打亂，向每一個(gè)樣本中隨機(jī)加入2.1μL標(biāo)記試劑，充分混勻。

25℃金屬浴上反應(yīng)1.5h。

加入0.5μL5%羥胺，混勻后室溫放置15min，以終止反應(yīng)。

每樣品各取2μL混合成一管，將混合樣品使用質(zhì)譜儀檢測(cè)各樣品的含量是否一致以及標(biāo)記

效率是否大于95%，剩余的樣品可進(jìn)行真空濃縮干燥等待除鹽。

標(biāo)記效率大于95%說明標(biāo)記成功。

10.4.2TMT標(biāo)記后的多肽除鹽

采購質(zhì)譜級(jí)品質(zhì)的試劑耗材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，TMT標(biāo)記實(shí)驗(yàn)試劑及說明詳見表8。

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表8TMT標(biāo)記后多肽除鹽耗材及試劑配方

試劑耗材耗材及試劑配方

除鹽柱Sep-PakC181ccVacCartridge50mg

活化液無水甲醇

平衡液80%ACN，0.1%TFA

多肽溶解液2%ACN，0.1%TFA

清洗液2%ACN，0.1%TFA

洗脫液40%ACN，0.1%TFA

用適配的注射器緩慢加入1mL活化液，讓活化液從柱子流出，以活化C18除鹽柱，去除管

底流出液。

加入1mL平衡液，去除管底流出液。重復(fù)此步驟一次。

使用400μL多肽溶解液溶解步驟獲得的多肽干粉，將溶解好的多肽溶液緩慢加

入除鹽柱，吸取從除鹽柱流出的溶液重新緩慢加入除鹽柱，以增加C18填料對(duì)多肽的吸附效率。

加入1mL清洗液，去除管底流出液。重復(fù)此步驟一次，將除鹽柱放入新的收集管。

加入200μL洗脫液。重復(fù)此步驟一次，此時(shí)得到400μL除鹽后的多肽溶液。

使用真空冷凍干燥機(jī)凍干得到除鹽后的多肽干粉，凍干后可于-80℃保存1年。

按照步驟10.6對(duì)凍干后的多肽樣品分餾。

10.5iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)酶解及標(biāo)記（以8標(biāo)為例）

10.5.1蛋白質(zhì)酶解

蛋白質(zhì)定量后取20μg～100μg蛋白溶液置于離心管中，如果是血清、血漿等含有非蛋白

氮（Non-proteinamines）的樣本，則需要減少樣本的總量。

往樣品中加入5倍體積預(yù)冷丙酮，-20℃放置1小時(shí)，充分沉淀蛋白。

4℃，12000g離心10min，取沉淀真空冷凍干燥。

加入50μL的DissolutionBuffer（試劑盒自帶）充分溶解蛋白沉淀。

加入1μLDenaturant（試劑盒自帶），渦旋混勻。

加入2μLReducingReagent（試劑盒自帶），渦旋混勻，60℃反應(yīng)1h。

低速離心收集管壁液體，加入2μLCysteine-BlockingReagent（試劑盒自帶），渦旋混

勻，室溫10分鐘。

用100μL的50mMTEAB潤(rùn)洗超濾管（10Kda），12000g離心15min，將還原烷基化后的

蛋白溶液加入超濾管中，12000g離心20min，直到超濾膜上沒有過剩的液體，棄掉收集管底部溶液（轉(zhuǎn)

速設(shè)置不超過使用的超濾管的最高值，單次離心時(shí)間不超過15min，離心次數(shù)可根據(jù)超濾管內(nèi)殘留液

體量實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，直至將所有體離心濾出）。

加入iTRAQ試劑盒中的DissolutionBuffer100μL，12000g離心20min，棄掉收集管底

部溶液，重復(fù)3次本步驟。

0更換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量1-2μg（與蛋白質(zhì)量比1：50～1：100），

體積25μL，37℃酶切8h～16h。

1取出超濾管，渦旋1min后，12000g離心20min，將酶解消化后的肽段溶液離心于收集管

底部。

2在超濾管中加入25μLDissolutionBuffer，渦旋1min，12000g再次離心20min，與

上步驟1濾出液合并，收集管底部共得到50μL酶解后的樣品（如果體積有損失，加入

DissolutionBuffer調(diào)至50μL）。

10.5.2iTRAQ標(biāo)記

從冰箱中取出iTRAQ標(biāo)記試劑，平衡到室溫，將iTRAQ標(biāo)記試劑室溫低速離心至管底（檢查

iTRAQ標(biāo)記試劑的體積，約為25μL左右）。

向每管iTRAQ標(biāo)記試劑中加入150μL有機(jī)溶劑（加入的有機(jī)溶液的體積可以根據(jù)樣品體積

進(jìn)行調(diào)整，保證其終濃度為70%以上；4標(biāo)的有機(jī)溶劑為乙醇，8標(biāo)的有機(jī)溶劑為異丙醇），渦旋振蕩，

室溫低速離心至管底。

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取50μL步驟2獲得的樣品轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

將iTRAQ標(biāo)記試劑添加到樣品中，渦旋振蕩，室溫低速離心至管底，取0.5μL樣本檢測(cè)其

pH值，如果pH小于7.5，可以加入5μL的DissolutionBuffer。

室溫反應(yīng)2h。

加入100μL金標(biāo)水終止反應(yīng)。

為了檢測(cè)標(biāo)記效率及定量準(zhǔn)確性，從8組樣品中各取出1ul混合，用Ziptip除鹽柱脫鹽后

進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確認(rèn)標(biāo)記反應(yīng)良好，標(biāo)記效率應(yīng)達(dá)到98%以上。

把8組標(biāo)記后的樣品進(jìn)行混合，渦旋振蕩，離心至管底。

真空冷凍離心干燥，凍干后的多肽樣本可保存于-80℃一年。

0按照步驟10.6對(duì)凍干后的多肽樣品分餾。

10.6肽段分餾（高pH反相分餾法）

10.6.1將標(biāo)記好混合凍干后的樣本用150μL流動(dòng)相A（20mM甲酸胺（pH10））復(fù)溶，渦旋振蕩，

12000g離心20min，吸取上清上樣。

10.6.2用Ultimate3000系統(tǒng)連接反向柱（XBridgeC18column,4.6mmx250mm,5μm）進(jìn)行

高pH分離。

10.6.3準(zhǔn)備48個(gè)1.5mL離心管，依次標(biāo)記為1～48，用于收集分離得到的組份1～48。

10.6.4流速設(shè)置為0.8mL/min，分離梯度如表9：

表9高pH反相分餾梯度

時(shí)間（min）流動(dòng)相B（20mM甲酸胺（pH10），80%ACN）

05%

55%

3015%

4538%

4690%

54.590%

555%