日用化學(xué)品體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)

1DB31/T×××-20××日用化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)的基本原理、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)及定義、試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果評(píng)價(jià)和報(bào)告。本標(biāo)準(zhǔn)適用于評(píng)價(jià)日用化學(xué)品及化學(xué)品原料的遺傳毒性。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。OECDGuidelinesforthetestingofchemicals:InVitroMammalianCellMicronucleusTest(No.487),2016年GB/T28646-2012《化學(xué)品體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)方法》3術(shù)語(yǔ)及定義GB/T28646-2012界定的以及下列術(shù)語(yǔ)及定義適用于本文件。為了便于使用，以下重復(fù)列出了GB/T28646-2012中的某些術(shù)語(yǔ)及定義。非整倍體誘發(fā)劑aneugen任何與細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂周期中有關(guān)的成分相互作用后導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)非整倍體現(xiàn)象的物質(zhì)或染色體斷裂劑clastogen任何引起細(xì)胞或生物體中染色體結(jié)構(gòu)畸變的物質(zhì)或因子。胞質(zhì)分裂cytokinesis隨著核分裂（有絲分裂和減數(shù)分裂）之后的細(xì)胞質(zhì)的分裂。細(xì)胞阻滯cytostasis細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制。2DB31/T×××-20××細(xì)胞毒性cytotoxicity對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的有害作用，最終可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。微核micronuclei獨(dú)立于細(xì)胞核主核以外的小核，由有絲分裂或減數(shù)分裂末期滯后的染色體片段或整條染色體構(gòu)成。胞質(zhì)分裂阻斷增殖指數(shù)cytokinesis-blockproliferationindex,CBPI使用細(xì)胞松弛素B時(shí)計(jì)算細(xì)胞毒性的方法。處理組中二次分裂細(xì)胞數(shù)相對(duì)于對(duì)照組的比值。復(fù)制指數(shù)replicationindex,RI使用細(xì)胞松弛素B時(shí)計(jì)算細(xì)胞毒性的方法。染毒期和恢復(fù)期中處理組相對(duì)于對(duì)照組完成分裂周期的細(xì)胞比例。相對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)relativeincreaseincellcount,RICC不使用細(xì)胞松弛素B時(shí)計(jì)算細(xì)胞毒性的方法。3.10相對(duì)集落倍增relativepopulationdoubling,RPD不使用細(xì)胞松弛素B時(shí)計(jì)算細(xì)胞毒性的方法。3.11增殖指數(shù)proliferationindex,PI不使用細(xì)胞松弛素B時(shí)計(jì)算細(xì)胞毒性的方法。4試驗(yàn)原理體外微核（invitromicronucleus,MNvit）試驗(yàn)是用以檢測(cè)細(xì)胞分裂間期細(xì)胞質(zhì)中微核（MN）的一種遺傳毒性檢測(cè)方法。這些微核可由無(wú)著絲粒染色體斷片（例如缺乏著絲點(diǎn)的染色體片段或是那些在細(xì)胞分裂后期無(wú)法遷移到兩極的整條染色體形成。該方法通過(guò)檢測(cè)暴露于受試物期間或之后進(jìn)行過(guò)分裂的細(xì)胞的微核形成率，來(lái)反映受試物導(dǎo)致染色體斷裂和非整倍體的損傷作用。本方法既適用于使用肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑細(xì)胞松弛素B（cytochalasinB,cytoB）的方案，也適用于不使用細(xì)胞松弛素B的方案。在細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂前添加cytoB，可以幫助識(shí)別只進(jìn)行了一次有絲分裂的細(xì)胞（因?yàn)榇藭r(shí)該細(xì)胞為雙核細(xì)胞并且有選擇性地分析這些雙核細(xì)胞的微核率。如果有證據(jù)表明所分析的細(xì)胞增殖已經(jīng)歷了有絲分裂，則允許不使用cytoB的方案。3DB31/T×××-20××5試驗(yàn)方法及步驟5.1準(zhǔn)備5.1.1細(xì)胞常用中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞株（V79、CHL）、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株（CHO）、小鼠淋巴瘤細(xì)胞（L5178Y）和人淋巴母細(xì)胞（TK6）等。