《化妝品緊致功效體外測(cè)試方法 斑馬魚(yú)I型膠原蛋白和彈性蛋白基因測(cè)試》（征求意見(jiàn)稿）

SN/T××××—200×化妝品緊致功效體外測(cè)試方法斑馬魚(yú)Ⅰ型膠原蛋白和彈性蛋白基因測(cè)試范圍本文件描述了化妝品緊致功效的體外測(cè)試方法-斑馬魚(yú)Ⅰ型膠原蛋白和彈性蛋白基因表達(dá)測(cè)試方法。本文件適用于通過(guò)促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白和/或彈性蛋白再生而達(dá)到緊致效果的化妝品功效評(píng)價(jià)?；瘖y品原料的緊致功效測(cè)試可參考本文件。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和測(cè)試方法GB/T39649實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)魚(yú)質(zhì)量控制DB32/T3979實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)飼育技術(shù)條件T/OTOP1038斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)技術(shù)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義?；驹砭o致是指有助于保持皮膚的緊實(shí)度、彈性。在日常生活中，日照、化合物刺激等多種外部原因加上人體自身的內(nèi)部衰老，導(dǎo)致皮膚中膠原蛋白和彈性蛋白等皮膚基質(zhì)損傷流失，從而失去彈性。膠原蛋白是人體細(xì)胞外基質(zhì)中含量最高的蛋白，其中I型膠原蛋白是皮膚中最豐富的蛋白質(zhì)，約占成人皮膚膠原蛋白總量的85%，其含量決定了皮膚的密實(shí)度。彈性蛋白是人體皮膚中一種讓體內(nèi)許多組織在拉伸和收縮后維持原有形狀，讓皮膚在被擠壓后恢復(fù)到本來(lái)形狀的蛋白質(zhì)，對(duì)維持皮膚彈性起著重要作用。斑馬魚(yú)皮膚和人體皮膚相比，除表皮為分化了的表皮細(xì)胞和黏液層而非角質(zhì)層外，其余結(jié)構(gòu)和人體皮膚高度相似。斑馬魚(yú)的I型膠原蛋白分布與人體相同，I型膠原蛋白和彈性蛋白都顯示出與人類的高度保守性，兩者的內(nèi)源基因表達(dá)水平都在受精后4天內(nèi)一直升高，然后下降,6天至8天時(shí)相對(duì)平穩(wěn)。本方法應(yīng)用6天大的斑馬魚(yú)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)試受試物是否促進(jìn)斑馬魚(yú)I型膠原蛋白基因（col1a1a，col1a1b和col1a2）和/或彈性蛋白基因（elna）的表達(dá)，評(píng)價(jià)受試物促進(jìn)I型膠原蛋白和/或彈性蛋白再生以增加皮膚緊實(shí)度和/或彈性的緊致功效。儀器和設(shè)備5.1分析天平：精度0.1mg。5.224孔板：玻璃或聚苯乙烯材質(zhì)。5.3生化培養(yǎng)箱：精度±1℃。5.4微量勻質(zhì)機(jī)。5.5高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速>17,000×g。5.6超微量紫外分光光度計(jì)：波長(zhǎng)范圍包含230nm，260nm和280nm。5.7PCR擴(kuò)增儀。5.8微孔板離心機(jī)。5.9qPCR儀。5.10其他常規(guī)儀器和設(shè)備：旋渦混合儀、移液器、低溫冰箱、超低溫冰箱。試劑及其制備6.1水：符合GB/T6682規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室用水。6.2無(wú)DNase/RNase超純水：建議采用商業(yè)制備的水。6.3冰。6.4助溶劑：甲醇、二甲基亞砜，分析純。6.5斑馬魚(yú)培養(yǎng)液：適合斑馬魚(yú)養(yǎng)殖的培養(yǎng)液，配置方法可參見(jiàn)附錄A。6.6乙?；?8溶液：用分析天平稱取8.0mg乙?；?8（純度≥98%）溶于10.0mL斑馬魚(yú)培養(yǎng)液中配制0.8mg/mL的乙?；?8溶液，使用前新鮮配制。6.7磷酸鹽緩沖液（PBS）：含1.54mmol/L磷酸二氫鉀、155.17mmol/L氯化鈉和2.71mmol/L磷酸氫鈉，pH7.2的溶液，建議采用商業(yè)10XPBS溶液。6.8RNAlater溶液：建議采用商業(yè)試劑。6.9mRNA提取試劑：建議采用商業(yè)試劑，如TRIzol試劑。