實驗十二金黃色葡萄球菌(共40張課件)

二、實驗原理金黃色葡萄球菌屬于微球菌科葡萄球菌屬，可產(chǎn)生腸毒素，人誤食了含有毒素的食品，就會發(fā)生食品中毒，因此，由該菌引起的中毒為毒素型食物中毒。生化特性典型的金葡菌呈球形，大小。致病性菌較非致病性菌小。在液體培養(yǎng)基中生長，常呈雙球菌或短鏈狀排列。本菌無鞭毛及芽孢，一般不形成莢膜。革蘭氏染色陽性。金葡菌耐鹽性強(qiáng)，最適宜生長的鹽濃度為5%～7.5%,可利用此特性對金葡菌增菌，抑制雜菌。可產(chǎn)生溶血素，在血平板生生長菌落周圍有透明溶血環(huán)?？僧a(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵磷脂，產(chǎn)生甘油脂和可溶性磷酸膽堿。致病性金葡菌可產(chǎn)生血漿凝固酶。金葡菌鏡下特征操作流程檢樣25g(mL)+稀釋液225mL，均質(zhì)血漿凝固酶試驗7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯）BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂斜面Baird-Parker平板，血平板涂片染色36℃±1℃，18h~24h結(jié)果報告36℃±1℃B-P平板18h~24h或45h~48h觀察溶血血平板18h~24h菌落特征Baird-Parker平板：呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。直徑2mm~3mm。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。BP培養(yǎng)基中含有卵黃亞碲酸鉀，能抑制大多數(shù)細(xì)菌繁殖，并能促進(jìn)金葡生長產(chǎn)生黑色和暈圈。丙酮酸鈉和甘氨酸也能促進(jìn)金葡生長Baird-Parker平板典型菌落特征：黑色,有光澤,突起菌落并伴有透明圈，通常外層有清晰圈血平板：菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。血平板血漿凝固酶試驗吸取新鮮兔血漿(凍干血漿配制于小試管中,加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌BHI肉湯培養(yǎng)物－0.3mL,震蕩搖勻,置36℃溫箱或水浴內(nèi),每半小時觀察一次,觀察6小時,如呈現(xiàn)凝塊,凝固體積大于原體積的一半,為陽性結(jié)果.同時以已知陽性和陰性葡萄球菌菌株及BHI肉湯作為對照.結(jié)果可疑:挑取營養(yǎng)瓊脂斜面的菌落到5mlBHI36℃培養(yǎng)18—48h形態(tài)符合，血漿凝固酶陽性的為金黃色葡萄球菌結(jié)果報告：未檢出/25g(mL)三、實驗器材2設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、

恒溫水浴箱、

天平、

均質(zhì)器、

振蕩器、無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭、

無菌錐形瓶：容量100mL、500mL、

無菌培養(yǎng)皿、

注射器：0.5mL、pH計或pH比色管或精密pH試紙。3培養(yǎng)基和試劑3.110%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯：見附錄A中。3.27.5%氯化鈉肉湯：見附錄A中。3.3血瓊脂平板：見附錄A中。3.4Baird-Parker瓊脂平板：見附錄A中。3.5腦心浸出液肉湯(BHI)：見附錄A中。3.6兔血漿：見附錄A中。3.7稀釋液：磷酸鹽緩沖液：見附錄A中。3.8營養(yǎng)瓊脂小斜面：見附錄A中。3.9革蘭氏染色液：見附錄A中。3.10無菌生理鹽水：見附錄A中。四、實驗內(nèi)容及操作金黃色葡萄球菌定性檢驗程序見圖5.1樣品的處理稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。公式一：T=AB/Cd7稀釋液：磷酸鹽緩沖液：見附錄A中。從典型菌落中至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌菌落接種到BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h。B-P平板18h~24h或45h~48h也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗。用于做血漿凝固酶的菌落數(shù)取新鮮配置兔血漿0.根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液接種到10%NaCl胰蛋白胨大豆肉湯管，每個稀釋度接種3管，將上述接種物36℃±1℃培養(yǎng)，45h～48h。A2B2/C2=17×4÷5=14Baird-Parker平板Baird-Parker平板，血平板選擇3個連續(xù)的適宜濃度的樣品勻液，接種BP平板Baird-Parker平板致病性金葡菌可產(chǎn)生血漿凝固酶。5.2增菌和分離培養(yǎng)將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴(yán)重時在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。5.3鑒定染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5μm～1μm。血漿凝固酶試驗：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36±1℃℃培養(yǎng)18h～24h。取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36±1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36±1℃℃培養(yǎng)18h～48h，重復(fù)試驗。金黃色葡萄球菌計數(shù)第二法BP平板計數(shù)(AOACISO)金葡含量較高的食品第三法MPN計數(shù)金葡含量較低而雜菌含量較高

