DB21T 3095-2018 犬非結(jié)核細(xì)菌性肺炎診斷技術(shù)規(guī)范　　

DB21ThetechnicalSpecificationfordiagnosticbacterialofNon-tuberculosismycobacteriapneumoniaeforcanine遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 13.2非結(jié)核細(xì)菌性肺炎bacterialofNon-tuberculosismycobacteria 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：錦州醫(yī)科大學(xué)、鞍山動(dòng)物檢疫站、1犬非結(jié)核細(xì)菌性肺炎診斷技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)適用于我省動(dòng)物診療單位及獸醫(yī)工作者對(duì)犬非結(jié)核細(xì)菌性肺炎GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和），），3.2非結(jié)核細(xì)菌性肺炎bacterialofNon-tuberculosismycobacteriapne包括結(jié)核分枝桿菌所致的肺結(jié)核。為了嚴(yán)格區(qū)分本標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)菌性16SrRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(zhǎng)（包含約50個(gè)功能域）等特征，所以，16SrRNA基因檢測(cè)技術(shù)2依據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀及影像學(xué)特征等作出初步診斷，確診需做病原學(xué)4.1流行病學(xué)特點(diǎn)菌性肺炎流行的區(qū)域；發(fā)病率高，但致死率低，主要為4月齡以內(nèi)的幼犬發(fā)病，成年犬少見發(fā)?。话l(fā)病4.2臨床癥狀診斷4.2.1呼吸系統(tǒng)癥狀4.2.2發(fā)熱及相關(guān)癥狀4.2.3其它方面癥狀4.3影像學(xué)特征胸部X線檢查顯示肺紋理增粗，片狀、斑片狀、大片狀陰影和實(shí)變影，可伴有支氣管充氣征、液氣4.4外周血檢查特征采集犬前肢頭靜脈（前臂頭靜脈）或后肢隱靜脈或頸靜脈血液樣本1.0ml，采用血液分析儀或人工樣檢測(cè)，儀器自動(dòng)分析、打印結(jié)果。人工計(jì)數(shù)方法取1滴外周血，滴于潔凈無油脂的玻片制取血涂片，細(xì)菌性肺炎白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，其中中性粒細(xì)胞比例顯著升高，并有核左移現(xiàn)4.5病原學(xué)檢測(cè)4.5.1細(xì)菌分離培養(yǎng)和涂片鏡檢無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后再劃線接種于血液瓊脂平板和胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察有無菌落生長(zhǎng)；4.5.2生化試驗(yàn)3挑取單個(gè)分離菌接種于細(xì)菌微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察、記錄生化反應(yīng)結(jié)4.5.3致病性檢驗(yàn)腹腔注射菌液0.25ml(2.1×108CFU/ml)菌液；另取5只體重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量滅菌腦心浸液。小鼠攻毒后連續(xù)7天觀察臨床表現(xiàn)及死亡情況。取發(fā)病死亡小鼠的肺、肝接種血液瓊脂平板等4.5.4分子生物學(xué)鑒定27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCT按照通用型柱式基因組提取試劑盒說明書提取對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，回收產(chǎn)物作為測(cè)序模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序要求對(duì)所測(cè)出的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，即登陸NCBI網(wǎng)站（htt注：M．DL2000DNAMarker;1.陽性對(duì)照；2-6.陽性擴(kuò)增產(chǎn)物；N.陰45.1初步診斷根據(jù)流行病學(xué)特征和典型臨床癥狀，結(jié)合外周血、X線影像學(xué)特征，可作出初步5.2確診5細(xì)菌性肺炎主要致病菌分離鑒定具體方法和無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后再劃線接種于血液瓊脂平板和腦心浸出液培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察。