DB21T 3095-2018 犬非結(jié)核細菌性肺炎診斷技術(shù)規(guī)范　　

DB21ThetechnicalSpecificationfordiagnosticbacterialofNon-tuberculosismycobacteriapneumoniaeforcanine遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 13.2非結(jié)核細菌性肺炎bacterialofNon-tuberculosismycobacteria 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：錦州醫(yī)科大學(xué)、鞍山動物檢疫站、1犬非結(jié)核細菌性肺炎診斷技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)適用于我省動物診療單位及獸醫(yī)工作者對犬非結(jié)核細菌性肺炎GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和），），3.2非結(jié)核細菌性肺炎bacterialofNon-tuberculosismycobacteriapne包括結(jié)核分枝桿菌所致的肺結(jié)核。為了嚴(yán)格區(qū)分本標(biāo)準(zhǔn)將細菌性16SrRNA基因是細菌上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細菌的基因組的保守性和特異性以及該基因序列足夠長（包含約50個功能域）等特征，所以，16SrRNA基因檢測技術(shù)2依據(jù)流行病學(xué)特點、臨床癥狀及影像學(xué)特征等作出初步診斷，確診需做病原學(xué)4.1流行病學(xué)特點菌性肺炎流行的區(qū)域；發(fā)病率高，但致死率低，主要為4月齡以內(nèi)的幼犬發(fā)病，成年犬少見發(fā)?。话l(fā)病4.2臨床癥狀診斷4.2.1呼吸系統(tǒng)癥狀4.2.2發(fā)熱及相關(guān)癥狀4.2.3其它方面癥狀4.3影像學(xué)特征胸部X線檢查顯示肺紋理增粗，片狀、斑片狀、大片狀陰影和實變影，可伴有支氣管充氣征、液氣4.4外周血檢查特征采集犬前肢頭靜脈（前臂頭靜脈）或后肢隱靜脈或頸靜脈血液樣本1.0ml，采用血液分析儀或人工樣檢測，儀器自動分析、打印結(jié)果。人工計數(shù)方法取1滴外周血，滴于潔凈無油脂的玻片制取血涂片，細菌性肺炎白細胞計數(shù)明顯升高，其中中性粒細胞比例顯著升高，并有核左移現(xiàn)4.5病原學(xué)檢測4.5.1細菌分離培養(yǎng)和涂片鏡檢無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后再劃線接種于血液瓊脂平板和胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察有無菌落生長；4.5.2生化試驗3挑取單個分離菌接種于細菌微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察、記錄生化反應(yīng)結(jié)4.5.3致病性檢驗腹腔注射菌液0.25ml(2.1×108CFU/ml)菌液；另取5只體重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量滅菌腦心浸液。小鼠攻毒后連續(xù)7天觀察臨床表現(xiàn)及死亡情況。取發(fā)病死亡小鼠的肺、肝接種血液瓊脂平板等4.5.4分子生物學(xué)鑒定27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCT按照通用型柱式基因組提取試劑盒說明書提取對PCR擴增產(chǎn)物進行回收和純化，回收產(chǎn)物作為測序模板進行測序，測序要求對所測出的基因序列進行同源性比對分析，即登陸NCBI網(wǎng)站（htt注：M．DL2000DNAMarker;1.陽性對照；2-6.陽性擴增產(chǎn)物；N.陰45.1初步診斷根據(jù)流行病學(xué)特征和典型臨床癥狀，結(jié)合外周血、X線影像學(xué)特征，可作出初步5.2確診5細菌性肺炎主要致病菌分離鑒定具體方法和無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后再劃線接種于血液瓊脂平板和腦心浸出液培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察。在血液瓊脂平板上應(yīng)生長6V-P試驗 + --+++-+--+ + ++ ++2.1應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細菌，首先合成用于擴增細菌16SrRNA基因序列的通用引27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCTC膠電泳檢測，得到目的片段后，按照《瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒》（OMEGA）的說注：M．