BP平板計數(shù)方法

樣品稀釋及樣品接種根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液以、、接種量分別加入三塊Baird－Parker平板，然后用無菌L棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。Baird－Parker平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。BP平板計數(shù)方法——培養(yǎng)涂布后，將平板靜置10分鐘，如樣液不易吸收，可將平板放在36℃±1℃孵育1h；等樣液吸收后反轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，36℃±1℃培養(yǎng)，45h～48h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。形態(tài)符合，血漿凝固酶陽性的為金黃色葡萄球菌T=65×4÷5÷0.可產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵磷脂，產(chǎn)生甘油脂和可溶性磷酸膽堿。選擇3個連續(xù)的適宜濃度的樣品勻液，接種BP平板7稀釋液：磷酸鹽緩沖液：見附錄A中。用于做血漿凝固酶的菌落數(shù)致病性金葡菌可產(chǎn)生血漿凝固酶。5mL、pH計或pH比色管或精密pH試紙。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌菌株及BHI肉湯作為對照.選擇菌落數(shù)在20cfu～200cfu之間平板上的典型菌落計數(shù)吸取新鮮兔血漿(凍干血漿配制于小試管中,加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌BHI肉湯培養(yǎng)物－0.第二法BP平板計數(shù)(AOACISO)金葡含量較高的食品取新鮮配置兔血漿0.3mL，振蕩搖勻，置36±1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。典型菌落計數(shù)和確認(rèn)金黃色葡萄球菌在Baird－Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。典型菌落計數(shù)和確認(rèn)選擇菌落數(shù)在20cfu～200cfu之間平板上的典型菌落計數(shù)最低稀釋度平板的菌落小于20cfu，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落某一倍稀釋度平板的菌落大于200cfu且有典型菌落，但上一倍稀釋度平板上沒有典型菌落，計數(shù)該級稀釋度平板上的典型菌落；典型菌落計數(shù)和確認(rèn)某一倍稀釋度平板的菌落大于200cfu且有典型菌落，且上一倍稀釋度平板上有典型菌落，其平板上的菌落數(shù)不在20cfu～200cfu之間，計數(shù)該級稀釋度平板上的典型菌落；以上按公式一計算。平板菌落數(shù)均在20cfu～200cfu之間，按公式二計算。從典型菌落中任選五個菌落（小于五個全選），分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h。典型菌落計數(shù)和確認(rèn)公式一：T=AB/CdT----樣品中金黃色葡萄球菌落數(shù)A—某一稀釋度典型菌落的總數(shù)B

—某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)d—某一稀釋度C—某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗的菌落數(shù)樣品稀釋度10-110-2典型菌落數(shù)66，646，6用于做血漿凝固酶的菌落數(shù)55血漿凝固酶陽性菌落數(shù)44T=AB/CdT=65×4÷5÷0.1=520典型菌落計數(shù)和確認(rèn)公式二N—樣品中金黃色葡萄球菌落數(shù)A1-第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）典型菌落總數(shù)A2--第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）典型菌落總數(shù)B1--第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)B2--第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)

C1--第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶試驗的菌落數(shù)C2--第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶試驗的菌落數(shù)d—

稀釋因子（第一稀釋度）—計算系數(shù)樣品稀釋度10-110-2典型菌落數(shù)150，16018，16用于做血漿凝固酶的菌落數(shù)55血漿凝固酶陽性菌落數(shù)34公式二A1B1/C1=155×3÷5=93A2B2/C2=17×4÷5=14T=(93+14)/1.1d=127÷1.1÷0.1=970結(jié)果報告單位:cfu/g或cfu/mL如T值為0，報告＜1×dcfu/mL（g）。

檢樣檢樣25g(mL)+225ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)。10倍系列稀釋選擇3個連續(xù)的適宜濃度的樣品勻液，接種BP平板計數(shù)及血漿凝固酶試驗報告

36±1℃

18～24h

金黃色葡萄球菌MPN計數(shù)樣品稀釋接種和培養(yǎng)根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液接種到10%NaCl胰蛋白胨大豆肉湯管，每個稀釋度接種3管，將上述接