6.10三氯甲烷：分析純級(jí)別。6.11異丙醇：分析純級(jí)別，（-20±2）℃凍存。6.1275%乙醇：用移液器取37.5mL無(wú)水乙醇溶于12.5mL無(wú)DNase/RNase超純水，（-20±2）℃凍存。6.13cDNA合成試劑：含gDNAEraser的PrimerScriptRT試劑盒，建議采用商業(yè)試劑盒。6.14qPCR反應(yīng)試劑：建議采用和實(shí)時(shí)PCR儀信號(hào)檢測(cè)相匹配商業(yè)試劑盒。6.15qPCR反應(yīng)板及相應(yīng)光學(xué)密封膜：一般用96孔板或384孔板，孔板選擇需和對(duì)應(yīng)的熒光qPCR儀及密封膜相匹配。6.16基因引物信息：基因引物信息見(jiàn)表1。表1基因引物信息表基因引物序列管家基因β-actin上游引物GCTGACAGGATGCAGAAGGA下游引物TAGAAGCATTTGCGGTGGACI型膠原蛋白基因col1a1a上游引物TAGCCCCTATGGACGTTGGT下游引物CGCAGGTCTAAGCAAGTGGAcol1a1b上游引物TGGCATGACCGGCCCTATTG下游引物CTCTCCTTTAGCACCAGGCTGTcol1a12上游引物GAGGCCAGCCTGGTAACATT下游引物GTTACCATCAGGACCAGGGC彈性蛋白基因elna上游引物AAAACCAGGTTACGGCTCTGT下游引物TCCTCCTGGATAAGCTCCGTATC受試生物準(zhǔn)備斑馬魚(yú)品系選擇參考GB/T39649，飼養(yǎng)環(huán)境參考T/OTOP1038，斑馬魚(yú)魚(yú)卵采集及準(zhǔn)備參考DB32/T3979。挑選健康的受精后（144±2）h斑馬魚(yú)進(jìn)行試驗(yàn)。受試物準(zhǔn)備水溶性受試物，用斑馬魚(yú)培養(yǎng)液直接將受試物溶解，配制成測(cè)試溶液。非水溶性受試物，可選用甲醇、二甲基亞砜等助溶劑溶解，然后用斑馬魚(yú)培養(yǎng)液稀釋，配制成所需濃度的測(cè)試溶液。測(cè)試溶液中助溶劑濃度不要超過(guò)0.1%（v/v）。試驗(yàn)方法9.1試驗(yàn)流程試驗(yàn)流程見(jiàn)附錄B。9.2試驗(yàn)分組需設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和受試物組。如有用助溶劑，則每組中助溶劑濃度應(yīng)一致。9.2.1空白對(duì)照組隨機(jī)挑選36尾斑馬魚(yú)平均分配到24孔板的3個(gè)孔中，每孔含12尾斑馬魚(yú)和2.5mL斑馬魚(yú)培養(yǎng)液。9.2.2陽(yáng)性對(duì)照組隨機(jī)挑選36尾斑馬魚(yú)平均分配到24孔板的3個(gè)孔中，每孔含12尾斑馬魚(yú)和2.5mL含0.8mg/mL乙?；?8的斑馬魚(yú)培養(yǎng)液。9.2.3受試物組隨機(jī)挑選36尾斑馬魚(yú)，平均分配到24孔板的3個(gè)孔中，每孔含12尾斑馬魚(yú)和2.5mL含受試物的斑馬魚(yú)培養(yǎng)液。9.3暴露條件放置于（28±1）℃恒溫箱中培養(yǎng)（24±1）h。暴露結(jié)束時(shí)記錄每孔斑馬魚(yú)存活情況。收集存活率≥90%的孔中斑馬魚(yú)，除去溶液，加入0.5mLRNAlater溶液后于（-20±2）℃低溫冰箱凍存。9.4總RNA提取9.4.1TRIzol法除去RNAlater溶液，用PBS溶液沖洗斑馬魚(yú)3次。置于冰?。ê罅勘乃。?，除去PBS溶液，加入500μL的TRIzol試劑。用微量勻質(zhì)機(jī)對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行均質(zhì)化處理，置于冰浴中10min。加入100μL三氯甲烷，旋渦混合儀中渦旋1min后置于冰浴中5min。于4℃的高速冷凍離心機(jī)中以17,000×g離心20min，轉(zhuǎn)移上層溶液至1.5mL離心管中，加入250μL異丙醇，旋渦混合儀中渦旋1min，置于冰浴中10min后于4℃的高速冷凍離心機(jī)中以17,000×g離心20min。除去上清液，加入500μL約4℃的75%乙醇，旋渦混合儀中渦旋1min后于4℃以17,000×g離心5min，重復(fù)此步驟3次。除去乙醇，將樣本于4℃的高速冷凍離心機(jī)中以17,000×g離心5min，打開(kāi)蓋子風(fēng)干樣品10min。加入10μL無(wú)DNase/RNase超純水，于（55±1）℃PCR儀中加熱15min。