在血液瓊脂平板上應(yīng)生長(zhǎng)6V-P試驗(yàn) + --+++-+--+ + ++ ++2.1應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌，首先合成用于擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因序列的通用引27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCTC膠電泳檢測(cè)，得到目的片段后，按照《瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒》（OMEGA）的說注：M．DL2000DNAMarker;1.陽性對(duì)照；2-6.陽性擴(kuò)增產(chǎn)物；N.陰7肉湯純培養(yǎng)物腹腔注射實(shí)驗(yàn)組小白鼠，每只注射0.2ml（4×108CFU/ml）對(duì)照組每只小白鼠腹腔注射0.2ml無菌肉湯。注射后小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況，并對(duì)死亡小鼠的心血、腦、肝臟、脾臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。觀察到試驗(yàn)組小鼠注射24h后應(yīng)表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，毛皮粗糙豎起，呼吸急促、采食減少等現(xiàn)象；對(duì)照組小鼠無此現(xiàn)象。試驗(yàn)組小鼠72h后全部死亡。將死亡小鼠剖檢，將臟器分G+球菌，圓形或卵圓形，直徑約1μm，呈葡萄串狀排列，無鞭毛、無芽孢、無莢膜。未見有色素沉著，菌落周圍有明顯的β-溶血環(huán)。菌落形態(tài)上形成1mm左右、凸起、黃色菌落，有金黃色色素產(chǎn)生，菌落周圍的培養(yǎng)基由紅色挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)1將純培養(yǎng)菌分別接種于H2S反應(yīng)管和葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、果8應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌的通用引物、方法條件同鏈球菌；PCR產(chǎn)物測(cè)序與DNA序注：M．DM2000;1、3陽性樣本；2.陽性對(duì)照（CQHC4CSA00）；漿的試管中，37℃培養(yǎng)，每0.5h觀察1次，觀察6h判定結(jié)果；同時(shí)用已知的血漿凝固酶陽性和陰性的取清潔級(jí)小鼠5只，分離菌株24h肉湯培養(yǎng)液（1.5×108CFU/ml經(jīng)不同途徑接種：下注射菌液1.0ml；1只小鼠腹腔注射菌液1.0ml；2只小鼠分別從靜脈注射菌液0.5ml；1只小鼠由靜脈注射滅菌生理鹽水1ml作為空白對(duì)照。分別隔離觀察，皮下注射菌液小鼠24h后注射部位皮膚應(yīng)發(fā)生潰無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后再劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察。在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上生長(zhǎng)出圓9應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌的通用引物、方法條件同鏈球菌；PCR產(chǎn)因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果顯示該菌株與序列(GenBank序列號(hào)：AP014582.1)同源性為96%以上，則將分離菌的純培養(yǎng)物接種于腦心浸液中37℃培養(yǎng)18~24h，并計(jì)算活菌數(shù)。選取5只健康小鼠，腹腔注射菌液0.25ml（2.1×108CFU/ml）菌液；另取5只體重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量滅菌飲欲廢絕，被毛雜亂等臨床癥狀，在48h內(nèi)全部死亡。對(duì)照組小鼠在觀察期內(nèi)，全部健康存活。死亡小例白細(xì)胞水平輕度升高；血清C反應(yīng)蛋白（CRP）輕度升高；X線檢查可見氣管內(nèi)影像增強(qiáng)，肺部影像肺部聽診和血常規(guī)檢查無明顯變化；血清C反應(yīng)蛋白（CRP）水平輕度升高；X線檢查可見氣管內(nèi)影像通過病原分離鑒定和分子生物學(xué)檢測(cè)病毒核酸可區(qū)分其它本病由支原體（Mycoplasma）引起，潛伏期較長(zhǎng)?；既w況良好時(shí)，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。發(fā)本病由衣原體（Chlamydia）引起，潛伏期較長(zhǎng)。患犬體況良好時(shí)，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。發(fā)病以凌晨時(shí)咳嗽最為重劇。經(jīng)治療后，咳嗽還可持續(xù)液，顯微鏡檢查可見霉菌的菌絲。死亡患犬剖檢可見肺臟上有大小不一的結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍有結(jié)締組織犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（Caninedistempervirus）引起的一種高度泌物，打噴嚏，有腹瀉。在以后2～14天內(nèi)再次出現(xiàn)體溫升高，咳嗽，有膿性鼻涕。同時(shí)繼發(fā)