對(duì)于已建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株應(yīng)進(jìn)行核型和支原體污染的常規(guī)檢查。5.1.2培養(yǎng)液及培養(yǎng)條件應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)所用系統(tǒng)和細(xì)胞類(lèi)型來(lái)選擇適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件（培養(yǎng)瓶/皿、CO2濃度、溫度和5.1.3代謝活化通常使用的外源性代謝活化系統(tǒng)是S9混合物。其中S9是以酶誘導(dǎo)劑（Aroclor1254或苯巴比妥與β-萘黃酮聯(lián)合使用）處理的嚙齒類(lèi)動(dòng)物肝臟獲得的。S9組分在培養(yǎng)液中使用的濃度范圍通常為1%-10%5.1.4胞質(zhì)分裂阻滯劑各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)考察所用細(xì)胞系的cytoB適合濃度，以得到最佳的溶劑對(duì)照組雙核細(xì)胞率。cytoB的濃度通常為3-6μg/ml。5.2對(duì)照每次試驗(yàn)，在有/無(wú)代謝活化系統(tǒng)條件下均應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性（溶劑）對(duì)照。5.2.1陽(yáng)性對(duì)照當(dāng)需要代謝活化系統(tǒng)時(shí)，染色體斷裂劑陽(yáng)性對(duì)照物可以選用環(huán)磷酰胺、苯并(α)芘，染色體斷裂劑陽(yáng)性對(duì)照物可以選用絲裂霉素C、甲磺酸甲酯、阿糖胞苷、4-硝基氮氧化喹啉；非整倍體誘發(fā)劑陽(yáng)性對(duì)照物可以選用秋水仙素、長(zhǎng)春堿，目前尚未發(fā)現(xiàn)需要代謝活化才能產(chǎn)生毒性的非整倍體誘發(fā)劑。如實(shí)驗(yàn)室在半年內(nèi)進(jìn)行過(guò)陽(yáng)性物試驗(yàn)，且在本試驗(yàn)中得到正確的結(jié)果，則不要求必須在每次試驗(yàn)中進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照物試驗(yàn)。5.2.2陰性對(duì)照每個(gè)收獲時(shí)間點(diǎn)都應(yīng)設(shè)置陰性（溶劑）對(duì)照。陰性（溶劑）對(duì)照除不含受試物外，其他處理應(yīng)與受試物組相同。此外，當(dāng)不具有實(shí)驗(yàn)室歷史資料證實(shí)所用溶劑無(wú)遺傳毒性和無(wú)其他有害作用時(shí)，還應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照。4DB31/T×××-20××5.3受試物5.3.1溶劑的選擇所選溶劑不應(yīng)與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并且在所用濃度下對(duì)細(xì)胞存活率和S9活性均無(wú)影響。常用溶劑包括水、水性溶劑（如氯化鈉、細(xì)胞培養(yǎng)液）、二甲基亞砜（DMSO，終濃度不應(yīng)大于0.5%）等。5.3.2受試物的配制考慮到日用化學(xué)品的特殊性，其取樣過(guò)程應(yīng)盡可能顧及樣品的代表性和均勻性，以便分析結(jié)果能正確反映其產(chǎn)品質(zhì)量。在取樣品前，應(yīng)目測(cè)樣品的性能和特征，并使樣品徹底混勻。受試物應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前新鮮配制，否則就必須證實(shí)貯存不影響其穩(wěn)定性。樣品為粉末、顆粒、膏狀、片劑等固體受試物時(shí)，應(yīng)先研磨成細(xì)粉狀，再溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)娜軇┲?，用前稀釋至適合濃度。樣品為液體受試物時(shí)，可直接加入試驗(yàn)系統(tǒng)和/或用前稀釋至適合濃度。樣品為氣體或揮發(fā)性受試物時(shí)，應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，如在密閉的培養(yǎng)器皿中進(jìn)行暴露處理等。5.4劑量設(shè)計(jì)5.4.1細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞增殖情況是為了確保經(jīng)處理的細(xì)胞在試驗(yàn)過(guò)程中已經(jīng)完成了有絲分裂，而且染毒濃度可引起適當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性。細(xì)胞毒性應(yīng)在有/無(wú)代謝活化系統(tǒng)條件下均使用指示細(xì)胞完整性和生長(zhǎng)情況的指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)確定。5.4.1.1如果使用cytoB，可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)物中單核細(xì)胞、雙核細(xì)胞和多核細(xì)胞的相對(duì)個(gè)數(shù)，為評(píng)價(jià)經(jīng)處理后對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性的影響作精確的定量計(jì)算，并且可以確保只有在處理時(shí)或處理后進(jìn)行了有絲分裂的細(xì)胞才能被計(jì)數(shù)?？