DL2000DNAMarker;1.陽性對照；2-6.陽性擴增產(chǎn)物；N.陰7肉湯純培養(yǎng)物腹腔注射實驗組小白鼠，每只注射0.2ml（4×108CFU/ml）對照組每只小白鼠腹腔注射0.2ml無菌肉湯。注射后小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況，并對死亡小鼠的心血、腦、肝臟、脾臟進行細菌分離鑒定。觀察到試驗組小鼠注射24h后應(yīng)表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，毛皮粗糙豎起，呼吸急促、采食減少等現(xiàn)象；對照組小鼠無此現(xiàn)象。試驗組小鼠72h后全部死亡。將死亡小鼠剖檢，將臟器分G+球菌，圓形或卵圓形，直徑約1μm，呈葡萄串狀排列，無鞭毛、無芽孢、無莢膜。未見有色素沉著，菌落周圍有明顯的β-溶血環(huán)。菌落形態(tài)上形成1mm左右、凸起、黃色菌落，有金黃色色素產(chǎn)生，菌落周圍的培養(yǎng)基由紅色挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)1將純培養(yǎng)菌分別接種于H2S反應(yīng)管和葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、果8應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細菌的通用引物、方法條件同鏈球菌；PCR產(chǎn)物測序與DNA序注：M．DM2000;1、3陽性樣本；2.陽性對照（CQHC4CSA00）；漿的試管中，37℃培養(yǎng)，每0.5h觀察1次，觀察6h判定結(jié)果；同時用已知的血漿凝固酶陽性和陰性的取清潔級小鼠5只，分離菌株24h肉湯培養(yǎng)液（1.5×108CFU/ml經(jīng)不同途徑接種：下注射菌液1.0ml；1只小鼠腹腔注射菌液1.0ml；2只小鼠分別從靜脈注射菌液0.5ml；1只小鼠由靜脈注射滅菌生理鹽水1ml作為空白對照。分別隔離觀察，皮下注射菌液小鼠24h后注射部位皮膚應(yīng)發(fā)生潰無菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后再劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察。在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上生長出圓9應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細菌的通用引物、方法條件同鏈球菌；PCR產(chǎn)因序列進行同源性比對。結(jié)果顯示該菌株與序列(GenBank序列號：AP014582.1)同源性為96%以上，則將分離菌的純培養(yǎng)物接種于腦心浸液中37℃培養(yǎng)18~24h，并計算活菌數(shù)。選取5只健康小鼠，腹腔注射菌液0.25ml（2.1×108CFU/ml）菌液；另取5只體重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量滅菌飲欲廢絕，被毛雜亂等臨床癥狀，在48h內(nèi)全部死亡。對照組小鼠在觀察期內(nèi)，全部健康存活。死亡小例白細胞水平輕度升高；血清C反應(yīng)蛋白（CRP）輕度升高；X線檢查可見氣管內(nèi)影像增強，肺部影像肺部聽診和血常規(guī)檢查無明顯變化；血清C反應(yīng)蛋白（CRP）水平輕度升高；X線檢查可見氣管內(nèi)影像通過病原分離鑒定和分子生物學(xué)檢測病毒核酸可區(qū)分其它本病由支原體（Mycoplasma）引起，潛伏期較長?；既w況良好時，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。發(fā)本病由衣原體（Chlamydia）引起，潛伏期較長?；既w況良好時，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。發(fā)病以凌晨時咳嗽最為重劇。經(jīng)治療后，咳嗽還可持續(xù)液，顯微鏡檢查可見霉菌的菌絲。死亡患犬剖檢可見肺臟上有大小不一的結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍有結(jié)締組織犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（Caninedistempervirus）引起的一種高度泌物，打噴嚏，有腹瀉。在以后2～14天內(nèi)再次出現(xiàn)體溫升高，咳嗽，有膿性鼻涕。同時繼發(fā)