應(yīng)用超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA濃度進(jìn)行測(cè)定，要求總RNA樣本在260nm、280nm和230nm處的吸光度，A260/A280應(yīng)>1.8，A260/A230應(yīng)在2.0-2.2之間。提取的總RNA樣本需在（-80±2）℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，最好總RNA提取當(dāng)日進(jìn)行cDNA合成。9.4.2商業(yè)試劑盒法可采用其他商業(yè)試劑盒提取總RNA，具體操作按商業(yè)試劑盒指引進(jìn)行。9.5cDNA合成根據(jù)cDNA合成試劑盒指引，取1000ng的總RNA樣本，和gDNAEraser溶液混合成10μL溶液，于PCR儀中42℃處理5min、然后加入10μL反轉(zhuǎn)錄酶及其緩沖溶液混合液，于PCR儀中37℃反應(yīng)15min、85℃處理5s后將反應(yīng)溫度降至4℃。cDNA樣本需（-20±1）℃低溫冰箱中儲(chǔ)存。9.6qPCR檢測(cè)9.6.1嵌合熒光法每個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)都需設(shè)置獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系。每個(gè)cDNA樣本的每個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量的反應(yīng)體系需設(shè)立至少3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)的PCR反應(yīng)液由下列組份配置（反應(yīng)液配置在冰上進(jìn)行）。反應(yīng)體系應(yīng)設(shè)置在（10-25）μL范圍內(nèi)。反應(yīng)體系可參見(jiàn)表2。表2熒光PCR反應(yīng)體系第一步:試劑名稱加入量PremixExTaq12.5μLROX染料（50x）0.5μL無(wú)RNA/DNA酶的超純水6.75μLcDNA模板（<100ng）0.25μL總量20μL第二步:試劑名稱加入量上游引物（10μM）0.25μL下游引物（10μM）0.25μL無(wú)RNA/DNA酶的超純水4.5μL總量5μL將20μL第一步的混合液和5μL第二步的混合液混勻后，加入到96或384孔qPCR反應(yīng)板中，用光學(xué)膠膜密封孔板，于4℃微孔板離心機(jī)中以1,000r/min離心5min，將孔板放入熒光定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。qPCR擴(kuò)增條件會(huì)因采用不同qPCR儀而有所不同，可參見(jiàn)表3程序進(jìn)行。表3擴(kuò)增程序熒光PCR溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)95℃30s195℃5s4060℃30s熔解曲線溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)95℃15s160℃1min95℃15s9.6.2商業(yè)試劑盒法也可采用其他商業(yè)試劑盒進(jìn)行qPCR檢測(cè)，具體操作按商業(yè)試劑盒指引進(jìn)行。9.7結(jié)果分析9.7.1基因相對(duì)表達(dá)促進(jìn)倍數(shù)的計(jì)算收集qPCR測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)。Ct（基因熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）作為擴(kuò)增結(jié)果，以β-actin基因擴(kuò)增量作為管家基因，計(jì)算每個(gè)基因（col1a1a,col1a1b,col1a2和Elna）的相對(duì)表達(dá)量。?Ct=Ct目的基因??Ct=ΔCt基因相對(duì)表達(dá)量=2???基因表達(dá)促進(jìn)倍數(shù)=2式中：?Ct：目的基因的循環(huán)數(shù)與管家基因的循環(huán)數(shù)之差；Ct目的基因：目的基因Ctβ???Ct：空白對(duì)照組?Ct平均值和受試物組?CtΔCt空白對(duì)照組：空白對(duì)照組ΔCt受試物：受試物組2???Ct空白對(duì)照組：空白對(duì)照2???Ct受試物組：9.7.