梢圆捎冒|(zhì)分裂阻斷增殖指數(shù)（CBPI）或復(fù)制指數(shù)（RI）來(lái)反映細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞總數(shù)單核細(xì)胞數(shù)+2×雙核細(xì)胞數(shù)+細(xì)胞總數(shù)其中，CBPI等于1（即所有細(xì)胞都是單核細(xì)胞）時(shí)，相當(dāng)于100%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制；細(xì)胞總數(shù)應(yīng)計(jì)數(shù)每份培養(yǎng)物至少5%細(xì)胞毒性=100-×100（雙核細(xì)胞數(shù)+2×多核細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)C（雙核細(xì)胞數(shù)+2×多核細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)C其中，T=受試物處理組，C=陰性對(duì)照組；細(xì)胞5DB31/T×××-20××%細(xì)胞毒性=100-RI5.4.1.2如果不使用cytoB，就必須證明所計(jì)數(shù)的細(xì)胞在處理時(shí)或處理后已經(jīng)經(jīng)歷了有絲分裂，否則可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。可以采用溴脫氧尿苷（BrdU）對(duì)永生化細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞增殖原位標(biāo)記得出增殖指數(shù)（PI）或者依據(jù)相對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)（RICC）、相對(duì)集落倍增（RPD）來(lái)反映細(xì)胞增殖情況。其中，cl1：1個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集落數(shù)，cl2：2個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集落數(shù)，cl4：3-4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集落數(shù)，cl8：5-8個(gè)細(xì)胞的細(xì)RPD=受試物處理組細(xì)胞集落倍增數(shù)×100陰性對(duì)照組細(xì)胞集落倍增數(shù)/log2%細(xì)胞毒性=100-RICC（或RPD）5.4.2最高濃度的選擇決定受試物最高濃度的因素是細(xì)胞毒性、受試物在試驗(yàn)系統(tǒng)中的溶解度以及pH值、滲透壓的改變。 每次試驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)置3個(gè)可供分析的濃度。通常所選定的分析濃度間距應(yīng)不超過(guò)10。當(dāng)有細(xì)胞毒性時(shí)，最高濃度應(yīng)能產(chǎn)生55±5%的細(xì)胞毒性（更高水平的濃度可能因細(xì)胞毒性的繼發(fā)作用而引起染色體損傷其濃度范圍應(yīng)包括從55±5%的細(xì)胞毒性到幾乎無(wú)細(xì)胞毒性。如果相對(duì)無(wú)細(xì)胞毒性，也不產(chǎn)生沉淀，則最高濃度可選取0.01mol/L、2mg/ml或者2μl/ml；但如果受試物是未知化學(xué)物時(shí)，最高濃度可以設(shè)置得更高為5mg/ml。對(duì)于表現(xiàn)出陡峭劑量-反應(yīng)曲線的受試物，應(yīng)縮小受試物濃度間距，以便在中等和低毒性范圍的培養(yǎng)也能被檢測(cè)出。對(duì)于相對(duì)不溶解的物質(zhì)，當(dāng)濃度低于不溶解濃度時(shí)仍無(wú)毒性時(shí)，那么最高濃度應(yīng)是能引起最小可見(jiàn)沉淀的最低濃度，但沉淀不應(yīng)影響觀察，最好在試驗(yàn)處理開(kāi)始和結(jié)束時(shí)均評(píng)價(jià)溶解度，因?yàn)橛捎赟9等的存在，試驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)在暴露過(guò)程中溶解度可能發(fā)生變化。5.5試驗(yàn)步驟5.5.1處理程序在有/無(wú)代謝活化系統(tǒng)條件下，將受試物短時(shí)間4h處理細(xì)胞，去除受試物，PBS洗兩次，加入新的培養(yǎng)液，同時(shí)可以選擇添加或不添加cytoB，繼續(xù)使細(xì)胞經(jīng)過(guò)1.5-2.0個(gè)正常細(xì)胞周期后收獲細(xì)胞，就可以檢測(cè)出大部分的非整倍體誘發(fā)劑和染色體斷裂劑。若短期處理4h的初期試驗(yàn)結(jié)果為陰性或不明確，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行無(wú)代謝活化系統(tǒng)條件下的延長(zhǎng)處理（1.5-2.0個(gè)正常細(xì)胞周期）試驗(yàn)。以下表1為推薦的細(xì)6DB31/T×××-20××胞處理程序。表1體外微核試驗(yàn)細(xì)胞處理和收獲時(shí)間5.5.2培養(yǎng)物數(shù)量每種受試物的每個(gè)檢測(cè)濃度，以及陰性（溶劑）對(duì)照、空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照均應(yīng)設(shè)兩個(gè)平行培養(yǎng)物。若實(shí)驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)可以證明平行樣本間的變異很小，只用一個(gè)培養(yǎng)物也可以接受。若每個(gè)濃度只用一個(gè)培養(yǎng)物，建議增加所分析的檢測(cè)濃度數(shù)。