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算各測(cè)試組的平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)受試物組和空白對(duì)照組間目的基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行雙尾T檢驗(yàn)，取得P值。P<0.05表示有顯著性差異。試驗(yàn)有效性驗(yàn)證10.1各測(cè)試組暴露完成后存活率不低于90%，否則對(duì)應(yīng)測(cè)試組結(jié)果無(wú)效。10.2每批次測(cè)試須設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，要求每批次測(cè)試中陽(yáng)性對(duì)照組最少2個(gè)I型膠原蛋白基因和彈性蛋白基因相對(duì)表達(dá)量都顯著（P<0.05）高于空白對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)論如受試物能顯著促進(jìn)至少2個(gè)I型膠原蛋白基因和/或彈性蛋白基因表達(dá)，即基因表達(dá)促進(jìn)倍數(shù)為正數(shù)且基因相對(duì)表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），則判定受試物具有促進(jìn)I型膠原蛋白基因和/或彈性蛋白基因表達(dá)的效果，可作為緊致功效的定性依據(jù)。試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告至少應(yīng)包括下列內(nèi)容：a)委托企業(yè)名稱、地址等相關(guān)信息；b)功效評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)名稱、地址等相關(guān)信息；c)識(shí)別被測(cè)樣品所需全部信息（包括試驗(yàn)樣品的名稱、形狀、數(shù)量及規(guī)格、生產(chǎn)日期和保質(zhì)期或生產(chǎn)批號(hào)和限期使用日期、儲(chǔ)存條件等）；d)材料和方法：用到的受試生物和器材、方案概要、采用的統(tǒng)計(jì)方法等；e)試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果確定試驗(yàn)產(chǎn)品是否具有緊致功效；f)報(bào)告的日期；g)技術(shù)負(fù)責(zé)人簽字及日期；H)出具報(bào)告企業(yè)蓋章。附錄A（規(guī)范性）斑馬魚(yú)培養(yǎng)液配制方法A.1表A.1規(guī)定了3種常用斑馬魚(yú)培養(yǎng)液配制方法。表A.13種常用斑馬魚(yú)培養(yǎng)液配置方法斑馬魚(yú)培養(yǎng)液配制方法斑馬魚(yú)培養(yǎng)液1稱取2940mg無(wú)水氯化鈣，1233mg七水硫酸鎂，630mg碳酸氫鈉，55mg氯化鉀溶于10L水配制而成。pH值6.5～8.5?；瘜W(xué)品均為分析純級(jí)別。斑馬魚(yú)培養(yǎng)液2稱取17.2g氯化鈉，0.76g氯化鉀，2.9g氯化鈣和4.9g硫酸鎂溶于水中定容至1000mL儲(chǔ)備液。取16.67mL儲(chǔ)備液用水稀釋至1000mL而成?；瘜W(xué)品均為分析純級(jí)別。斑馬魚(yú)培養(yǎng)液3稱取7.000g氯化鈉，0.400g碳酸氫鈉，0.100g氯化鉀，0.235g氯化鈣溶于2L水配制而成，化學(xué)品均為分析純級(jí)別。附錄B（規(guī)范性）試驗(yàn)流程圖B.1圖B.1規(guī)定了試驗(yàn)流程。圖B.1試驗(yàn)流程圖參考文獻(xiàn)[1]國(guó)家藥監(jiān)局關(guān)于發(fā)布《化妝品分類規(guī)則和分類目錄》的公告（2021年第49號(hào)）[2]國(guó)家藥監(jiān)局關(guān)于發(fā)布《化妝品功效宣稱評(píng)價(jià)規(guī)范》的公告（2021年第50號(hào)）[3]ShinJW,KwonSH,ChoiJY,etal.Molecularmechanismsofdermalagingandanti-agingapproaches[J].IntJMolSci,2019,20(9):2126.[4]GistelinckC,GioiaR,GagliardiA,etal.ZebrafishcollagentypeI:Molecularandbiochemicalcharacterizationofthemajorstructuralprotein