5.5.3細(xì)胞收獲及制片每份培養(yǎng)物應(yīng)單獨(dú)收獲和制片。細(xì)胞準(zhǔn)備可能需要進(jìn)行低滲處理，但若有其他方法可使細(xì)胞分散，這一步可省略。只要能保證獲得高質(zhì)量的細(xì)胞供計(jì)數(shù)，制片過(guò)程可以使用不同的技術(shù)。若采用胞質(zhì)分裂阻斷法，應(yīng)保留細(xì)胞質(zhì)用以檢測(cè)微核以及準(zhǔn)確判斷雙核細(xì)胞。玻片可用多種方法染色，例如吉姆薩（Giemsa）染色或DNA特異性熒光染料染色。用DNA熒光染料（如吖叮橙，Acridineorange或Hoechst33258聯(lián)合派洛寧Y）可排除一些用非DNA特異性染料時(shí)的人工顆粒。也可以使用熒光原位雜交（FISH）等方法來(lái)有效的區(qū)分染色體斷裂劑和非整倍體誘發(fā)劑。5.5.4分析所有玻片在進(jìn)行顯微鏡分析前應(yīng)獨(dú)立編號(hào)。5.5.4.1加入cytoB：每個(gè)濃度應(yīng)至少分析2000個(gè)雙核細(xì)胞（每份培養(yǎng)物至少計(jì)數(shù)1000個(gè)雙核細(xì)胞，每個(gè)濃度兩份培養(yǎng)物記錄微核數(shù)并計(jì)算細(xì)胞微核率。如果只用一份培養(yǎng)物，則每個(gè)濃度應(yīng)至少分析2000個(gè)雙核細(xì)胞。應(yīng)注意不要計(jì)數(shù)形狀不規(guī)則或者兩個(gè)核大小差別太大的雙核細(xì)胞；也不應(yīng)計(jì)數(shù)與分散不良的多核細(xì)胞難以區(qū)分的雙核細(xì)胞。多于兩個(gè)以上主核的細(xì)胞不應(yīng)用來(lái)分析微核，因?yàn)檫@些細(xì)胞的微核率基線值會(huì)偏高。如果已表明受試物會(huì)影響cytoB的活性，則可對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。5.5.4.2不加入cytoB：每個(gè)濃度應(yīng)至少分析2000個(gè)細(xì)胞（每份培養(yǎng)物至少1000個(gè)細(xì)胞，每個(gè)濃度兩份培養(yǎng)物7DB31/T×××-20××記錄微核數(shù)并計(jì)算細(xì)胞微核率。如果只用一份培養(yǎng)物，則每個(gè)濃度應(yīng)至少分析2000個(gè)細(xì)胞。%細(xì)胞微核率=含微胞數(shù)×1005.5.5判斷標(biāo)準(zhǔn)5.5.5.1雙核細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)一個(gè)細(xì)胞有兩個(gè)大小基本相等的主核；(2)兩個(gè)主核之間可以有細(xì)的核物質(zhì)相連；(3)兩個(gè)主核之間可以有接觸或輕微重疊。5.5.5.2微核的判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)直徑為主核的1/16-1/3；(2)沒(méi)有光的折射；(3)與主核之間沒(méi)有核物質(zhì)相連；(4)可以和主核有邊界的重疊，但能看清各自的核膜；(5)一個(gè)細(xì)胞中有多個(gè)微核的按一個(gè)計(jì)。6數(shù)據(jù)處理及結(jié)果評(píng)價(jià)6.1數(shù)據(jù)處理計(jì)算RICC、RPD、PI、RI、CBPI值，利用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)比較受試物各劑量組與陰性（溶劑）對(duì)照組的微核率。6.2結(jié)果評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如果受試物各劑量組與陰性（溶劑）對(duì)照組相比，細(xì)胞微核率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異并且有劑量-反應(yīng)關(guān)系；或某一劑量的細(xì)胞微核率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異并且有可重復(fù)性的，可判為陽(yáng)性。體外微核試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果表明受試物可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體斷裂和/或丟失。陰性結(jié)果則表明在所檢測(cè)的條件下，受試物不會(huì)引起所培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體斷裂和/或丟失。7試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：——受試物名稱(chēng)、與試驗(yàn)操作相關(guān)的理化性狀、溶劑選擇依據(jù)、受試物的溶解性、受試物的配制方法；——細(xì)胞種類(lèi)及來(lái)源、培養(yǎng)條件；——試驗(yàn)條件和方法：1）代謝活化系統(tǒng)：制備S9時(shí)所用的誘導(dǎo)劑、動(dòng)物品種和來(lái)源、S9混合物的組成；2）對(duì)照物：陽(yáng)性對(duì)照物名稱(chēng)及濃度、陰性（溶劑）對(duì)照物名稱(chēng)及濃度；3）培養(yǎng)液：所用培養(yǎng)液名稱(chēng)、血清類(lèi)別及使用濃度；4）接種時(shí)的細(xì)胞密度以及所用培養(yǎng)瓶（皿）的規(guī)格；8DB31/T×××-20××5）使用胞質(zhì)分裂阻斷法還是不使用胞質(zhì)分裂阻斷法6）細(xì)胞毒性的測(cè)量方法；7）